El uso de la<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aparato Chandler Loop para evaluar la biocompatibilidad de los conductos sanguíneos poliméricos modificados

Resumen

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

Resumen

La reacción de cuerpo extraño se produce cuando una superficie sintética se introduce en el cuerpo. Se caracteriza por la adsorción de proteínas de la sangre y la posterior unión y activación de las plaquetas, monocitos / macrófagos de adhesión, y los eventos de señalización celular inflamatorios, dando lugar a complicaciones post-procedimiento. El Aparato Chandler Loop es un sistema experimental que permite a los investigadores estudiar las interacciones moleculares y celulares que se producen cuando grandes volúmenes de sangre son perfundidos sobre conductos poliméricos. Para ello, este aparato ha sido usado como un modelo ex vivo permite la evaluación de las propiedades anti-inflamatorias de diversas modificaciones superficie del polímero. Nuestro laboratorio ha demostrado que los conductos sanguíneos, modificados covalentemente a través de la química fotoactivación con CD47 recombinante, pueden conferir biocompatibilidad a superficies poliméricas. Al añadir CD47 a las superficies poliméricas podría ser un medio eficaz para promover la eficacia de los conductos sanguíneos poliméricos. Suein es la metodología que detalla la química de fotoactivación usado para anexar CD47 recombinante a los conductos sanguíneos poliméricos clínicamente relevantes y el uso de la Chandler Loop como modelo experimental ex vivo para examinar las interacciones de la sangre con las CD47 modificado y de control de conductos.

Introducción

Muchos procedimientos clínicos, tales como el bypass cardiopulmonar y la diálisis renal, requieren el uso de conductos de sangre poliméricos y, a menudo están asociados con complicaciones post-procedimiento ^1. Cuando perfundido con sangre, estos polímeros ilícito reacción a cuerpo extraño (FBR), que resulta en la adsorción de las proteínas y plaquetas de la sangre, la adhesión de monocitos / macrófagos, y la liberación de citoquinas pro-inflamatorias, todos los cuales contribuyen a complicaciones post-procedimiento y / o ^2,3 fallo del dispositivo. Por lo tanto, las estrategias para hacer frente a este problema siguen siendo un área importante de la investigación en curso y los biomateriales. Los investigadores han tratado de abordar este problema mediante la modificación de las superficies de contacto de la sangre con bioactivos o bioinertes moléculas ^4-6. La investigación en nuestro laboratorio se ha centrado en añadiendo CD47 recombinante (recCD47) a biomateriales poliméricos como una estrategia para mitigar el FBR y aumentar la eficacia de estos materiales. CD47 es un transmembr de expresión ubicuaane proteína con un papel conocido en la evasión inmune, conceder el carácter de "sí mismo" en las células que expresan ^7-10 y se muestra prometedor a conferir biocompatibilidad cuando anexa a superficies poliméricas ^11-13. -Señal reguladora proteína alfa (SIRPα), el receptor afín para CD47, y un miembro del motivo inhibidor basado en tirosina inmunoreceptor (ITIM) que contienen familia de proteínas transmembrana, se expresa en células de origen mieloide ^14. Anteriormente hemos demostrado que CD47, a través de la señalización celular mediada por SIRPα, abajo-regula la respuesta inmune a poliuretano (PU) y policloruro de vinilo (PVC) en in vitro, ex vivo e in vivo en modelos ^11-13.

Central con nuestras investigaciones es relativamente nueva química de fotoactivación, descrito en el presente documento, en el que los grupos tiol químicamente reactivos se añaden covalentemente a un tubo polimérico por reacción de la tubería con un polímero multifuncional (PDT-BzPh), compuesto de 2-piridilditio (PDT), la benzofenona fotoreactivo (BzPh) y una polialilamina modificado ^{carboxi-11-13.} La reducción de los grupos PDT covalentemente adjuntas con tris (2-carboxietil) fosfina clorhidrato (TCEP) ¹¹ produce una superficie tiolada que puede ser posteriormente se hace reaccionar con restos terapéuticos. Detallada en el presente documento y anteriormente ^12,13, recCD47, además modificado con la adición de un poli-lisina C-terminal cola ^12,13, se hace reaccionar con sulfosuccinimidilo-4-[N -maleimidomethyl] ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) durante 1 h para generar grupos reactivos con tiol, lo que permite una formación de enlace monosulfuro entre la tubería y recCD47 ^11. La capacidad anti-inflamatoria de las superficies funcionalizadas CD47 fue probado, ex viv o, usando el aparato de Chandler Loop con sangre humana total, que fue descrito originalmente en 1958 como un modelo in vitro de la coagulación trombótico ^15. El aparato se basa en unasistema de tubo cerrado parcialmente lleno de aire y un motor giratorio para hacer circular la sangre a través del tubo ^15. Este modelo experimental ofrece la oportunidad de examinar el efecto de la exposición sangre sobre superficies modificadas y no modificadas, así como el efecto de esas modificaciones de la superficie sobre la fisiología de las células de la sangre.

recCD47 se puede añadir a una variedad de superficies poliméricas usando esta química fotoactivación, y su capacidad antiinflamatoria se puede evaluar mediante la utilización de un modelo clínicamente relevante ex vivo imitando perfusión de la sangre sobre superficies poliméricas ^11,12. Conductos sanguíneos grado clínico modificados con recCD47 muestran significativamente menos de plaquetas y la fijación de células inflamatorias en comparación con los polímeros no modificados cuando se expone a la sangre humana en el aparato. Una descripción paso a paso de este proceso de modificación se detalla a continuación.

Protocolo

1. modificación polimérico Superficies con recCD47

NOTA:. El protocolo se resume esquemáticamente en la Figura 1 La Figura 1A ilustra la generación de superficies poliméricos reactivos con tiol Figura 1B ilustra la generación de recCD47 reactivo con tiol..

1. Día 1
   1. Preparar una solución de PDT-BzPh (1 mg / ml) y bicarbonato de potasio _(KHCO3) (0,7 mg / ml) en agua estéril. Revuelva la noche a 4 ° C (protegerlo de la luz).
2. Día 2
   1. Cortar tubo polimérico en 40 cm piezas largas (suficiente largo para caber alrededor de las ruedas giratorias).
   2. Remojar tubos en una solución acuosa al 0,1% de hexacylpyridinium durante 90 min a temperatura ambiente en un agitador o en el aparato de Chandler Loop. Enjuague los tubos con 3x de agua estéril después de la 90 min remojo.
   3. Se acidifica la solución de PDT-BzPh desde el día 1 por la adición de fosfato monobásico de potasio acuoso al 15% (KH ₂ PO _4). Añadir 50 l KH ₂ PO ₄ por ml de PDT-BzPh, formando una solución micelar nublado.
   4. Remojar los tubos en la solución PDT-BzPh acidificada durante 40 min a temperatura ambiente en un agitador o en el aparato.
   5. Enjuagar los tubos con ácido acético diluido (1: 1000) una vez.
   6. Exponer los tubos a la irradiación UV para una duración total de 60 min. Gire los tubos de ¼ de vuelta cada 15 min para irradiar toda la superficie.
   7. Remojar los tubos en una solución de 20 mg / ml de bicarbonato de potasio _(KHCO3) durante 20 min a temperatura ambiente en un agitador o en el aparato.
   8. Enjuague los tubos con 3x agua estéril y se almacena a 4 ° C en agua estéril.
3. Día 3
   1. Disolver 5 mg de sulfo-SMCC en 200 l de dimetilformamida (DMF) (Precaución: Realice en campana de extracción).
   2. Añadir 50 l de la solución de sulfo-SMCC preparado en la etapa 1 a 0,1 mg / ml de solución de poli-lisina recCD47, y se agita durante 60 min a rotemperatura om.
   3. Durante 60 minutos de agitación, desgasifique estériles tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS) y reservar.
   4. Purificar sulfo-SMCC reaccionó recCD47 usando una columna de desalación 7K peso molecular de corte de giro según las instrucciones del fabricante. Recoger el flujo a través de final (de alta calidad recCD47 reactivo con tiol) y diluir a un volumen necesario para recubrir el interior del tubo con DPBS.
   5. Enjuagar los tubos del día 2 con estéril, desgasificada DPBS 3x.
   6. Reaccionar la superficie modificada de los tubos con una solución de 20 mg / ml con tris (2-carboxietil) fosfina clorhidrato (TCEP) en DPBS desgasificó durante menos de 2 min. Enjuague los tubos con estéril desgasificado DPBS 4x.
   7. Añadir la recCD47 reaccionado-sulfo-SMCC a los tubos e incubar durante la noche a 4 ° C en un agitador o en el aparato.

2. Inmunoensayo Cuantificación de recCD47 en superficies modificadas

1. Enjuague tubos modificados para ser cuantificado a partir del día 3 ingenioh DPBS 3x. Tubos Store no utilizados para la cuantificación en DPBS a 4 ° C.
2. Utilice un punzón de biopsia de 4 mm para hacer muestras de tubos duplicados y colocar golpes de biopsia en pocillos de una placa de 96 pocillos.
3. Preparar un control negativo que consiste en un tubo de muestra sin modificar no tratadas con el anticuerpo de detección. Preparar un anticuerpo de control que consiste en un tubo de muestra sin modificar tratado con el anticuerpo de detección. Preparar las muestras de ensayo modificados de tubos tratados con el anticuerpo de detección.
4. Muestras de bloque con albúmina de suero bovino 0,4% (BSA) en DPBS durante 60 min a temperatura ambiente en un agitador.
5. Después del bloqueo, BSA aspirado y enjuague con solución salina amortiguadora tris más 1% (TBST) 3x-20 Tween, 10 min cada uno en un agitador.
6. Prepare una dilución de trabajo del anticuerpo en el 0,4% de BSA de acuerdo a la dilución recomendada por el fabricante para los inmunoensayos. Diluir CD47 humano Anticuerpo B6H12-FITC 1: 100 en 0,4% de BSA.
7. Añadir 200 l de dilución de anticuerpo a los pocillos apropiados. Incubacontroles negativos del te con 0,4% sólo BSA. Incubar a temperatura ambiente durante 60 min en un agitador (protegerlo de la luz).
8. Enjuague con TBST 3x, 10 min cada uno en un agitador. Aspirar el último aclarado TBST y añadir 200 l DPBS a pocillos de muestras de tubo.
9. Recoger el flujo a través final, que es CD47 recombinante reactivo con tiol de alta calidad y diluir a un volumen necesario para recubrir el interior de los tubos con DPBS.
10. Leer intensidad de la señal FITC utilizando un lector de microplacas con FITC de excitación (485 nm) y emisión (538 nm) ajustes.
11. Calcular recCD47 unido a la superficie polimérica basada en valores estándar, lo que representa para auto-fluorescencia y la unión no específica de la muestra de control del anticuerpo.

Protocolo Aparato 3. Chandler Loop

Busque la Junta de Revisión Institucional (IRB) la aprobación del protocolo de extracción de sangre e informado consentimiento papeleo antes del inicio de la recolección de muestras de sangre humana. Obtener informaciónrmado el consentimiento de un donante de sangre humana.
NOTA: Un diagrama que representa el aparato se muestra en la Figura 2.

1. Llene la bañera con agua destilada hasta aproximadamente media de las ruedas de diámetro están sumergidos. Agregar suficiente cloro para el baño de agua para hacer una solución de lejía al 10%. Establecer baño de agua a 37 ° C y permitir que la temperatura se equilibre.
2. Reunir adaptadores de metal (que se muestran en la Figura 1B), sin modificar la tubería y la tubería modificado, y montar alrededor de las ruedas del aparato, como se muestra en la Figura 1C. Asegúrese de que la tubería se ajusta apretadamente alrededor de la rueda con el adaptador de metal en su lugar.
3. Obtener 30 ml de muestra de sangre usando un protocolo aprobado por el IRB, en un vial pre-llenado con 2 ml de citrato u otro anticoagulante, y mezclar por inversión para prevenir la coagulación una vez que la muestra se ha recogido.
4. Añadir aproximadamente 10 ml de sangre a cada tubo usando la válvula de metal y la jeringa, dejando un poco de aire en el tubo. Asegure la tapa de la válvula y la rOtate durante 3 horas.
5. Drenar la sangre en un vaso de residuos tratados con una solución de lejía al 10% (o como lo requiere la política institucional).
6. Enjuague suavemente el interior de tubos con DPBS para eliminar todos los rastros de sangre. Recoger el flujo a través en el vaso de precipitados de residuos. Deshágase de la sangre, de acuerdo con la política institucional.
7. Desinfectar el aparato y cualquier contacto con la sangre superficies con una solución de lejía al 10% o de acuerdo con la política institucional.
8. Procesar muestras para microscopía o microscopía electrónica de barrido fluorescente como se describe a continuación.

4. fluorescente Microscopía y Recuento celular

1. Preparar un 4% de paraformaldehído (PFA) solución (Precaución: Realice en campana de extracción).
2. Incubar los tubos en una solución de PFA 4% durante la noche a 4 ° C.
3. Después de la incubación durante la noche, quitar 4% PFA y enjuague películas muy suavemente con DPBS.
4. Corte el tubo en secciones para exponer la superficie del lumen para la tinción.
5. Manchasuna sección de la tubería con unas gotas de medio de montaje con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) durante 30 min a temperatura ambiente (proteger de la luz). Después de la tinción, enjuague el tubo muy suavemente con DPBS para reducir el fondo de la señal DAPI.
6. Imagen utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro DAPI y la cámara digital para contar el número de células en 9 campos seleccionados a ciegas de vista bajo un aumento de 200X.
7. Celular Registros diarios por campo de visión y realizar análisis estadísticos adecuados para determinar la significación estadística de los resultados.

5. Microscopía Electrónica de Barrido

1. Preparar una solución de glutaraldehído al 2% (Precaución: Realice en campana de extracción).
2. Incubar los tubos en una solución de glutaraldehído al 2% durante la noche a 4 ° C.
3. Después de la incubación durante la noche, lavar suavemente el tubo de 3x con DPBS.
4. Prepare una solución al 1% de tetróxido de osmio (Precaución: peligro de inhalación severa! Uso en campana de extracción).
5. Incubar los tubos en una solución de 1% de tetróxido de osmio durante 15 min a temperatura ambiente.
6. Enjuague suavemente el tubo de 3x con DPBS.
7. Preparar una serie de concentraciones de etanol (25%, 50%, 75%, 95% y 100% de etanol).
8. Deshidratar el tubo por incubación en la serie de concentraciones de etanol. Incubar en 25%, 50%, 75% y etanol al 95% durante 20 min cada uno. Incubar en etanol al 100% durante 30 min.
9. Punto supercrítico seque el tubo con CO ₂ durante 45 minutos para eliminar toda la humedad.
10. Secciones de tubos de montaje sobre un trozo espécimen con pasta de plata o grafito.
11. Secciones de tubo de capa con 12,5 nm de oro-paladio.
12. Examinar en el microscopio electrónico de barrido.

Resultados

Generación de superficies poliméricos reactivos con tiol mediante el uso de la TFD-BzPh y TCEP junto con reactivo con tiol recCD47 poli-lisina usando SMCC permite la fijación de recCD47 a las superficies poliméricas. El proceso de modificación se resume esquemáticamente en la Figura 1. La conveniencia de este proceso de modificación es que se puede aplicar a muchas proteínas diferentes y muchas superficies poliméricas diferentes, suponiendo que la proteína puede modificarse con grupos química...

Discusión

La química de fotoactivación (que se resumen en la Figura 1) permite la modificación de prácticamente cualquier superficie de polímero que tiene hidrocarburos suficientes para facilitar PDT-BzPh unión y la posterior irradiación UV para la foto-activar el PDT-BzPh. Funcionalización de la superficie polimérica con grupos tiol reactivos permite la posterior unión de una serie de moléculas de interés comprobables. En nuestros estudios particulares elegimos recombinante CD47 ^11-13. La ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Scientific	58906	Caution! Use in fume hood
25% Glutaraldehyde	VWR	AAA17876-AP	Caution! Use in fume hood
2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)	Synthesized in lab	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059-100G
Citrate	Sigma	S5770-50ML
Digital Camera	Leica	DC500	Out of production
Dimethylformamide (DMF)	Sigma	270547-100ML	Caution! Use in fume hood
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco/Life Technologies	14190-136
Fluorescent Microscope	Nikon	TE300
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212	Caution! Use in fume hood
Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-12730
Osmium Tetroxide	Acros Organics	197450050	Caution! Use in fume hood
Potassium Bicarbonate (KHCO3)	Sigma	237205-100G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma	P5655-100G
PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)	Terumo Cardiovascular Systems	60050	Most clinical-grade tubing will work
Scanning Electron Microscope	JEOL	JSM-T330A
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358-212
Microplate Reader	Molecular Devices	Spectramax Gemini EM
Sulfo-SMCC	Sigma	M6035-10MG	Moisture Sensitive!
tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)	Thermo Scientific	20491
Tween-20	Bio-Rad	170-6531
Vectashield with DAPI	Fisher Scientific	H-1200	Light sensitive!
Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO	Thermo Scientific	89891