Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

Resumen

Se presenta un dispositivo y un nuevo método para estudiar las células y embriones. Las células individuales se ordenan precisamente en matrices microcavidad. Su confinamiento en 3D es un paso hacia entornos 3D se encuentran en condiciones fisiológicas y permite la orientación orgánulo. Mediante el control de la forma celular, esta configuración reduce al mínimo la variabilidad reportado en ensayos estándar.

Resumen

Las células biológicas se observan generalmente en las superficies planas (2D). Esta condición no es fisiológico y fenotipos y formas son muy variables. Selección basada en células en estos entornos tienen limitaciones, por lo tanto graves: orgánulos celulares muestran fenotipos extremos, morfologías celulares y tamaños son orgánulos celulares heterogéneas y / o específicos no se pueden visualizar correctamente. Además, las células in vivo se encuentran en un entorno 3D; en esta situación, las células muestran diferentes fenotipos principalmente debido a su interacción con la matriz extracelular que rodea el tejido. Con el fin de estandarizar y generar orden de las celdas individuales en un entorno 3D fisiológicamente relevante para los ensayos basados ​​en células, se presenta aquí la microfabricación y las aplicaciones de un dispositivo para el cultivo in vitro de células en 3D. Este dispositivo consiste en una matriz 2D de microcavidades (típicamente 10 ⁵ cavidades / cm ^2), cada uno lleno con células individuales o embriones. posición de la célulación, la forma, la polaridad y la organización interna de la celda se convierten entonces normalizado que muestra una arquitectura 3D. Utilizamos moldeo réplica al patrón de una serie de microcavidades, hueveras '', sobre una delgada polidimetilsiloxano (PDMS) capa adherida sobre un cubreobjetos. Las cavidades se cubrieron con fibronectina para facilitar la adhesión. Las células se insertan por centrifugación. porcentaje de llenado se ha optimizado para cada sistema que permite hasta 80%. Las células y los embriones se confirmó la viabilidad. Se aplicó esta metodología para la visualización de orgánulos celulares, tales como aparato de Golgi y el núcleo, y para estudiar los procesos activos, tales como el cierre del anillo cytokinetic durante la mitosis celular. Este dispositivo permitió la identificación de nuevas características, tales como la acumulación y la falta de homogeneidad de la miosina y actina periódicas durante el cierre del anillo cytokinetic y fenotipos compactados de Golgi y la alineación núcleo. Nos caracteriza el método de células de mamífero, levadura de fisión, la levadura en ciernes, C. elegans wITH adaptación específica en cada caso. Por último, las características de este dispositivo lo hacen particularmente interesante para los ensayos de cribado de fármacos y la medicina personalizada.

Introducción

Actual en ensayos basados ​​en células in vitro son de dos dimensiones (2D). Esta configuración no es natural para las células de mamíferos y, por tanto, no es fisiológicamente relevante ^1; las células muestran una diversidad de formas, tamaños y fenotipos heterogéneos. Presentan serias limitaciones adicionales cuando se aplica a las aplicaciones de cribado, tales como una distribución desordenada dentro del plano y fenotipos extremos de los orgánulos celulares (fibras de estrés, en particular). Esto es particularmente importante en los ensayos clínicos de las pruebas de drogas, donde los presupuestos altos se gastan cada año. La mayoría de estos fármacos fracasan, aunque cuando se aplica a los modelos animales debido a la condición de cultivo 2D artificial en las primeras etapas de la detección de drogas. Además, mediante el uso de este enfoque, los orgánulos celulares específicos no pueden ser correctamente visualizados, tal como el anillo de actomiosina cytokinetic durante la mitosis celular, y en general estructuras que se están desarrollando en el plano perpendicular al plano de observación. Algunosnuevos ensayos 2D se han propuesto con el fin de superar los inconvenientes antes mencionados y importantes conocimientos sobre la organización del citoesqueleto se han observado ^2,3. Sin embargo, estos ensayos todavía presentes una seria limitación: células muestran un fenotipo muy propagación en contraste con lo que se observa in vivo, donde las células presentan una arquitectura 3D. Estos artefactos asociados con el método de cultivo pueden desencadenar características no fisiológicas tales como las fibras de estrés mejoradas ^1,4,5.

Ensayos de cultivos celulares tridimensionales proporcionan múltiples ventajas en comparación con los entornos 2D ^6,7. Ellos son fisiológicamente más relevantes, y los resultados son por lo tanto significativa. Como un ejemplo, las células embebidas en hidrogeles muestran estructuras 3D-como pero sus morfologías difieren de una célula a otra ^8,9. Sin embargo, sus morfologías difieren de una célula a otra, lo que complica las aplicaciones de cribado. Una estrategia alternativa es la de insertar solacélulas en cavidades microfabricados ^10,11. posición de la célula, la forma, la polaridad y la organización interna de la pila pueden entonces convertirse normalizado. Además de proporcionar una arquitectura 3D-como a las células, microcavidades cuenta también los estudios de cribado de alto contenido ^10,12-14; células individuales pueden ser ordenados en microarrays y orgánulos celulares y sus evoluciones se pueden observar en paralelo. Esta regularidad ofrece buenas estadísticas con bajo número de células y mejores resoluciones temporales / espaciales. Los compuestos útiles son más fáciles de identificar de forma fiable.

En este estudio, mostramos la fabricación y aplicación de un nuevo sistema de células sola cultura 3D-como para aplicaciones de alto contenido de cribado ^10,12,13. El dispositivo consiste en una serie de microcavidades elastoméricos (10 ⁵ cavidades / ^cm2), acuñadas '' hueveras (EC). Las dimensiones y el volumen total de la CE en este trabajo se han optimizado para el volumen típico de las células HeLa y NIH3T3 individualesdurante la división celular. La morfología de las cavidades cilíndricas - - se selecciona de forma de la célula orientar correctamente para la visualización de procesos activos. Moldeo de réplica se utiliza para una variedad de patrones CE sobre una delgada polidimetilsiloxano (PDMS) capa adherida sobre un vidrio cubreobjetos ^15,16. Las células se introducen en la CE por centrifugación. Presentamos aquí la observación y la normalización de los orgánulos celulares (fibras de estrés de actina, aparato de Golgi y el núcleo) en 3D (CE) en comparación con las mismas células en 2D (plano) superficies. Nos informan también de la observación de los procesos dinámicos activos, tales como el cierre del anillo de actomiosina cytokinetic durante la mitosis celular ^17. Finalmente, se muestran los resultados de esta metodología en otros sistemas con paredes rígidas, como la levadura en ciernes, levadura de fisión y C. embriones elegans que confirma la aplicabilidad de nuestra metodología para una amplia gama de sistemas modelo.

A continuación presentamos una p detallado y exhaustivorotocolo con el fin de fabricar y aplicar las hueveras '' para la microfabricación 3D. Nuestro enfoque es simple y no necesita una habitación limpia. Anticipamos que esta nueva metodología será particularmente interesante para los ensayos de cribado de fármacos y la medicina personalizada, en sustitución de las placas de Petri. Finalmente, nuestro dispositivo será útil para estudiar la distribución de respuestas de las células a los estímulos externos, por ejemplo en el cáncer de ¹⁸ o en la investigación básica ^19.

Protocolo

1. La microfabricación de Eggcups ''

1. La fabricación del Maestro: microcavidades matriz
   1. Calentar una oblea de 3 '' de silicio de hasta 200 ° C para evaporar cualquier presencia de humedad.
   2. Spin-abrigo de una fina capa de SU-8 fotoprotector. Ajustar el volumen de resina y de hilado de velocidad en función del espesor y fotoprotector tipo deseado. Este espesor dictará la profundidad de las hueveras '' (EC). Para una capa de espesor de 30 micras y SU-8 2025, spin-capa a 2.800 rpm.
   3. Pre-hornear la oblea a 65 ° C durante 1 min (paso 1 de 2) para un espesor de SU-8 2025 capa de 30 micras. Adaptar el tiempo, dependiendo del tipo de resina fotosensible y el grosor deseado. Compruebe la hoja de datos del fabricante para más detalles.
   4. Pre-hornear la oblea a 95 ° C durante 3 min (etapa 2 de 2) para un espesor SU-8 2,025 capa de 30 micras. Adaptar el tiempo, dependiendo del tipo de resina fotosensible y el grosor deseado. Compruebe la hoja de datos del fabricante para más detalles.
   5. cargar ella oblea en el alineador de máscara para la exposición UV. Coloque la máscara de fotolitografía en él. La máscara muestra un patrón de características circulares (discos) de 20 micras de diámetro. Asegurar un contacto perfecto entre sí.
      NOTA: Los distintos fabricantes ofrecen máscaras de fotolitografía. La resolución espacial determinará el coste final. máscaras de acetato proporcionan una resolución aceptable (≈10 micras) a bajo costo. máscaras de cromo proporcionan una mejor resolución, pero son más caros. Adaptar los diámetros de los discos (de la máscara de fotolitografía) y el volumen de las células. Las dimensiones de los discos en la máscara determinarán el diámetro de las cavidades del equipo. Los diámetros pequeños conduzcan a un relleno de baja; diámetro demasiado grande, no se limitará a las células. Para las células HeLa y NIH3T3, se sugieren diámetros de 20 micras a 25 micras.
   6. Comprobar el poder de la memoria antes de lámpara UV y optimizar el tiempo de exposición en consecuencia. Irradiar (longitud de onda = 365 nm) para 41,5 seg (o el tiempo de exposición optimizado) a250 mJ / cm ^2.
      NOTA: SU-8 2025 es un fotoprotector negativo, lo que significa que las regiones expuestas a los rayos UV se curan. En este caso, las características circulares eran de color negro y el resto transparente. trabajo fotoprotector positivo en el sentido contrario: las regiones no expuestas se curan. Seleccione la resina fotosensible en consecuencia, dependiendo del diseño y foto-máscara.
      NOTA: proteger los ojos de la luz UV con gafas de seguridad apropiadas.
   7. Eliminar suavemente la máscara de la capa de resina fotosensible.
   8. Post-hornear la oblea a 65 ° C durante 1 min (paso 1 de 2) para un espesor de SU-8 2025 capa de 30 micras. Post-hornear la oblea a 95 ° C durante 3 min (etapa 2 de 2) para un espesor de SU-8 2025 capa de 30 micras. Adaptar el tiempo, dependiendo del tipo de resina fotosensible y el grosor deseado. Compruebe la hoja de datos del fabricante para más detalles. Después de post-cocción, enfriar la oblea a la temperatura ambiente en el banco de alrededor de 1 min.
   9. Colocar la oblea en el spin-revestidor y soltar unos pocos mm de SU-8 desarrollador para cubrirtoda la zona de la oblea. Desarrollar por 2 min y luego girar-capa a 1.000 rpm durante 30 seg. Repetir el procedimiento tres veces.
   10. Enjuague con 2-propanol para asegurar la eliminación completa de subdesarrollada SU-8. Apariencia de las regiones blanco es una indicación de desarrollo incompleto. Si es así, repetir la etapa de revelado un tiempo adicional.
   11. Hard-hornear la oblea a 200 ° C para asegurar la solidez de las microestructuras fabricadas. Este paso es opcional.
   12. Almacenar la oblea 3 '' con microestructuras dentro de una 94 mm x 15 mm de poliestireno placa de Petri.
       NOTA: No hay necesidad de tratamiento de superficies, en particular, silanización, para los siguientes pasos.
2. La fabricación del polidimetilsiloxano (PDMS) Réplica: Pilares de matriz
   1. Mezclar bien en una relación 1:10 (w / w) el reticulante y el pre-polímero para un total de 30 g en un tubo de 50 ml.
      NOTA: El uso de una relación de 1:10 (v / v) también está trabajando.
   2. Centrifugar el tubo a 1800 xg durante 5 min aeliminar las burbujas de aire.
   3. Deje caer suavemente el PDMS en la parte superior de las microestructuras.
      NOTA: Si aparecen burbujas de aire durante este paso, desgasificar la muestra usando una bomba de vacío durante 15-20 min.
   4. Colocar la muestra en un horno a 65 ° C durante 4 horas.
      NOTA: El tiempo de curado varía entre los usuarios y, junto con el reticulante: proporción de pre-polímero. Esta vez dictará la rigidez de los PDMS. Se recomienda para curar más de 2 horas y mantenerse dentro de un tiempo de curado fijo.
   5. Utilizar un bisturí para cortar suavemente el área de interés (sello) de aproximadamente 1 cm ^2, que incluye alrededor de 10 microcavidades o ⁵ '' hueveras.
      NOTA: Corte primero el PDMS y, a continuación, la pela apagado suavemente. Comprobar la calidad de la réplica de PDMS con un microscopio óptico.
3. La fabricación de hueveras '' por moldeo réplica. En lo que sigue, se describen dos estrategias alternativas para la fabricación de 'hueveras. Ambos protocolos son similar y proporcionar resultados idénticos:
   1. estrategia 1
      1. Activar el sello PDMS fabricado por tratamiento con plasma de oxígeno durante 30 segundos. Almacenar temporalmente los sellos activadas en una placa de Petri cerrada para evitar la acumulación de polvo.
         NOTA: Ajuste el tiempo de exposición si se utilizan otros gases para el plasma.
      2. Coloque los PDMS activados sello boca arriba (el lado con las estructuras) en una placa de Petri lado de un tapón de tubo de 15 ml. Llenar la tapa con 200 l de trimetilclorosilano (TMCS). Cierre la placa de Petri y dejar que el sello silaniza durante 7 minutos.
         NOTA: Algunos deformación temporal en el sello y / o cambio de color (blanco) puede ser observada. El sello se recuperará su forma original en poco tiempo y no se verá afectado a las estructuras.
         NOTA: TMCS produce toxicidad por inhalación y dérmica aguda, y es altamente inflamable (con retrospectiva de ignición capaz de producirse a través de distancias considerables). En consecuencia, se debe utilizar en una campana de gases lejos de la fuentes de ignición.
      3. Coloque el sello de PDMS en el spin-revestidor con las estructuras boca arriba. Ponga una pequeña gota de pocos microlitros (alrededor de 20 l) de PDMS líquido (1:10 w / w reticulante: pre-polímero) en la parte superior de las estructuras. Spin-capa a 1500 rpm durante 30 seg para depositar una fina capa de PDMS en la parte superior de las estructuras.
         NOTA: Si el sello no encaja en el lugar mandril spin-revestidor el sello en la parte superior de una tapa de caja de Petri con un pequeño agujero en su centro.
      4. Coloque el sello en el horno a 65 ° C durante 4 horas para curar la capa de PDMS spin-revestido depositado.
      5. Activar la capa delgada de PDMS colocando el sello PDMS boca arriba, junto con un cubreobjetos de vidrio # 0 de 25 mm de diámetro, se utiliza el filtro de plasma de oxígeno durante 30 segundos. Proceder rápidamente con el paso siguiente.
         NOTA: Cubreobjetos con otros espesores, formas y dimensiones se puede utilizar también. Sin embargo, algunas estructuras celulares podrían ser difíciles de visualizar en función del espesor cubreobjetos seleccionado y objetivoampliación y / o NA y / o la distancia de trabajo. Consultar ficha de objetivo.
      6. Colocar en contacto el sello (el lado con la capa delgada spin-revestido) con el cubreobjetos de vidrio. Presione suavemente todo alrededor de la superficie del sello con pinzas para hacer la 'unión'. Por último, mantener una presión constante en la parte superior del sello por alrededor de 10 segundos.
      7. Después de 30 minutos suavemente «piel», el sello de la cubreobjetos con el fin de "liberar" '' hueveras (ver Figura 1). Enjuague bien con etanol y se seca. Si PDMS '' hueveras no están bien adheridas en el cubreobjetos de vidrio (es decir, que se desprenden durante la "pelando" paso), tenga en cuenta el ajuste de la configuración del limpiador de plasma y reinicie en el paso 1.3.1.5.
         NOTA: Este paso es delicado. Prestar atención a fin de evitar la rotura del cubreobjetos y / o desprendimiento de la capa de PDMS delgada.
      8. Pegar un trozo pequeño (mango) de PDMS curadas de 1 mm x 1mm x 3 mm en el volumen en el borde del cubreobjetos con una pequeña gota de PDMS líquidos y curar el PDMS como antes. Esto facilitará la manipulación de la muestra después (véase la Figura 1). Este paso es opcional.
   2. estrategia 2
      1. Hidrofilizar el PDMS sellos fabricados por tratamiento con plasma de oxígeno durante 30 segundos. Almacenar temporalmente los sellos activadas en una placa de Petri cerrada para evitar la acumulación de polvo.
         NOTA: Ajuste el tiempo de exposición si se utilizan otros gases para el plasma.
      2. Hidrofilizar el cubreobjetos de vidrio de diámetro # 0 de tratamiento con plasma de oxígeno 25 mm a 15 W durante 30 s. Proceder rápidamente con el paso siguiente.
         NOTA: Cubreobjetos con otros espesores, formas y dimensiones se puede utilizar también. Sin embargo, las estructuras celulares serán difíciles de visualizar en función del espesor cubreobjetos seleccionado y características objetivas (ver nota anterior).
      3. Spin-capa una pequeña gota de PDMS (01:10 w / w reticulante: pre-polYmer) de pocos microlitros sobre el cubreobjetos de vidrio. Spin-capa a 1500 rpm durante 30 segundos para un espesor final de alrededor de 50 micras.
      4. Pegar un trozo pequeño (mango) de PDMS curadas de 1 mm x 1 mm x 3 mm en el volumen en el borde del cubreobjetos con una pequeña gota de PDMS líquidos y curar los PDMS como antes. Esto facilitará la manipulación de la muestra después (véase la Figura 1). Este paso es opcional.
      5. Almacenar temporalmente los cubreobjetos PDMS recubrimiento sobre un trapo limpio en el interior de una caja de Petri para protegerlo de la deposición de polvo.
      6. Ponga una gota de reactivo de silanización en la parte superior de cada sello y dejar que se evapore durante 1-2 minutos. A continuación, se seca bajo una corriente de _N2.
         NOTA: En este paso, una deformación temporal del sello se puede observar durante la evaporación. El sello se recuperará su forma original después de secar con N ₂ sin ninguna deformación permanente de las microestructuras.
      7. Caer muy suavemente el sello silanizada en la parte superior de laPDMS-spin recubierto cubreobjetos de vidrio almacenada en la placa de Petri. Asegúrese de que ambas partes están completamente paralelas durante el contacto. Evite presionar o mover el sello después de colocarla en el cubreobjetos recubiertos de PDMS.
      8. Coloque la placa de Petri con las muestras en el vacío durante 1-2 horas para eliminar las burbujas de aire.
         NOTA: Asegurarse de que las muestras son totalmente horizontal para evitar el desplazamiento del sello. También evite la vibración potencialmente causada por la bomba de vacío.
      9. Colocar las muestras en el horno a 65 ° C durante 4 h.
      10. Con cuidado, retire el sello para revelar '' hueveras. Enjuague bien con etanol y se seca.
          la práctica es necesaria en este punto: NOTA. Prestar atención en evitar la rotura del cubreobjetos y / o desprendimiento de la capa de PDMS delgada.

2. La introducción de células en el '' Eggcups

Con el fin de introducir dentro de células de mamífero '' hueveras, ne superficie de PDMSeds a ser funcionalizado con proteínas de adhesión de la matriz extracelular. Este ejemplo utiliza la fibronectina pero otras proteínas de interés, como el colágeno, se podría utilizar.

1. Hidrofilizar las 'hueveras' en el filtro de plasma de oxígeno durante 30 segundos.
   NOTA: Optimizar los parámetros si es necesario.
2. Preparar una solución en PBS 1x de 20 mg ^ml-1 de fibronectina de fuentes bovinas.
3. Esterilizar las hueveras '' con UV durante 5 minutos. Depositar una pequeña gota (alrededor de 20 a 50 l) de la solución de fibronectina para cubrir toda el área 'hueveras' y se incuba durante 1 hora a RT. Evita que la muestra se seque.
4. Enjuague suavemente las hueveras '' con PBS 1x. Repetir 3 veces.
   NOTA: La muestra está lista para usar inmediatamente o se almacenaron a 4 ° C en la oscuridad durante varias semanas.
5. Introducir una pieza de plástico a medida cilíndrica de 63 mm de altura, 26 mm de radio externo y 7 mm de cotas de radio internos en un tubo de 50 ml (véaseLa Figura 2) ²⁰
   PRECAUCIÓN: El uso artículos UV-esterilizado o los esterilizar antes de su uso.
   NOTA: Esta pieza puede ser fácilmente fabricado en el laboratorio. o por cualquier taller de máquinas disponibles.
6. Dicho de 13 ml de medio de cultivo celular en el interior del tubo (véase la Tabla 1). El medio debe llenar al menos 2 cm por encima de la pieza cilíndrica para asegurar la inmersión completa de la muestra.
   NOTA: Para obtener información detallada de los tipos de células específicas, y otros sistemas modelo como la levadura o C. elegans embriones, y el medio correspondiente, se indican en la sección 5 y la Tabla 1. El protocolo descrito se ha optimizado para HeLa, las células NIH3T3, y otras líneas celulares (véase la Tabla 1).
7. Introducir suavemente los 'hueveras' en el interior del tubo y paralelo al lado superior de la pieza de plástico. Use pinzas cortantes para contener la muestra usando el mango PDMS. Presione suavemente el cubreobjetos hasta que se encuentra en la parte superior de la cara superior de la pieza de plástico, de las Naciones Unidashasta que esté completamente sumergida (ver Figura 2).
   NOTA: Se recomienda utilizar pinzas afiladas y rectas. Con unas pinzas curvas, la manipulación de la muestra es difícil y puede causar la rotura.
8. células de cultivo hasta 80-100% de confluencia en una placa de Petri P60 y recoger ellos por tripsinización.
   NOTA: Las células pueden ser de tipo salvaje, transfectadas o tratados con cualquier fármaco de interés.
   NOTA: Evitar la formación de agregados de células que eviten las células individuales para entrar en las hueveras ''. Para optimizar este paso, la pipeta hacia arriba y abajo a fondo después de tripsinización.
9. células en medio de cultivo de 5 ml volver a suspender. Pipetear 200 l de células en la parte superior de las hueveras ''.
   NOTA: Caída de las células lo más centrado posible en la parte superior de las hueveras '', pero evitando el contacto físico. Esto evitará la rotura y / o daño de la muestra.
10. Se centrifuga a 1.800 g durante 2 min.
    NOTA: Después de la primera centrifugación, el registro de un micrófonoROSCOPE el porcentaje de llenado de las hueveras ''.
11. Pipeta de nuevo 200 l de células en la parte superior de las hueveras '' y se centrifuga a 1.800 g durante 2 min. Repetir para un total de tres veces con el fin de optimizar el porcentaje de llenado.
    NOTA: Después de la última centrifugación, consulte con un microscopio el porcentaje de llenado de hueveras ''. Si es necesario, repetir las etapas de llenado + centrifugación hasta alcanzar el porcentaje de llenado deseado.
12. Retire la muestra del tubo utilizando las pinzas cortantes sostienen la manija PDMS. Asegúrese de tener cuidado en no las células perturbadoras '' que se celebran en las hueveras '' (ver Figura 2).
13. Colocar la muestra en una placa de Petri con medio. Enjuague para eliminar el exceso de células que no están en los 'hueveras' pipeteando arriba y abajo tres veces suavemente junto a cada lado (un total de 4 lados) de la matriz de microestructura.
    NOTA: El pipeteo con demasiada fuerza puede liberaralgunas células fuera del área de 'hueveras'.
14. Sustituir el medio con medio fresco para eliminar las células nonattached.
    NOTA: En este paso de un fármaco de interés se puede añadir.
15. Fijar las células o prepararlos para la etapa de lapso de tiempo imaging.See 4.1.

3. Observación de Cellular Dynamics activa en "Eggcups ': cytokinetic cierre del anillo

NOTA: Este ejemplo utiliza células HeLa que se transfectan con MYH10-GFP y Lifeact-mCherry de miosina y actina, respectivamente, moléculas activas clave involucrados en el cierre del anillo cytokinetic durante la mitosis celular. El dispositivo se prepara con microcavidades de 25 micras de diámetro. Por su observación, se utilizó un microscopio invertido de epifluorescencia, equipado con un objetivo de aceite 60X (1,40 NA, DIC, Plan de Apo) y GFP (miosina) y TxRed (actina) filtros. Alternativamente se usó un microscopio confocal en posición vertical, equipado con un 25X o 63X HCX IR APO objetivo L de agua (0,95 NA). Por esta example, es muy recomendable para sincronizar las células utilizando el bloque doble timidina, bloque mitótico o mitótico método de ^21-24 sacudida-off.
NOTA: El espesor del PDMS utilizados para las hueveras '' permite el uso de una variedad de objetivos, tanto en microscopios invertidos y en posición vertical posicionado.

1. Place '' hueveras en un soporte de microscopio y llenarlo con 1 ml de FCS medio L-15 de observación de 10%. Para evitar la evaporación, colocar una tapa de vidrio en la parte superior del soporte o aplicar una fina capa de aceite mineral en la parte superior de la medium.Select el objetivo aceite de 60X.
   NOTA: medio L-15 es adecuado para distintos del CO ₂ atmósferas. Tenga en cuenta también que algunos compuestos de DMEM son auto-fluorescente. Al utilizar este medio, se recomienda photobleach los compuestos fluorescentes mediante la iluminación con una lámpara de alta intensidad durante 1-2 horas.
   NOTA: Evitar el uso de tapas de plástico cuando se trabaja con imágenes DIC.
2. Coloque el soporte con hueveras '' y obsermedio vación en el microscopio. Enfoque cuidadosamente el uso de luz de campo claro hasta que las hueveras '', y las células están en el mismo plano de la observación.
3. Abra el programa y ajustar los parámetros. Seleccione los filtros TxRed y GFP para actina y la miosina; ajustar el tiempo de exposición para cada canal. Una velocidad de adquisición típico es de 5 seg para ambos canales.
   NOTA: El tiempo de exposición puede tener que ajustarse en función de la configuración utilizada, colorantes u otros orgánulos celulares de interés.
4. Seleccione la región de interés y buscar un anillo cytokinetic utilizando el canal de GFP o TxRed. Enfocar con precisión.
   NOTA: El anillo es más agudo en la miosina y más fácil de reconocer.
5. Ejecutar la adquisición automática en ambos canales hasta que el anillo está completamente cerrada.
   NOTA: Algunos photobleaching se puede observar. Ajustar los parámetros del microscopio con el fin de reducirlo.

4. Observación de los orgánulos celulares fijos en las hueveras ''

Este paso puede realizarse antes o después de la etapa # 3. Las células se pueden fijar directamente después de la etapa de centrifugación y se tiñeron para el orgánulo de interés o después de la observación en el microscopio. Este ejemplo muestra la tinción de las fibras aparato de Golgi, núcleo y actina en fibroblastos NIH3T3 en 'hueveras.

1. La fijación de las células en el '' Eggcups
   1. Preparar 3% de paraformaldehído (PFA) y calentar a 37 ° C. Retire la muestra '' hueveras del tubo de 50 ml (o el titular microscopio) y colocarlo dentro de una cápsula de Petri P35. Se lava una vez con PBS 1x.
      NOTA: Los protocolos para la preparación de 3% de paraformaldehído están ampliamente disponibles en otros lugares.
      PRECAUCIÓN: Use guantes de nitrilo y protección para los ojos durante la preparación de PFA.
   2. Eliminar por completo el PBS y colocar 1 ml de 3% PFA y se incuba durante 17 min. Retire la PFA y enjuague dos veces con 1 ml de PBS 1X. permeabilizar las células utilizando 1 ml de 0,5% Tritpor 3 min y se lava dos veces con PBS 1x para 5 min.
2. La tinción de las células en las hueveras ''
   1. Se incuban las células de Golgi tinción aparato con el anticuerpo primario policlonal de conejo anti-Giantin en una dilución 1: 500 en PBS. Coloque una gota de 100 l de solución de anticuerpos en una hoja de película de plástico y se incuban las células dentro de las hueveras '' boca abajo durante 45 minutos.
      NOTA: Proteger la muestra con una cubierta para evitar que se seque.
   2. Soltar con cuidado las hueveras '' y colocarlos en una placa de Petri P35. Enjuagar 3 veces, 5 minutos cada uno, con PBS 1x.
   3. Preparar un cóctel en PBS con el anticuerpo secundario Cy3 de cabra anti-conejo (1: 1000) y con faloidina Alexa Fluor 488 (1: 200) para la tinción de fibras de estrés de actina.
   4. Se incuban las células con una caída de 100 l de solución de anticuerpo sobre una hoja de película de plástico y se incuban las células en el interior de los '' hueveras boca abajo durante 45 min.
   5. Lanzamiento cuidadosamente la 'eggcups 'y colocarlos en una placa de Petri P35. Enjuagar 3 veces, 5 minutos cada uno, con PBS 1x.
   6. Se incuban las células para la tinción del núcleo colocando una gota de 100 l de 1 mg ml ^-1 DAPI en PBS sobre una lámina de película de plástico y se incuban las células dentro de las hueveras '' boca abajo durante 45 minutos. Este paso se puede realizar con el paso 4.2.3.
   7. Soltar con cuidado las hueveras '' y colocarlos en una placa de Petri P35. Enjuagar 3 veces, 5 minutos cada uno, con PBS 1x.
   8. células de montaje utilizando un glicerol 15 l: PBS (1: 1 v / v) en un portaobjetos de microscopio estándar y sellar la muestra con esmalte de uñas para evitar la desecación.
      NOTA: Dependiendo del espesor '' hueveras, montaje puede ser difícil. Se recomienda almacenar entonces la muestra en una placa de Petri P35 en PBS, protegido de secado.
3. Observación microscopio
   NOTA: En este ejemplo se utiliza un microscopio confocal en posición vertical, equipado con detectores PMT y de híbridos. Un 25X o 63 X HCX IR APO objetivo L de agua (0,95 NA) fue seleccionada para proporcionar un amplio campo de la muestra y mostrar la aplicabilidad del dispositivo para aplicaciones de alto contenido de detección.
   1. Seleccione el objetivo 25X o 63X agua.
      NOTA: Diferentes objetivos pueden ser utilizados dependiendo de la aplicación y de la señal. Sin embargo, se recomienda el uso de objetivos de gran apertura numérica.
   2. Coloque la muestra fijada con las hueveras '' y centrarse cuidadosamente usando la luz de campo claro (contraste de fases o CID) hasta que las hueveras '' y las células se encuentran en el plano de observación.
   3. Abra el programa y ajustar los parámetros. Seleccione los filtros GFP, Cy3 y DAPI para actina, Golgi y el núcleo de observación, respectivamente; ajustar el tiempo de exposición para todos los canales.
      NOTA: El tiempo de exposición puede tener que ajustarse en función de la configuración.
   4. Seleccionar y enfocar la región de interés; iniciar la captura de imágenes (ver Figura 3).

tle "> 5. Adaptación para la observación de células de levadura y C. elegans embriones

1. Las células de levadura de fisión y de florecimiento
   NOTA: Este ejemplo utiliza células de levadura de fisión, que estén etiquetadas RLC1-mCherry y la EC-GFP de miosina y actina, respectivamente. Las células de levadura en ciernes no están etiquetados con fluorescencia aquí. Para la observación levadura de fisión se utilizó un hilado microscopio confocal de disco invertida. Se utilizó un objetivo de aceite de 100X HCX PL APO CS (1,4 NA) para todas las adquisiciones. Alternativamente, también se observaron las células usando un microscopio de contraste de fases invertido equipado con un objetivo de contraste de aire 20X fase LCPlanFl (0,4 NA). En este ejemplo, el protocolo es idéntico para ambos tipos de células.
   1. Preparar la superficie '' hueveras como se ha descrito anteriormente. Para la fisión y en ciernes células de levadura, preparar cavidades de 5 m de diámetro (véase la Tabla 1). En este caso, la superficie no tiene que ser funcionalizado con proteínas de adhesión.
      NOTA: El llenado can ser optimizado mediante el uso de 'hueveras' cónicas. Esta forma capta y retiene las células evitando la liberación durante la etapa de aclarado después de la centrifugación. Llenado porcentaje es óptimo a aproximadamente 80%. Estos '' hueveras cónicas se pueden fabricar por medio de Deep Reactive Ion Etching ^13.
   2. Células de levadura Cultura en los medios de cultivo adecuado (véase la Tabla 1) hasta alcanzar una densidad óptica (OD) en el intervalo de 0,2 y 0,8. Sonicar el cultivo de células de levadura para eliminar los agregados.
   3. Insertar células de levadura en hueveras '' por centrifugación. Por centrifugación, se añadieron 4 ml de células cultivadas en la DO apropiada en el tubo con hueveras ''. Después de la primera centrifugación, agitar suavemente el tubo a las células que no están en las hueveras '' volver a suspender, mientras que las células en las hueveras '' no se vean perturbadas. Sin necesidad de abrir el tubo, se centrifuga de nuevo y repetir este paso dos veces. Esto asegura la deposiciónde células del cultivo en las microcavidades vacías y se incrementará el porcentaje de llenado.
      NOTA: Cuando se trabaja con la levadura, se recomienda precalentar la centrífuga a la temperatura de trabajo durante los experimentos
      NOTA: El protocolo puede ser una pausa aquí y continuó hasta 12 horas más tarde. En este caso, almacenar la muestra a la temperatura de trabajo y se cubre para evitar la evaporación.
   4. Coloque '' hueveras en un soporte de microscopio y llenar el titular con el medio esterilizado por filtración para obtener imágenes. Ahora enjuagar las células con el mismo medio hasta que las células de levadura flotantes se eliminan de manera eficiente. Tenga cuidado de no molestar a las células en hueveras '' durante el proceso de lavado.
   5. Seleccione el objetivo aceite de 100X y centrarse cuidadosamente. Abra el programa y ajustar los parámetros. Para la levadura de fisión, seleccione la GFP filtros y TxRed para la actina y la miosina y ajustar el tiempo de exposición para ambos canales. Una velocidad de adquisición normal es de 3 seg.
      NOTA: En función deel fluoróforo, el tipo de marcaje y la puesta en marcha, el tiempo de exposición varía para otros sistemas.
2. C. elegans embriones
   NOTA: En este ejemplo se utiliza C. elegans embriones de 25-30 micras de ancho y 50-55 micras de largo. Los embriones se cultivaron como se indica en ^25. Un protocolo simple visual de cómo manipular C. elegans se puede encontrar en ^26. La observación se realizó utilizando un microscopio de contraste de fases invertido equipado con un objetivo de 40X de aire 0,55 NA.
   1. Prepare la superficie '' hueveras como se describió anteriormente y 25 micras de diámetro (ver Tabla 1). En este caso, la superficie no tiene que ser funcionalizado con proteínas de adhesión.
   2. Cultura del C. elegans embriones en el medio de cultivo adecuado (ver Tabla 1).
   3. Inserte embriones en hueveras '' por centrifugación como se ha descrito anteriormente (ver sección 2.6 a 2.12) utilizando agua ultrapura como medio de cultivo.
      NOTA: Los embriones fueron 'comportando' normalmente en agua ultrapura para la duración del experimento. Alternativamente utilizar un tampón M9 fisiológica para los experimentos a largo plazo.
   4. Enjuagar la muestra como se describe anteriormente (véase el apartado 2.14). Coloque las hueveras '' en un soporte de microscopio. Seleccione el objetivo 40X de aire y centrarse cuidadosamente. Abra el programa y ajustar los parámetros. Seleccione una velocidad de adquisición de 3 seg.

Resultados

Las hueveras '' (EC) son una metodología novedosa de alto contenido de cribado que permite la visualización de las células y embriones orientadas en un entorno 3D. Además, algunos procesos celulares, que son difíciles de observar en cultivos estándar 2D (planos), pueden ser observados por este nuevo método. La figura 1a muestra un resumen del procedimiento de la microfabricación CE (ver también la Sección 1 en el protocolo anteriormente descrito ). El método es simple, rápido, eficie...

Discusión

moldeo de réplica se utilizó con el fin de fabricar las 'hueveras. El proceso de fabricación no necesita una habitación limpia; es fácil y simple, aunque puede ser necesario un poco de práctica. En particular, la liberación de la marca de PDMS es el paso más crítico con el fin de producir una gran área de '' hueveras de alta calidad. Por esta razón, especial cuidado tiene que ser tomado en este paso. Si este paso se abstiene repetidamente, tenga en cuenta para optimizar los parámetros del plasma ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ddH20 (ultrapure)	Millipore	-	Use always fresh water.
Parafilm (plastic film)	Bemis	PM-999	Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask	Selba	-	http://www.selba.ch
Silicon wafer	Siltronix	-	http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist	MicroChem	2000 series	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer	MicroChem	-	http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol	Sigma-Aldrich	19030	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent )	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Chlorotrimethylsilane (TMCS)	Sigma-Aldrich	386529-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves	Kleenguard	57372	http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0	Knittel glass	KN00010022593	http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers	SPI	0WSSS-XD	http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube	BD Falcon	352070	http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 kit	http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides	Dutscher	100001	http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium	Fisher Scientific	41965-039	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum	Sigma-Aldrich	C8056-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25200-072	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x	Fisher Scientific	14200-067	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium	Fisher Scientific	21083-027	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin	Fisher Scientific	15140-122	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35	Greiner	627102	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60	Greiner	628163	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94	Greiner	633179	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 %	Sigma-Aldrich	P6148-500G	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 %	Sigma-Aldrich	93443-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488	InVitrogen	A12379	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647	InVitrogen	A21245	1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin	Abcam	ab24586	1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html
rabbit anti-anillin	Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008).		1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine	Transduction Lab	610000	http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	111-166-047	http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR
1 mg/ml for 1 min
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells	-	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells	ATCC	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast	-	-	For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms	-	-	For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-732	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-522	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media)	MP Biomedicals	4110-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging	MP Biomedicals	4110-012	For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM)	MP Biomedicals	4104-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
(Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters	Millipore	-	http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2