Un alto contenido de imágenes de Ensayo para la Identificación de la neurotoxina botulínica Inhibidores

Resumen

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

Resumen

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Introducción

La bacteria Clostridium botulinum produce la neurotoxina botulínica, una de las toxinas biológicas más potentes conocidos por el hombre ^1. Hay 7 diferentes serotipos de BoNT (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induce parálisis en la unión neuromuscular debido a la proteolisis complejo SNARE ^2,3. SNARE proteolisis evita neurotransmisor-vesícula de la membrana de fusión y por lo tanto bloquea la exocitosis de neurotransmisores ^4. El objetivo SNARE específica depende del serotipo particular, BoNT involucrado en el proceso de intoxicación. BoNT / A y BoNT / E escinden SNAP-25 mientras que escinde BoNT / C ambos SNAP-25 y sintaxina ^5. El sinaptobrevina cleave restantes serotipos (también llamada asociada a vesículas de proteína de membrana (VAMP). BoNT / A fue elegido para el desarrollo del ensayo, ya que es responsable de una alta proporción de botulismo de origen natural y tiene la duración más larga de acción ^6. Desarrollo de molécula pequeña la terapéutica contra la BoNT / A es una meta importante paranuestro programa de descubrimiento de fármacos y ha utilizado métodos por objetivos tradicionales para identificar inhibidores proteolíticas sitio activo hace ^{7, 8-10.} Sin embargo, la creación de los inhibidores del sitio activo con actividad de amplio espectro contra múltiples serotipos y eficacia después de la exposición es probable que sea un reto.

Por ello, hemos implementado un enfoque innovador, fenotípica descubrimiento de fármacos que utiliza BoNT SNAP-25 de la escisión como un criterio de valoración funcional para identificar pequeñas moléculas que pueden bloquear mediada por BoNT intoxicación de las neuronas motoras. SNAP-25 se requiere para la liberación de neurotransmisores, como la degradación de la SNAP-25 es predictivo de la parálisis y la letalidad in vivo. Por ejemplo, el cribado basado en células podría conducir al descubrimiento de nuevos moduladores de factores celulares responsables de la inactivación de la toxina o la inhibición de las vías de la toxina en el interior de las células diana. Un factor importante en el desarrollo del ensayo fenotípico es la selección de los modelos biológicos fisiológicamente relevantes. WE y otros han descrito madre embrionarias de ratón (ES) neuronas motoras derivadas de células que recapitular el carácter inmunológico de las neuronas motoras primarias, incluyendo la expresión de SNAP-25 ^{11- 13.} Es importante destacar que estos sistemas celulares son muy sensibles a BoNT / A intoxicación y demuestran la escisión dependiente de la dosis de la SNAP-25 en respuesta a concentraciones crecientes de toxina ^11,12. Las neuronas motoras diferenciados también se producen en cantidades que son suficientes para el análisis basado en la placa de alto rendimiento y permitieron el diseño de una serie de ensayos celulares.

El ensayo fenotípico es un método de inmunofluorescencia utilizando dos anticuerpos diferentes para cuantificar la escisión de longitud completa expresado de forma endógena SNAP-25 durante la BoNT / A intoxicación de la cultura de ratón de la neurona motora. Un terminal carboxilo de BoNT / A (BACS) de anticuerpos de escisión sensible que reconoce sólo de longitud completa SNAP-25 permite la evaluación de la BoNT / A proteolisis mediada de SNAP-25expresión en las neuronas del motor del ratón ^10. Un diagrama esquemático del ensayo de HCI se representa en la Figura 1.

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Protocolo

Placa 20000 diferenciado células ES de ratón (MES) / pocillo en placas de 96 una lisina recubiertos con poli-D así y mantener en la neurona motora medios diferenciación terminal durante 5-7 días.

Administración 1. El compuesto y la intoxicación con BoNT / A

Lleve a cabo todos los trabajos siguientes en un recinto BSL2 para mantener el cumplimiento con las pautas de los CDC / NIH.

1. Preparar soluciones madre 10 mM de cada compuesto de la biblioteca en 100% de DMSO en placas de 96 pocillos de polipropileno. Utilice el stock de 10 mM para preparar una placa de dilución intermedia que es 10 veces mayor que la concentración de detección deseado. Preparar 100 uM placa intermedia mediante la supresión de stock 10 mM en placa de 96 pocillos y se diluye a 100 uM usando medios de cultivo. Dispensar 10 l de los compuestos sobre a 90 l de los medios de comunicación sobre las células ^11. Prueba de los compuestos a 10 uM concentración final y asegurar el porcentaje final de DMSO no sea superior al 0,5%.
2. Realizar todos espárragos que utilizan células vivas y toxina activa bajo nivel de bioseguridad 2 condiciones. Reemplazar los viejos medios de comunicación en las placas de 96 pocillos con 80 l de los medios de comunicación fresca diferenciación terminal utilizando una pipeta manual de 12 canales. Llevar a cabo la aspiración y dispensar pasos por filas para evitar la exposición de las células sin medios de comunicación para el aire ambiente.
3. Pretratar las células con compuestos antes de la aplicación de la toxina mediante la adición de 10 l de 10x compuestos a partir de la placa de fuente utilizando una pipeta de 12 canales, seguido de mezclado por aspiración (dos veces). Para cada placa de 96 pocillos, tratar dos columnas de 6 pozos con 10x DMSO diluido en los medios de comunicación para servir como señal alta y los controles de señal bajos. La columna sin tratamiento BoNT exhibe el nivel más alto de la longitud completa SNAP-25 (control alto de la señal). Tratar la otra columna con BoNT solo (sin ningún compuesto) como el control de señal baja. Utilice baja de control para observar la eficacia de escisión de BoNT SNAP-25 y su detección con el anticuerpo BACS (Figura 2).
4. Se incuban las células con los compuestos durante 30 min a 37 ° C y 6% de CO ₂ en la incubadora de cultivo celular.
5. Preparar neurotoxina botulínica A partir de un 1 mg / fuente comercial ml en tampón fosfato salino (PBS) a una final 10x madre de trabajo diluyendo con medios diferenciación terminal.
6. Iniciar la intoxicación mediante la adición de 10 l de 10x BoNT / A de stock en los pocillos designados para los controles de tratamiento y baja señal usando una pipeta multicanal (Figura 2). Tratar a los pocillos designados como alto control con medio solo.
7. Descontaminar todos los artículos de plástico y otros materiales desechables que entra en contacto con BoNT / A durante el estudio por inmersión en solución de hipoclorito de 0,825% en agua durante al menos 20 min. Lleve a cabo todos los procedimientos en los gabinetes de seguridad biológica y descontaminar las áreas de trabajo, tanto antes como después de los experimentos con 5% de detergente limpiador desinfectante como solución MicroChem.
8. Etiquetar las placas claramente para indicar el uso de la toxina y incubcomieron placas tratadas con 1 nM / L de BoNT / A durante 4 horas a 37 ° C y 6% de _CO2 en un incubador de cultivo celular. Pantalla de señalización apropiado para informar a los colegas que la toxina está en uso en el laboratorio.
9. Detener BoNT / A escisión proteolítica por la fijación de metanol. Retire los medios de comunicación que contienen toxinas y compuestos de cada pocillo con una pipeta multicanal y desechar en una solución de lejía al 10%. Añadir metanol enfriado con hielo (100 l) directamente a cada pocillo.
10. Incubar las placas durante 15 min a temperatura ambiente (RT) para permitir que se produzca la fijación.
11. Después de la fijación, manejar de forma segura los reactivos desechados (considerado neutralizados) con protocolos de nivel de bioseguridad 1 y descartar en consecuencia.
12. Descartar metanol y el uso de 100 l de PBS para lavar las células y rehidratar ellos antes de la inmunotinción. Realizar dos lavados con PBS adicionales.
13. Después del lavado final, deje de PBS en los pozos, placas de sellado con película adhesiva de microplacas y se almacena a 4 ° C hasta su análisis. Placas se almacenan a 4 ° C for varios días.

2. La inmunotinción

El procedimiento de inmunotinción es una operación de múltiples pasos de trabajo intensivo que incluye ciclos de dosificación de reactivos / aspirado repetitivas y extensa de lavado de placas que pueden conducir a la posible introducción de una variabilidad significativa intraplaca y Interplate. Un enfoque semi-automatizado se aplica para ahorrar el tiempo del personal de laboratorio, aumentar el rendimiento del ensayo, y minimizar la variabilidad inmunotinción.

1. Utilice una estación de trabajo automatizada equipada con un cabezal de 96 pocillos capaz de transferir volúmenes de hasta 250 l e integrado con un brazo robótico de agarre para mover el material de laboratorio en diferentes lugares de la cubierta modular (ver Material y Equipo) para este protocolo.
   1. La cubierta modular está diseñado para acoger diferentes tipos de material de laboratorio y puede soportar hasta 11 artículos en un momento dado. El manejador de microplacas automatizado está equipado con un cargador de doble apilador de microplacas con el fin de sostener ymanipular hasta 50 placas por ciclo.
   2. La estación de trabajo automatizada se encuentra en el interior de una cabina de bioseguridad de Clase II diseñado para equipos de automatización de laboratorio para asegurar la esterilidad y seguridad. Para la inmunotinción automatizada, la cubierta está dispuesto como se muestra en la Figura 3 para permitir el acceso del reactivo según sea necesario y sin intervención humana.
2. Placas pre-carga que contienen células fijadas en la revista placa y la transferencia a la cubierta, según sea necesario para las operaciones de manejo de líquidos. Use la cabeza 96 de la pipeta provista de 250 consejos para aspirar mu l de PBS a partir de los pozos de hasta 10 l. Permeabilizar las membranas celulares para facilitar la unión del anticuerpo a dianas intracelulares con tampón de permeabilización (0,1% Triton X-100). Dispensar tampón de permeabilización (100 l) en cada pocillo antes de regresar las placas a la segunda cargador de almacenamiento del apilador de microplacas para una incubación de 15 min a temperatura ambiente (RT).
3. Retire permeabilización de amortiguación y PElavado de placas rforma con PBS (dos veces), como se describe anteriormente en el paso 1.13.
4. Después de la última etapa de lavado, eliminar el tampón PBS y dispensar 100 l de tampón de bloqueo que contenía 1% de suero de caballo y 0,1% de Tween 20 en PBS en todo microplacas antes de devolverlos a la revista placa durante 1 hora de incubación a temperatura ambiente.
5. Use dos anticuerpos primarios para la inmunotinción: un anticuerpo policlonal de conejo anti-ratón de anticuerpos BACS, para la detección de longitud completa SNAP-25 monoclonal de ratón y un anti-III tubulina de anticuerpos para la detección de las neuronas (ver Material y Equipo). Después de 60 min de incubación, retirar el tampón de bloqueo y dispensar 50 l de 4UG / ml de anticuerpo BACS y 0,5 mg / ml de III-tubulina en tampón de bloqueo en todas las placas.
6. Incubar durante 1 hora a RT a eliminar los anticuerpos primarios y lavar 3 veces con 100 l de PBS que contenía 0,05% de Tween (PBST).
7. Utilice una IgG anti-ratón marcado con Alexa Fluor 647 para visualizar el -III tubulina y anti-IgG de conejo marcado con Alexa Fluor 568 para visualizar el anticuerpo BACS. Preparar ambos anticuerpos como una dilución / ml 2 g en tampón de bloqueo y dispensar 50 l de la mezcla en cada pocillo.
   NOTA: Los anticuerpos secundarios seleccionados para la inmunotinción se etiquetan con diferentes fluoróforos para permitir la detección de la luz fluorescente emitida en longitudes de onda distintas que utilizan diferentes canales dentro del detector del Alto Imager contenido.
8. Incubar durante 1 hora a RT. Aspirar los anticuerpos secundarios y lavar 3 veces con 100 l de PBST.
9. Después del lavado final, añadir 100 l de PBS que contiene el colorante Hoechst (32 mM) para teñir el ADN para la detección de los núcleos.
10. Sellar las placas con una película impermeable ligera para proteger los fluoróforos de photobleaching. Las placas pueden almacenarse a 4   ° C durante semanas sin pérdida significativa de la señal.

3. Imaging

NOTA: Lleve a cabo la adquisición de imágenes usando contenido de alta Imaging System (Ver Materiales y Equipo).

1. Especificación de alto contenido Imager Definiciones:
   1. Seleccione el tipo de placa, diseño, número de campos, objetivo: Greiner u claro, formato de 96 pocillos, 16, 20X agua respectivamente.
   2. Seleccione los canales: núcleo de excitación EX: 405 nm como el canal 4; citoplasma EX: 644 nm como el canal 2; antígeno específico EX canal anticuerpo: 561 nm como el canal 3 y Configurar potencia de excitación de cada láser, experimento Configuración como dos exposiciones, exposición 1 con una excitación a 644 nm, la exposición 2 con dos excitaciones a 405 nm y 561 nm. Seleccione hurgar en la basura como BIN2.
   3. Utilice los pocillos de control de alta para la optimización de la exposición con la máxima intensidad como canal de SNAP-25 y bajo control de los pozos de intensidad mínima.
   4. Ajuste la exposición, de modo que la intensidad de cada canal es aproximadamente la mitad del nivel de saturación (2.000-2.500 unidades relativas).
   5. Identificar el plano Z óptima en el canal máscara celular utilizando delta script de corrección. Ver Figura 5 para resultados después de inmunotinción y de imagen. Exportar datos al servidor donde el software de análisis de imágenes está residiendo.

4. Análisis de Imágenes (Figura 6)

NOTA: Los siguientes pasos describen la aplicación de los algoritmos de software Columbus.

1. Seleccione un algoritmo apropiado para segmentar los objetos primarios (núcleos). Si es necesario, ajustar el umbral de fondo y los parámetros de contraste. El software de Colón proporciona 4 métodos de detección de los núcleos. Seleccione el método que los núcleos de segmentos con precisión mediante la inspección visual de los núcleos segmentados (en F igura método 6a M se selecciona).
2. Seleccione el algoritmo de neuritas (CSIRO neuritas Análisis 2) al segmento de las neuritas Si es necesario, ajustar los parámetros de umbral y contraste de fondo para eliminar el fondo. Véase la figura 6b para los parámetros utilizados para detectar las neuritas.
3. Identificar las regiones neuritas (segmentos) neuritas based en los objetos secundarios (neuritas) utilizando una expansión pixel -3 del canal de tubulina β-III (Alexa Harina 640) como máscara (Figura 6c).
4. Calcular la intensidad de los canales de señal (SNAP-25, (Alexa Harina 568) para la región de las neuritas y el canal de la tubulina β-III (Figura 6d y 6e).
5. Seleccione los parámetros deseados para la exportación, tales como la longitud de las neuritas, las intensidades medias de SNAP-25, β-tubulina III, número de núcleos, número de segmento de neuritas, etc. (Figura 6f).
6. Placas de transferencia de apiladores de placas utilizando el robot y la carga en el Alto de imágenes de contenido para la adquisición de imágenes.

5. Análisis de Datos:

Para evaluar la robustez del ensayo diseñado, calcular los siguientes parámetros del experimento basado en la placa.

1. La señal (S) a fondo (B): S / B = intensidad de la señal de control de alta media) / intensidad media de un buen control de la señal
2. Coeficiente de Variación (CV) de la señal y el fondo (para medir la uniformidad de la señal específica): CV = (desviación estándar (SD) / media de la muestra) * 100 (%), para determinar la variabilidad en el manejo de líquidos, reactivos, etc.
3. Señal a ruido: S = (intensidad de la señal significa - intensidad media de un buen control de la señal) / SD de control de baja
   1. Calcular el factor de la Z 'con la intoxicación de una mitad de una placa de 96 pocillos y un simulacro de la intoxicación de la otra mitad. Z '= 1 - 3 * (SD de alta control de señal + SD de bajo control de la señal) / (media de alto control de la señal - media de un buen control de la señal). Para el análisis posterior de los datos de cribado, normalizar algunos de los parámetros primas primarias sobre una base placa para permitir la comparación entre las placas y entre los diferentes días de experimentos.
4. Porcentaje de escisión, lo que refleja la reducción de la señal asociada con la longitud completa SNAP-25 detectado por el anticuerpo específico (BACS): Cleavage% = 100% * (mean intensidad de la señal de control de alto - intensidad de la muestra) la intensidad de la señal de control de alta / media.
5. Porcentaje de inhibición de la escisión:% de inhibición = 100% * (intensidad de la muestra - significa la intensidad de un buen control de la señal) / (intensidad de la señal de control de alta significar - intensidad de un buen control de la señal de media).

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Resultados

Los datos de los controles alto y bajo crearon dos poblaciones distintas con la diferencia de dos medianas superiores a 3 desviaciones estándar (Figura 7A). El objetivo del proceso de selección es encontrar los compuestos dentro de la población de la muestra con los valores más cercanos a la población control positivo, suponiendo una distribución normal dentro de la población de la muestra (Figura 7B, (i)). Los puntos de datos que están más allá de 3 desviaciones estándar de ...

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Discusión

La alta potencia de las neurotoxinas botulínicas y la relativa facilidad de su militarización ha dado lugar a su clasificación en la categoría A (la más alta prioridad) agentes biothreat por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. Desafortunadamente, no existen terapias aprobadas por la FDA para contrarrestar BoNT después de la intoxicación por toxina ha sido interiorizado por las neuronas motoras. Cualquier mecanismo druggable que promueve la recuperación neuronal de BoNT intoxicación pod...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Botulinum neurotoxin A	Metabiologics	NA	No catalog number
Microtitre plates	Greiner	655946	Poly-D-Lysine 96-well plates
BACs antibody	Lampire Biological	NA
Microchem	National	0255
Methanol	Thermo Scientific	A412-20
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Horse serum	Invitrogen	16050
PE JANUS MDT Mini Automated Workstation	Perkin Elmer	AJMDT01
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
BIII tubulin antibody	R&D Systems	BAM1195
Tween 20	Sigma	P1379-1L
Hoechst 33342dye	Invitrogen	3570
Antimouse IgG	Invitrogen	A21236
Anti rabbit IgG	Invitrogen	A10042
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Ver 2.4
Spotfire	Perkin Elmer	Ver 5.5
Clorox bleach	Fisher Scientific	18-861-284
PlateStack