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Resumen

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Resumen

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

Introducción

Rapid advances in next-generation sequencing (NGS) technologies are providing exciting opportunities to probe the molecular underpinnings of a wide range of genetically complex ecological adaptations in a broad diversity of non-model organisms1–3. This approach is extremely powerful because it establishes a basis for population and functional genomics studies of organisms with an especially interesting and/or well-described ecology or evolutionary history, as well as organisms of practical concern, such as agricultural pests and disease vectors. Thus, NGS technologies are leading to rapid advances in the fields of ecology and have the potential to address problems such as understanding the mechanistic bases of biological responses to rapid contemporary climate change4, the spread of invasive species5, and host-pathogen interactions6,7.

The extraordinary potential of NGS technologies for addressing basic and applied questions in ecology and evolutionary biology is in part due to the fact that these approaches can be applied to any organism at a moderate cost that is feasible for most research laboratories. Furthermore, these approaches provide genome-wide information without the requirement of a priori genetic resources such as a microarray chip or complete genome sequence. Nevertheless, to maximize the productivity of NGS experiments requires careful consideration of experimental design including issues such as the developmental timing and tissue-specificity of RNA sampling. Furthermore, the technical skills required to analyze the massive amounts of data produced by these experiments, often up to several hundred million DNA sequence reads, has been a particular challenge and has limited the widespread implementation of NGS approaches.

Recent RNA-Seq studies on the transcriptional bases of diapause in the invasive and medically important mosquito Aedes albopictus provide a useful example of some of the experimental protocols that can be employed to successfully apply NGS technology to studying the molecular basis of a complex ecological adaptation in a non-model organism8–10. A. albopictus is a highly invasive species that is native to Asia but has recently invaded North America, South America, Europe, and Africa11,12. Like many temperate insects, temperate populations of A. albopictus survive through winter by entering a type of dormancy referred to as photoperiodic diapause. In A. albopictus, exposure of pupal and adult females to short (autumnal) day lengths leads to the production of diapause eggs in which embryological development is completed, but the pharate larva inside the chorion of the egg enters a developmental arrest that renders the egg refractory to hatching stimulus15–17. Diapause eggs are more desiccation resistant5,18 and contain more total lipids19 than non-diapause eggs. Photoperiodic diapause in A. albopictus is thus a maternally controlled, adaptive phenotypic plasticity that is essential for surviving the harsh conditions of winter in temperate environments. Despite the well-understood ecological significance of photoperiodic diapause in a wide range of insects20,21, the molecular basis of this crucial adaptation is not well characterized in any insect22. In organisms such as A. albopictus that undergo an embryonic diapause at the pharate larval stage, it remains a particularly compelling challenge to understand how the photoperiodic signal received by the mother is passed to the offspring and persists through the course of embryonic development to cause arrest at the pharate larval stage.

This protocol describes mosquito rearing, experimental design and bioinformatics analyses for NGS experiments (transcriptome sequencing) performed to elucidate transcriptional components of photoperiodic diapause in A. albopictus. This protocol can be used for additional studies of diapause in A. albopictus, can be adapted to investigate diapause in other closely related species such as other aedine mosquitoes that undergo egg diapause23, and is also more generally relevant to employing NGS approaches to study the transcriptional bases of any complex adaptation in any insect.

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Protocolo

1. cría de larvas de dos A. albopictus Grupos a la edad adulta

  1. Establecer dos gabinetes de fotoperiodo con iluminación programable a 21 ° C para la expresión óptima diapausa 16 y una humedad relativa del 80% aproximadamente.
    1. Programa de un gabinete para un 16L: 8D luz: oscuridad ciclo (un no-diapausa inducir fotoperíodo LD). Establezca el segundo armario para un 8L: 16D luz: oscuridad ciclo (diapausa inducir) 13.
    2. 'Luces' programa al mismo tiempo en ambos gabinetes para sincronizar el tiempo circadiano entre fotoperíodos.
  2. Calcular la cantidad de huevos necesarios para llevar a cabo el experimento. Trate de 300-500 huevos por jaula. Al menos tres jaulas replicar diapausa y tres replicados se necesitan jaulas no diapausa para la generación de ARN. Esto asciende a aproximadamente 1,800-3,000 huevos por experimento.
    1. Hatch los huevos sumergiendo papeles de huevo en aproximadamente 500 ml de H2O desionizada
    2. Añadir ca. 1 ml suspensión alimentos consistentes en comida para perros suelo y artemia lo descrito previamente 24. Cubra recipiente con malla, y mantener la malla en su lugar con una banda elástica.
    3. Coloque en el gabinete fotoperíodo LD durante aproximadamente 24 horas.
  3. Larvas nacidas de transferencia a 10 x 10 x 2 cm Petri platos llenos de ca. 90 ml de agua desionizada H 2 O.
    1. Mantener ca. 30 larvas por plato. Traslado larvas para limpiar platos cada 48-72 horas, por ejemplo, todos los lunes, miércoles y viernes (MWF) 24.
    2. RSS aproximadamente 1 ml suspensión alimentos consistentes en comida para perros suelo y artemia en agua desionizada cada MWF lo descrito previamente 24.
  4. Configure tres y cincuenta y siete jaulas para adultos para cada tratamiento fotoperíodo, donde cada jaula comprende una biológica replicar.
    1. Desde los lados opuestos de 9,5 L cubos, cortar un agujero de 10 cm por 14, y otro agujero con 15 cm de diámetro. CoVer la primera con malla. Cortar aproximadamente una longitud de pie de una media ortopédica, y la cola de un extremo alrededor del interior de el otro agujero.
    2. Cortar la parte de los pies de la media apagado y cierre nudo - abierto sólo cuando se necesita acceso al interior de la jaula. Para la tapa de la jaula, cortar todo el interior, dejando sólo la llanta, y sustituir el plástico interior con malla 24.
    3. Tenga en cuenta el fotoperiodo, replicar número, jaula fecha de inicio, y otra información relevante para el experimento con un marcador permanente en el lado de la jaula.
  5. Cubra el fondo de las jaulas adultos con papel de filtro húmedo. Humedezca el papel de filtro con suficiente desionizada H 2 O para aumentar la humedad local en la jaula, pero evitar el agua estancada, que puede estimular la oviposición en el papel de filtro 24. Compruebe el filtro de papel diario para el secado, re-húmedo cuando sea necesario.
  6. Para producir los huevos suficientes para una biblioteca de ARN, incluir al menos 100 mujeres / 9.5 L cage, con no más de 500 mosquitos por jaula.
  7. Recoger MWF pupas y colocar en una pequeña taza de H 2 O limpia a una densidad de no más de 50 pupas por 25 ml de H 2 O. Transferir la taza pupas a una jaula de adulto. Coloque las jaulas en el gabinete fotoperíodo respectiva - A. albopictus pupas son fotosensibles 15.
  8. Asegúrese de que todos los días H 2 O en vasos es limpia y clara, y quitar pupas muertas, porque la acumulación de pupas muertas puede causar una mortalidad masiva. Retire H 2 O copas después de todas las pupas emergen.
  9. Coloque las pasas orgánicas en la malla superior de la jaula para proporcionar azúcar para adultos surgido. Monitorear las pasas, y cambiarlos cada 3-5 días para evitar la acumulación de moho.

2. Mantenimiento de adultos para permitir el acoplamiento y la producción de huevos

  1. Mantener jaulas en humedad alta (aprox. 80%) por el forro del fondo de la jaula con un papel de filtro húmedo, y proporcionar acceso a las pasas no moho, como se describió anteriormente (SECTIons 1.5 y 1.9).

3. alimentan de sangre

  1. Prepárese para las mujeres de sangre de alimentación entre dos y seis días después de la eclosión de asegurar que las mujeres han estado expuestos a por lo menos ocho días cortos inequívocos antes de la oviposición comienza por casi 100 huevos% diapausa 14.
  2. Preparar el sistema de alimentación Hemotek membrana. Conecte las unidades de alimentación en la fuente de alimentación. Ajuste la temperatura de cada unidad a 37 ° C con el tornillo de ajuste. Utilice un termómetro electrónico y la sonda para medir la temperatura de la unidad de alimentación durante la calibración.
  3. Preparar el depósito de comida. Estire un cuadrado de membrana de colágeno de alimentación sobre la abertura del depósito de comida y seguro que con una junta tórica. Tire con cuidado las esquinas para eliminar las arrugas; recortar el exceso de membrana con unas tijeras.
    NOTA: membrana de colágeno puede no funciona bien para todas las especies de mosquitos, y puede ser necesario probar varios tipos de encontrar la membrana óptimo si se trabaja con unespecies distintas de A. albopictus. Parafilm funciona bien con Culex pipiens.
    1. Si la sangre se almacena congelada, descongelar a temperatura ambiente durante al menos 1 hora antes de usar.
    2. Mantenga el depósito por lo que la membrana se encuentra hacia abajo, y las bocas de llenado no compatibles estén mirando hacia arriba. Usar una pipeta de transferencia o una jeringa para llenar el depósito con aproximadamente 3 ml de sangre total de los pollos que tiene citrato de sodio como un anti-coagulante. Selle los puertos de llenado con tapones de plástico.
  4. Coloque el depósito preparado para el alimentador atornillándolo en el perno en la placa de transferencia de calor en la parte inferior del alimentador. Invierta el alimentador y colóquelo en la parte superior de la jaula, lado de la membrana hacia abajo, de modo que los mosquitos pueden alimentar a través de la malla de la jaula. Mantenga el alimentador en la jaula por aproximadamente 45 minutos para maximizar la alimentación.

4. Estimular la oviposición

  1. De cuatro a cinco días después de la harina de sangre, equipar a cada jaula con un color oscuro 50 ml chasta forrada con papel sin blanquear germinación de la semilla (papel huevo) o una toalla no blanqueada con textura de papel y llenar hasta la mitad con agua desionizada 9. Si hay más de 250 mosquitos están en una jaula, utilizar dos tazas.
    NOTA: Para pequeñas jaulas o viales de una sola mujer ", la infusión de heno" en recipientes de oviposición puede aumentar la oviposición debido al olor de la flora microbiana 25.

5. Recoja y tienda Huevos

  1. Comenzar la recolección de huevos dentro de 4-5 días de alimentación de la sangre debido a la producción de huevos normalmente alcanza su máximo aproximadamente cinco días después de la alimentación de sangre, y luego desaparece durante la próxima semana.
  2. Varíe la frecuencia de recolección de huevos en las necesidades del experimento. Para propósitos generales, recoger los papeles de huevo en un horario de MWF. Retire los papeles de huevo de cada jaula y sustituir por papel nuevo. Coloque los documentos retirados recientemente en placas de Petri y se guardan en el gabinete fotoperíodo SD para evitar los efectos de confusión de almacenamiento de los huevos.
  3. Permitir que los papeles de huevo para re principal húmedo durante 2 días después de la oviposición para permitir la formación de la cutícula serosa, lo que aumenta la resistencia a la desecación de huevo 26.
  4. Colección de post Aproximadamente 48 h, huevos secos en aire libre. Secar el papel de manera que es floja y ligeramente húmedo al tacto, pero no tan húmedo que el papel esté oscuro de H 2 O o estimula la eclosión de los huevos.
    NOTA: A 6,5 papel "x 4" puede tardar aproximadamente 3,5 horas para secar. Tenga cuidado de no sobre-seca papeles de huevo, ya que esto dará lugar a la desecación de huevo 27.
  5. Reserva huevos adicionales tanto LD y SD fotoperiodos para evaluar la incidencia de la diapausa e interpretar el efecto fotoperiódico (ver Medición de diapausa, Sección 6).
  6. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener los papeles de huevo a 21 ° C y aproximadamente el 80% de humedad en placas de Petri. Mantenga placas de Petri en un contenedor de almacenamiento Tupperware con un frasco de agua para mantener la humedad local como el desarrollo embrionario toma de cuatro a cinco días a 21 ° C.
ove_title "> 6. Mida diapausa Incidencia

  1. Utilice embriones reservados adicionales (ver Estimular oviposición, Sección 4) que son 7-20 días para cuantificar la respuesta diapausa.
  2. Anote el número de huevos presentes en cada papel huevo.
  3. Estimular los huevos para incubar sumergiendo completamente papeles individuales de los huevos en un plato de 90 ml Petri con aproximadamente 80 ml ​​de H2O desionizada Añadir aproximadamente 0,25 ml de suspensión de alimentos.
  4. Después de 24 horas contabilizar el número de tramado larvas de primer estadio. Coloque la placa de Petri sobre una superficie de color negro para visualizar larvas y colocar una fuente de luz en un lado del plato. Las larvas se alejará de la fuente de luz, lo que permite un recuento claro de larvas individual. Retire larvas individuales con una pipeta mientras cuenta para evitar el recuento de larvas individuales.
  5. Papeles Place de huevo en una nueva placa de Petri y re-seco. Re-huevos eclosionan después de aproximadamente 1 semana y de nuevo coinciden huevos eclosionados utilizando el método anterior.
  6. Papeles Place de huevo con la u restante huevos eclosionados-n en nuevas placas de Petri de 90 ml con solución de blanqueo de aproximadamente 80 ml ​​28. Asegúrese de que los documentos de huevo están completamente sumergidos en la solución de blanqueo y dejan toda la noche bajo una campana de humos para evitar el olor a lejía.
    NOTA: La decoloración de la solución se puede almacenar durante ~ 1 semana a 4 ° C, pero por lo demás debe ser recién hecho.
  7. Inspeccione los huevos utilizando un microscopio de luz como el blanqueo, se borrará el corion y permitir la visualización de huevos embrionados, un-sombreada. Si se embrionados el huevo, el huevo tendrá un color blanquecino con los ojos que aparecen como dos pequeños puntos negros frente a la otra en el lado dorsal. Cuente el número de un-sombreada, huevos embrionados 13.
  8. Determinar la incidencia diapausa con la siguiente fórmula:% diapausa = no. huevos eclosionados-un embrionados / (no. huevos eclosionados + no. huevos embrionados de un-sombreada) x 100 13.

7. Extracción de ARN a partir de huevos / larvas pharate

ontenido "> NOTA: El uso Trizol en una campana de flujo laminar.

  1. Huevos de mosquito cepillo contienen embriones en desarrollo o larvas pharate en puntos de tiempo de desarrollo distintos de los papeles de huevo para amoladoras de vidrio utilizando un cepillo de pelo de camello. Moler los huevos en Trizol (1 ml por 50 a 100 mg de tejido) hasta que esté completamente pulverizado. Utilice al menos 400 huevos por la biblioteca para producir suficiente ARN.
    1. Alternativamente, snap huevos de congelación en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C en tubos de microcentrífuga durante un máximo de un mes antes de la molienda en Trizol.
  2. Realizar la extracción de ARN en Trizol seguido por precipitación con isopropanol de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  3. Tratar el banco con solución de RNasa descontaminación o otros agentes para eliminar las nucleasas residuales para evitar la degradación del ARN.
    1. Tratar el ARN extraído con DNasa. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, incubar las muestras de ARN con ADNasa durante 30 min a 37 ° C. Utilice 1 y #181; l DNasa para un máximo de 10 g de ARN en una reacción de 50 l. Aumentar la cantidad de DNasa si hay más de 10 g de ARN en una reacción.
    2. Inactivar la DNasa añadiendo 5 l de reactivo de inactivación DNasa suspendido. Incubar 5 min a temperatura ambiente, la mezcla tres veces durante el período de incubación (vórtex suave).
    3. Centrifugar a 10000 xg durante 1,5 min. Transferir el sobrenadante que contiene las muestras de ARN tratados a tubos nuevos para los pasos posteriores.
  4. Evaluar la calidad de las muestras de ARN total por fluorometría. Enviar las muestras a un centro especializado con el instrumento adecuado para esta tarea. La instalación llevará a cabo la electroforesis en gel en el chip para determinar los tamaños de las especies de ARN en la muestra, visualizadas por tinción fluorescente inculcado en el chip. Los resultados se devuelven como un electroferograma.
    1. Determinar la integridad de las muestras de ARN total por la presencia o ausencia de productos de degradación, como se evidencia por la presencia of picos entre los 18S y 5S picos de ARN ribosómico en el electroferograma resultante (Figura 1B).

8. RNA Secuenciación

  1. Enviar muestras de ARN total con una calidad suficientemente alta (Figura 1A) y cantidad (por lo general> 3 g por biblioteca) a un centro de secuenciación comercial para la construcción de bibliotecas de ARNm enriquecido de gama emparejado y la secuencia de ARNm, siguiendo protocolos estándar.
  2. Si más de un carril se utiliza para la secuenciación de un solo experimento, dividir bibliotecas individuales en dos carriles para la secuenciación para dar cuenta de la variación técnica entre los carriles durante la secuenciación.

9. lllumina Leer Limpieza

NOTA: La Figura 2 resume la parte de bioinformática de este protocolo. Para obtener una lista completa de todos los programas y los recursos utilizados en la sección de bioinformática de este protocolo, consulte la Tabla 1. EnAdemás, Archivo suplementario 1 contiene ejemplos de línea de comandos para cada uno de los siguientes pasos del protocolo de bioinformática.

  1. Utilice SSAHA2 29 (Tabla 1) para identificar coincidencias de 95% de identidad o superior a la base de datos NCBI UniVec Core (Tabla 1), A. secuencia albopictus rRNA (GenBank # L22060.1), y adaptadores de secuenciación (ejemplos detallados de línea de comandos proporcionados en Archivo Suplementario 1). Retire pares de lectura con partidos que utilizan Perl o herramienta de scripts similares, por ejemplo, adaptando el guión Perl proporcionado (Archivo Suplementario 2).
  2. Clean restante lee con el paquete SolexaQA 30 (Tabla 1; Suplementario Archivo 1): recorte de regiones con un phred equivalente puntuación de menos de 20 utilizando la configuración predeterminada de DynamicTrim.pl.
    1. Retire lee más corto que 25 pb con LengthSort.pl tanto en avance y retroceso lee simultáneamente. Evaluar la calidad de los archivos limpiados FASTQ con FastQC (Tabla 1 ) - en particular, verificar que la secuencia de calidad per-base y las puntuaciones de calidad por la secuencia están por encima de 20.

10. Normalización digital

  1. Realice una ronda de normalización digital en el limpiado lee usando la herramienta khmer 31 (Tabla 1; Suplementario Archivo 1), específicamente normalize-by-median.py (usando tamaño k-mer 20, una cobertura de corte de 20, y x = 1e10).
  2. Alternativamente, si una máquina con alta memoria RAM es disponibles (cientos de GB), utilice guión normalize_by_kmer_coverage.pl de Trinidad (Tabla 1).

11. De Novo Asamblea Transcriptome

  1. Obtener acceso a un clúster de ordenador o computadora con hasta 256 GB de RAM y 24 CPUs, dependiendo del tamaño del conjunto.
  2. Utilice Trinidad 32 (Tabla 1; File Suplementaria 1) para montar la lectura digital normalizado establecido en contigs. Para reduciruso de la memoria, utilice --min_kmer_cov 2.

Evaluación Asamblea 12.

  1. Ejecute assemblathon_stats.pl del proyecto Assemblathon2 33 en la salida contig Trinidad. Este script realiza cálculos básicos relevantes para la evaluación de la calidad de montaje, como el número de andamios, N50, composición de montaje, y más (Tabla 1; Archivo Suplementario 1).

13. Anotación del transcriptoma Montado

  1. Realizar Blastx (Tabla 1) del conjunto frente a un conjunto de proteínas de referencia; para los mosquitos, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens, y Aedes aegypti son las referencias adecuadas. En concreto, formatee el archivo fasta proteína de referencia para la explosión, seguida de blastx (Archivo Suplementario 1).

14. Mapa lee a la Asamblea Usando RSEM 34 (Tabla 1)

  1. Crear un archivo de 'transcripción de genes de ruta », en la que elprimera columna contiene los identificadores de genes de referencia, y la segunda columna los IDs contig. En un editor de hoja de cálculo, intercambiar las primera y segunda columnas de la salida Blastx, y escribir estas columnas en un archivo .txt. Utilice el programa LineBreak para convertir los saltos de línea en el archivo .txt resultante a formato Unix.
  2. Crear un conjunto de datos de referencia a partir del archivo fasta transcriptoma mediante el script rsem-preparar-referencia, incluida en el envase RSEM (Archivo Suplementario 1).
  3. Calcular los valores de expresión por separado para cada biblioteca con el comando rsem a calcular la expresión personal, incluida en el envase RSEM (Archivo Suplementario 1). Como lee, utilizar los archivos emparejados FASTQ resultantes de la etapa de limpieza de lectura (paso 9.2).
    1. Si ARN a partir de una réplica biológica se dividió en dos carriles para la secuenciación, incluir ambos archivos FASTQ en el cálculo de la expresión para generar un único archivo.
  4. Convertir los resultados de la expresión de cada biblioteca a una matriz fácilmente procesada por otra programas mediante el script rsem-generar-data-matriz proporcionada, incluida en el envase RSEM (Archivo Suplementario 1).

15. Análisis de la expresión diferencial

  1. Instale R y bordeadora (Tabla 1).
  2. Utilice read.delim para cargar los resultados RSEM de paso 14.3 (Archivo Suplementario 1). Si es necesario, completar los recuentos al entero más cercano.
    NOTA: La guía bordeadora recomienda limitar el conjunto de datos de genes con alta expresión suficiente para detectar significado.
  3. Para dar formato a los datos para bordeadora, generar un objeto DGEList del archivo de datos cargado (Archivo Suplementario 1). Entonces, normalizar los datos mediante TMM normalización (Archivo Suplementario 1). Estimar las dispersiones comunes y tagwise de los datos (archivos Suplementario 1).
  4. Identificar los genes expresados ​​diferencialmente con un Benjamini-Hochberg corregido valor de p <0,05 (Archivo Suplementario 1). Trazar la distribución de log-pliegue de cambio frente a la abundancia (Archivo Suplementario 1).

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Resultados

Fluorometría de dos muestras de ARN representativos mostró dos bandas a aproximadamente 2000 nt (Figura 1A, B). El 28S ribosomal RNA de insectos se compone de dos cadenas de polinucleótidos se mantienen unidos por enlaces de hidrógeno, que son fácilmente interrumpido por calentamiento o agentes que interrumpen los enlaces de hidrógeno 35 breve. Los dos componentes resultantes son aproximadamente el mismo tamaño que el ARN ribosomal 18S. La segunda muestra de ARN mostró altos niveles d...

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Discusión

Este protocolo se presentan métodos para descubrir los genes expresados ​​diferencialmente debido a fotoperiódicas diapausa inducida en A. albopictus. El protocolo es importante porque combina de forma única cría de mosquitos y técnicas de bioinformática para hacer todos los aspectos experimentales de un programa de fisiología molecular accesible para los usuarios novatos - en particular para los que se centran en la respuesta diapausa photoperiodic. Los métodos existentes, hasta donde sabemos, no p...

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

This work was supported by the National Institutes of Health grant 5R21AI081041-02 and Georgetown University.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
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Controlled environment roomThermax ScientificN/AWalk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
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TRI ReagentSigma AldrichT9424Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
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RNaseZapAmbion/Life TechnologiesAM9782Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AAPlace up to 12 RNA samples on one chip.
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Referencias

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