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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Resumen

Los centrosomas son pequeñas pero importantes orgánulos que sirven como los polos del huso mitótico para mantener la integridad genómica o ensamblar cilios primarios para facilitar las funciones sensoriales en las células. El nivel de una proteína puede ser regulada de manera diferente en los centrosomas que en otros lugares .cellular, y la variación en el nivel centrosomal de varias proteínas en diferentes puntos del ciclo celular parece ser crucial para la adecuada regulación de montaje centríolo. Hemos desarrollado un ensayo de microscopía de fluorescencia cuantitativa que mide los cambios relativos en el nivel de una proteína en los centrosomas en células fijadas de diferentes muestras, tales como en las diferentes fases del ciclo celular o después del tratamiento con varios reactivos. El principio de este ensayo radica en la medición de la intensidad fluorescente con corrección de fondo correspondiente a una proteína en una pequeña región, y normalizar que la medición contra el mismo para otra proteína que no varía bajo la c experimental elegidoondition. Utilizando este ensayo en combinación con pulso de BrdU y la estrategia de persecución para estudiar ciclos celulares no perturbadas, hemos validado cuantitativamente nuestra reciente observación de que la piscina centrosomal de VDAC3 está regulada a centrosomas durante el ciclo celular, probablemente por la degradación mediada por proteasoma específicamente a los centrosomas.

Introducción

Los centrosomas consisten en un par de centriolos rodeados por el material pericentriolar (PCM). Siendo los principales centros organizadores de microtúbulos (COMT) en células de mamíferos, los centrosomas actúan como los dos polos de husos mitóticos en células en división, y por lo tanto ayudan a mantener la integridad genómica 1. En las células quiescentes (por ejemplo, durante la fase G0), uno de los dos centriolos del centrosoma, a saber, el centríolo madre, se transforma en un cuerpo basal de montar el cilio primario, un orgánulo sensorial que sobresale hacia fuera de la superficie de la célula 2. Una vez que las células vuelvan a entrar en el ciclo celular, los cilios primarios se desmonta y cada centríolo dirige el montaje de un procentriole en su extremo proximal que se alarga gradualmente para formar un centríolo madura 3. En el inicio de la fase S, una estructura de rueda de carro como que proporciona la simetría 9 veces a la centriolo se forma sobre la superficie de cada centríolo existente y se convertirá en la base de cada procentriole. SAS6 tsombrero es indispensable para el montaje es reclutado centríolo para formar el eje de la rueda de carro 4-6. Otras proteínas centriolares se ensamblan en la rueda de carro en un muy regulado, proximal a distal manera 7. Después de completar con precisión la duplicación centríolo, las células se ensamblan materiales pericentriolar adicionales para construir dos centrosomas funcionales para el final de la fase G2 8. Además de los componentes básicos centriolares 9-11, varias otras proteínas, incluyendo quinasas, fosfatasas, chaperones, los componentes de andamios, proteínas de membrana asociados y maquinaria degradación están asociados con centríolos, cuerpos basales y PCM en diferentes momentos del ciclo celular 12-16. A menudo se observó que los niveles centrosomales de muchas proteínas están temporalmente regulados por mecanismos de focalización centrosomales y / o la degradación proteasomal en centrosomas. Es importante destacar que las fluctuaciones en el nivel centrosomal de varias proteínas tales como PLK4, Mps1, SAS6, y CP110 unat diferentes puntos del ciclo celular parece ser crucial para regular el montaje centriolo 5,17-22, y en el caso de Mps1 la prevención de esta degradación centrosomal conduce a la formación de un exceso de 19 centríolos. Por otra parte, las fracciones centrosomales de varias proteínas son menos lábiles en comparación con piscinas citosólicas. Por ejemplo siRNA mediada baja regulación de Centrin 2 (Cetn2) llevó a sólo una disminución moderada del nivel de proteína en los centríolos pesar de la gran reducción en sus niveles de células enteras 23. Por tanto, es crucial para medir los cambios en el nivel de proteínas centrosomales en el centrosoma en lugar de medir el conjunto de los niveles de proteína celular al evaluar sus funciones centrosoma específico.

En este estudio, hemos desarrollado un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para cuantificar el nivel relativo de una proteína en los centrosomas. Este ensayo se desarrolló especialmente para analizar células que son de diferentes muestrasy por lo tanto no puede ser reflejado al mismo tiempo. Estas muestras pueden ser células que fueron tratados con diferentes reactivos (es decir, las drogas versus control), recogidas en diferentes puntos de tiempo (es decir, el pulso frente a la persecución), o están en diferentes fases del ciclo celular. El principio de este ensayo radica en la medición de la intensidad fluorescente con corrección de fondo correspondiente a una proteína en una pequeña región y para normalizar dicho valor contra el mismo para otra proteína cuyos niveles no varían en las condiciones experimentales elegidas. Varios estudios en la biología del centrosoma han utilizado recientemente varias técnicas de microscopía cuantitativa, tanto en células vivas o fijas, para determinar la función del centrosoma específica de proteínas candidatas 24-27. Similares a los ensayos, la presente técnica también mide la corrección de fondo intensidad de fluorescencia de la proteína de prueba. Sin embargo, la inclusión de la normalización utilizando un patrón interno en este ensayo probablemente ofrecería mayorprecisión y confianza en el análisis de dos muestras diferentes que se encuentran en dos cubreobjetos diferentes. Por otra parte, además de examinar el nivel de proteína en los centrosomas, con ajustes menores este método se puede aplicar a un conjunto diverso de condiciones experimentales o en otros sitios celulares.

Aquí, combinamos nuestro ensayo microscopía cuantitativa con una estrategia de pulso y persecución BrdU para comparar las células de las etapas del ciclo celular diferentes. En lugar de utilizar técnicas de detención del ciclo celular estándar y de liberación para estudiar diversos puntos de tiempo del ciclo celular, las células que crecen de forma asíncrona se incuban con BrdU para marcar las células en la fase S, y las células marcadas son perseguidos durante diversos tiempos (normalmente 4-6 horas). La mayoría de las células marcadas estarán en la fase S inmediatamente después del pulso. La longitud de la persecución se elige de manera que después de la caza, las células marcadas serán a finales de S, G2, o mitosis, que puede ser verificado por las características morfológicas, de posición AS- de centrosomas con respecto a nucLei, distancia entre los centrosomas, la condensación de cromosomas, etc. Por lo tanto, la longitud de la persecución depende de la duración media de S, G2 y la fase M de un tipo de célula particular. Dado que este enfoque evita inhibidores del ciclo celular, tales como hidroxiurea, afidicolina, nocodazol, etc., permite un análisis más fisiológicamente relevantes del ciclo celular.

Por lo tanto, aquí demostrar que el ensayo de microscopía de fluorescencia cuantitativa solo, o en combinación con BrdU ensayo de pulso-caza, es una técnica simple pero potente para medir con precisión los cambios relativos en el nivel de una proteína centrosomal candidato durante un ciclo celular imperturbable. Se midió el nivel de centrosomal VDAC3, una proteína que se identificó recientemente en los centrosomas, además de las mitocondrias 16,28, el uso de estos ensayos. Los resultados obtenidos aquí verificar nuestra observación anterior de que la piscina centrosomal de VDAC3 está regulada por la degradación, y también varía en un dependen del ciclo celulart forma 16, además, la validación de la aplicabilidad de este método.

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Protocolo

1. Cultivo Celular

  1. Utilice la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), las células epiteliales del pigmento de la retina inmortalizadas (hTERT-RPE1; se hace referencia aquí como RPE1).
    NOTA: RPE1 células son células humanas diploides, casi no transformadas que se utilizan comúnmente para estudiar el montaje centriolo y ciliogenesis. Estas células siguen un ciclo normal de duplicación centriolo coordinado con un ciclo celular regulado.
  2. Passage un casi confluente 100 mm placa de cultivo celular de las células RPE1 a 1: 5 dilución del cultivo original en un plato de 100 mm fresco que contiene 10 ml de DME / F-12 (1: 1) el medio suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina (medio completo se conoce como DME / medio F-12). Se cultivan las células a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2.
    1. Incubar 12 mm cubreobjetos de vidrio redondas en 50 ml de HCl 1 N en un vaso de vidrio cubierto, O / N sin agitación, a 60 ° C en un baño de agua o una incubadora.
    2. After descartando la solución de ácido, lavar los cubreobjetos tres veces en 100 ml de agua destilada por incubación durante 15 min con agitación ocasional. Repetir el lavado de manera similar en 70% de etanol y 95% de etanol.
    3. Seque los cubreobjetos mediante la difusión individualmente a cabo en un papel secante de laboratorio en una cabina de bioseguridad, seguido de esterilización con radiación UV durante 60 min.
  3. Coloca 2-4 cubreobjetos secos en un 35 mm placa de cultivo celular. Diluir la solución de fibronectina o fibronectina como polímero de ingeniería (concentración de solución madre de 1 mg / ml) a una concentración de 25 mg / ml en cultivo celular PBS.
    1. Coloque 80-100 l de la solución diluida sobre cada cubreobjetos y se incuba durante 60 min a recubrir el lado superior del cubreobjetos. Lavar los cubreobjetos tres veces usando PBS antes de la adición de medio completo.

2. Las células de cultivo y tratamiento de las células con inhibidores del proteasoma

  1. Paso 2 x 10 5 crecer de forma asíncronaING RPE1 células en cada placa de 35 mm que contiene cubreobjetos y crecer las células en 2 ml de medio completo. Reemplace el medio de cultivo cada 24 horas con medio completo fresco precalentado.
    1. Para analizar el efecto de la inhibición del proteasoma en el nivel centrosomal de la proteína de prueba (aquí VDAC3 o γ-tubulina), crecen las células en dos placas de 35 mm de 44 hr. Reemplazar el medio de cultivo con medio completo y añadir ya sea MG115 o DMSO como disolvente de control a una concentración final de 5 mM o 0,05%, respectivamente. Al mismo tiempo, añadir BrdU a las células a una concentración final de 40 mM y se incuban las células durante 4 horas.
    2. Traslado cada cubreobjetos en una placa de 24 pocillos. Añadir metanol 500 l refrigerada a cada pocillo y se incuba la placa a -20 ° C durante 10 min para fijar las células sobre los cubreobjetos. Lavar inmediatamente los cubreobjetos tres veces con tampón de lavado 500 l (1X PBS que contenía 0,5 mM de MgCl 2 y 0,05% de Triton X-100).
  2. Se recoge el residuolas células de la placa de 35 mm y centrifugar las células a 1000 xg durante 5 min. Utilice el sedimento de células para analizar la proteína total por el Western Blot (paso 6).

3. Pulso BrdU y Chase Ensayo para analizar los niveles de proteína en diferentes fases del ciclo celular

  1. Para analizar la variación del nivel de una proteína (aquí VDAC3, SAS6 o Cep135) en los centrosomas en diferentes fases del ciclo celular, crecer las células en dos placas de 35 mm que contienen cubreobjetos de 44 hr. Sustituir el medio de cultivo con medio completo que contenía 40 mM BrdU e incubar las células durante 4 horas en la incubadora de cultivo celular.
  2. Desde un plato, transferir los cubreobjetos a una placa de 24 pocillos para fijar las células utilizando metanol frío como se describe en el paso 2.1.2.
  3. Después del pulso BrdU 4 horas, se elimina el medio que contiene BrdU-, lavar las células una vez con PBS y una vez con medio completo, se añade medio fresco, y luego crecer las células en ausencia de BrdU durante diversos tiempos (normalmente otro 4 hrpara las células RPE1) antes de la fijación de las células tal como se describe en el paso 2.1.2.
    NOTA: Para las células RPE1, la mayoría de las células BrdU-positivas están en S tarde o G2 fases después de una persecución de 4 horas. Esto se debe determinar de forma independiente para cada tipo de célula.

4. La inmunotinción

  1. Se incuban las células fijadas sobre cubreobjetos en 200 l de tampón de bloqueo (2% de BSA y 0,1% Triton X-100 en 1X PBS) durante 30 min.
    1. Se incuban las células con una mezcla de anticuerpos primarios (típicamente uno en conejo y otro criados en ratón) diluido en tampón de bloqueo O / N a 4 ° C en una cámara humidificada.
    2. Para hacer una cámara húmeda, poner una toalla de papel húmeda en la mitad inferior de una caja de puntas de pipeta de 1.000 l vacía. Colocar una tira de Parafilm sobre la superficie rack, y detectar una gota (15-20 l) de la solución de anticuerpo en el Parafilm para cada cubreobjetos para ser incubados. Invertir un cubreobjetos sobre una gota de solución de anticuerpo (de modo que las células están inmersas) y cercala tapa de la caja de propina.
    3. Invierta cubreobjetos de nuevo y volver de nuevo a la placa de 24 pocillos. Lavar cubreobjetos y luego se incuba en 150 l mezcla de anticuerpo secundario (aquí tinte anti-conejo conjugado fluorescente verde y colorante rojo fluorescente conjugado anti-ratón diluidos en tampón de bloqueo) durante 1 hora a RT. Lavar los cubreobjetos tres veces.
      NOTA: Los anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado son sensibles a la luz. Proteja las muestras de la luz durante los pasos 4.1.3-5.1.2.
  2. Preparar para la tinción de anti-BrdU mediante la fijación de las células teñidas RPE1 de nuevo con 500 l de metanol enfriada a -20 ° C durante 10 min, como se describe en el paso 2.1.2. Lavar los cubreobjetos tres veces.
    NOTA: Esta fijación asegura el etiquetado de anticuerpos primaria y secundaria de la proteína (s) de interés durante el proceso de hidrólisis ácida en el siguiente paso.
    1. Se incuban las células en 200 l de HCl 2 N durante 30 min a RT. Neutralizar con 300 l de 1 M Tris-Cl, pH 8 unad lavar las células tres veces con tampón de lavado.
    2. Bloquear las células de nuevo utilizando 200 l de tampón de bloqueo durante 30 min a RT.
    3. Se incuban las células con anticuerpo de rata anti-BrdU (diluido en tampón de bloqueo) durante 45 min a 37 ° C en una cámara humidificada. Devolver los cubreobjetos de nuevo a la placa de 24 pocillos, lavar y luego se incuba con el tinte azul-anticuerpo conjugado fluorescente anti-rata secundario (diluido en 150 l de tampón de bloqueo en el plato de 24 pocillos durante 1 hora a RT.
  3. Lavar los cubreobjetos tres veces. Detectar una gota (aproximadamente 3-6 l) de una solución de montaje que contiene antifade reactivo en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Invierta un cubreobjetos, con vistas al-células hacia abajo, hacia la solución de montaje. Limpie el exceso de líquido presionando suavemente el cubreobjetos contra la diapositiva utilizando tejido de limpieza suave. Aplicar esmalte de uñas transparente a lo largo del borde del cubreobjetos para sellarlo sobre el portaobjetos de microscopio.

5. La inmunofluorescencia Imagen acquisition y análisis

  1. Utilice un objetivo de inmersión en aceite 100X Plan de Apo (con una apertura numérica 1.4) para adquirir las imágenes de las células RPE1 BrdU-positivas a temperatura ambiente.
    1. Ponga un portaobjetos en el microscopio (ver equipos) adjunto con una cámara capaz de imagen digital. Para cada fluoróforo, determinar el tiempo de exposición apropiado (típicamente entre 300-1.000 mseg) manualmente mediante el examen de todas las muestras de un experimento. Antes de la adquisición de imágenes de una célula, determinar manualmente la parte superior apropiado y plano focal inferior a lo largo del eje Z (típicamente 0,2 m de tamaño de paso). Adquirir imágenes de diferentes muestras que están en cubreobjetos separadas utilizando el tiempo de exposición idénticos para diferentes fluoróforos a lo largo del eje Z utilizando un paquete de software de formación de imágenes de microscopía digital.
  2. Realizar deconvolución (en estos casos usando No algoritmo de vecino) de todas las pilas de imágenes adquiridas a lo largo del eje Z.
    1. Obtener la proyección total de intensidad de cada pila de imágenes a lo largo deel eje Z.
  3. En las células donde centrosomas están cerca (distancia entre dos centrosomas es inferior a 2 micras), dibuja un pequeño cuadrado (típicamente 20 a 30 píxeles por lado) alrededor de los dos centrosomas y marcar el área seleccionada.
    1. Dibuja un cuadrado más grande (por lo general 24 a 35 píxeles por lado) que rodea a la primera plaza y marcar el área seleccionada de la gran plaza.
    2. Obtener el área (A) y la intensidad de la fluorescencia total (F) de cada fluoróforo en cada caja (S denota pequeña caja y L denota caja grande).
    3. Analizar la corrección de fondo intensidad de la fluorescencia de cada fluoróforo utilizando la fórmula descrita por Howell et al. 29: F = F S - [(F L - F S) x A S / (A L - A S)].
    4. Obtener la intensidad de fluorescencia normalizada de la proteína de interés (aquí VDAC3 o SAS6) mediante el cálculo de la relación de la intensidad de fluorescencia de sus fl fondo corregidofluoróforo a la del fluoróforo utilizado para el estándar elegido interna (aquí γ-tubulina, SAS6 o Cep135).
  4. En el caso de análisis de las células donde centrosomas están bien separados (distancia entre dos centrosomas es mayor que 2 micras), analizar cada centrosoma separado trazando dos conjuntos separados de cajas. Dibuja un cuadrado pequeño (típicamente 15 a 25 píxeles por lado) alrededor de cada centrosoma y marcar el área seleccionada. Dibuja un cuadrado más grande (20 a 30 píxeles por lado) que rodea a la primera plaza y marcar el área seleccionada.
    1. Obtener el área (A) y la intensidad de la fluorescencia total (F) de cada fluoróforo en cada caja, y calcular las intensidades de fluorescencia con corrección de fondo de cada fluoróforo, por separado para cada centrosoma, como se describe en el paso 5.3.3.
    2. Combinar las intensidades de fluorescencia con corrección de fondo de cada proteína a partir de los dos centrosomas para obtener el nivel centrosomal total de esa proteína en esa célula.
    3. Obtenga elintensidad normalizada para la proteína de interés mediante el cálculo de la relación de su intensidad total de centrosomal a la intensidad centrosomal total del patrón interno.
  5. Analizar al menos 15 a 25 células para cada condición experimental y dibujar el gráfico en una hoja de cálculo.

6. Análisis de la proteína total usando Western Blot

  1. Resuspender las células en ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) mM tampón que contiene Tris-HCl 50 pH 8, NaCl 150 mM, 1% Nonidet P-40, 1% de desoxicolato de sodio, 0,1% de dodecil sulfato de sodio (SDS) y se incuba durante 10 min en hielo para lisar las células.
    1. Centrifugar la mezcla a 10.000 xg durante 10 min, separar el lisado de la fracción de sedimento y medir la concentración total de proteínas de cada lisado usando un kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA).
  2. Mezclar 40 g de lisado con 4x SDS-PAGE de tampón de carga (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% de glicerol, ditiotreitol 100 mM, 0,1% Bromophenol azul).
    1. Hervir las muestras durante 10 minutos y correr las muestras en un 12,5% de desnaturalización SDS-PAGE a una tensión constante de 200 V.
  3. Transferir las proteínas separadas en SDS-PAGE a una membrana de nitrocelulosa utilizando la técnica de Western Blot (a un voltaje constante de 90 V durante 1 hora en frío).
    1. Bloquear la membrana con leche desnatada al 3% en 1 x PBS, y luego se incuba la membrana con soluciones de anticuerpos primarios diluidos (en este caso de conejo anti-VDAC3, conejo anti-γ-tubulina y el ratón anti-α-tubulina) durante 1 hr a RT.
    2. Después de lavar la membrana tres veces (5 min cada incubación con agitación) usando tampón PBS-T (1x PBS y 0,2% Tween-20), incubar la membrana en una mezcla de infrarrojo cercano (IR) colorante fluorescente conjugado anti-conejo y tinte fluorescente IR anticuerpos secundarios anti-ratón conjugados (diluido en PBS-T) durante 1 hora.
    3. Lavar la membrana tres veces y luego escanear la membrana para analizar las bandas utilizando un f infrarrojossistema de imágenes luorescence adecuado para la detección de inmunotransferencia.

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Resultados

Nuestros estudios recientes identificaron novela localización centrosomal y la función de VDAC3, una de las porinas mitocondriales 16,28. La inmunotinción de varias células de mamíferos que incluyen células RPE1 utilizando un anticuerpo VDAC3 específica mostró prominente tinción centrosomal y comparativamente débil tinción mitocondrial. También demostramos que VDAC3 centrosomal se asocia preferentemente con el centríolo madre, y la piscina centrosomal tanto de la endógena y expresó ectópica VD...

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Discusión

Microscopía cuantitativa en biología celular se asocia comúnmente con los ensayos de formación de imágenes de células vivas, como Energía de Resonancia Fluorescente Transfer (FRET), la fluorescencia de recuperación después de photobleaching (FRAP), etc. Sin embargo, hay cada vez más ejemplos de los biólogos celulares en desarrollo diferentes ensayos de microscopía cuantitativos para fijo las células en los últimos años 27,34-36. Es importante destacar que, el progreso en la comprensió...

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Divulgaciones

The authors declare that they have no competing financial interests.

Agradecimientos

This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
FibronectinSigmaF8141Stock of 1 mg/ml in water
DMSOSigmaD2650
MG115SigmaSCP0005Stock of 10 mM in DMSO
BrdUSigmaB5002Stock of 10 mM in DMSO
Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)SigmaT 65571:200 in IIF blocking buffer 
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) Aviva Systems BiologyARP35180-P0501:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal) Santa cruz biotechnologysc-814311:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)Abcamab-750051:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal) Abcamab63261:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)Life technologiesA210931:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212021:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212031:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212061:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212071:1,000 in IIF blocking buffer
Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal)SigmaT51921:1,000 in WB blocking buffer
Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)SigmaT90261:20,000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Life technologiesA100431:10,000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW ConjugatedRockland antibodies610-731-0021:10,000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent Life technologiesS36936Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1Fisherbrand12-545-80
Olympus IX-81 microscopeOlympus
Retiga ExiFAST 1394 IR cameraQImaging 32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objectiveOlympus1.4 numerical aperture
Slidebook software packageIntelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging SystemLi-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assayThermo Scientific23227
U-MNU2 Narrow UV cubeOlympusU-M622Filter
U-MNU2 Narrow Blue cubeOlympusU-M643Filter
U-MNU2 Narrow Green cubeOlympusU-M663Filter

Referencias

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