Derivación de células cardiacas progenitoras a partir de células madre embrionarias

Resumen

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Resumen

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

Introducción

Las enfermedades del corazón siguen siendo la causa principal en el mundo de hoy y las tasas de mortalidad se han mantenido prácticamente sin cambios en las últimas dos décadas (American Heart Association). Hay una necesidad crítica para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para prevenir o revertir la insuficiencia cardíaca con eficacia. Una estrategia prometedora es la terapia basada en células tras el rápido desarrollo de la biología de células madre ^1. En este sentido, las CPC multipotentes podrían ser una fuente de células excelente para la terapia debido a su capacidad para proliferar, pero cometido sólo a la diferenciación de linaje cardiaco. Por lo tanto, el método eficiente y robusto para generar y aislar CPC es de gran importancia para los estudios de terapia celular cardiaca.

Este protocolo se centra en CPC embrionarias identificados durante la embriogénesis temprana y cómo su generación a partir de los CES. Varios CPC han sido aislados de corazones embrionarias y adultas, incluso desde médulas óseas ^2. Durante el desarrollo embrionario, morphoge huesoproteínas magnéticos (BMP), de tipo alas miembros de la familia del sitio de integración MMTV (Wnts) y nodal señales inducen el compromiso de la Mesp1 ⁺ mesodermo multipotentes ^3. Células Mesp1 ⁺ luego se diferencian en los CPC embrionarias ^4. Estos CPC están típicamente marcados por HCN4, NK2 homeobox 5 (Nkx2-5), Isl LIM homeobox 1 (ISL1), T-box 5 (Tbx5), y miocitos factor de promotor de 2C (MEF2C), forman campos cardíacos primarios y segundo, y contribuir a las partes principales de corazón durante cardiogénesis ^5-10. CPC Tanto Nkx2-5 ⁺ y ISL1 ⁺ / ⁺ MEF2C son capaces de diferenciarse en cardiomiocitos, células musculares lisas (CML), y células endoteliales ^5-8. Así, estas CPC dará lugar a la vasculatura cardiaca, así como tejidos cardíacos y son una fuente de células ideal para la terapia del corazón basado en células. En consecuencia, la generación de CPC in vitro ha sido un foco importante de investigación en estudios cardiovasculares. Desde CES tienen la expansión ilimitada capacidad de unnd representan las células ICM en la etapa de blastocisto, la diferenciación de los CES en CPC embrionarias después de la embriogénesis natural se considera un enfoque lógico y eficaz para obtener los CPC.

Un enfoque ampliamente aplicada para obtener los CPC de los CES es agregar los CES en EBS ^11. Para mejorar la eficiencia de diferenciación, se han utilizado factores químicos y de crecimiento definidos basados ​​en el conocimiento de desarrollo cardíaco ^12-14. Sin embargo, no hay marcadores CPC definitivas, en particular no hay marcadores de la superficie celular, que son ampliamente aceptados en el campo. Para solucionar este problema, los CES están diseñados para marcar ISL1 ⁺ o MEF2C CPC ⁺ y sus derivados con los reporteros fluorescentes utilizando el sistema Cre / loxP. La recombinasa cre es eliminado en bajo el control de ISL1 / MEF2C promotor / potenciador. Modificado RFP proteína fluorescente o un gen YFP impulsado por un promotor constitutivo se pueden activar por escisión de codón de parada flox con recombinasa cre(ISL1: cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP o RFP / ISL1 cre-; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP) ^5,6. Una vez que los CES se diferencian en CPC segundo campo corazón, ISL1 / MEF2C promotor / potenciador cre impulsado activará los reporteros fluorescentes y los CPC puede ser enriquecida por FACS-purificación. Brevemente, el método de agregación EB se utiliza para iniciar la diferenciación de ESC. Para mejorar la eficiencia de diferenciación, las células diferenciadas se tratan con ácido ascórbico (AA) y factores de crecimiento tales como Bmp4, activina A y VEGF ^13,15. Este protocolo permite robusto y eficiente la diferenciación CPC usando ratón y humanos CES.

Protocolo

1. Obtención de embriones de ratón con CPC de ratón CES

1. Preparar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) capa alimentadora.
   1. Medio MEF caliente (10% FBS en DMEM) a 37 ° C.
   2. Preparar placas recubiertos con gelatina.
      1. Añadir 1 ml de 0,1% de gelatina en agua en un pocillo de una placa de 6 pocillos o 5 ml en una placa de 10 cm.
      2. Deja placas o platos a 37 ° C o temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Aspirar la gelatina antes de su uso.
   3. Descongele irradiado MEFs rápidamente en un baño de agua a 37 ° C, con agitación suave.
   4. Transferencia de las células suavemente a un tubo cónico de 15 ml o 50 ml. Añadir 5 ml de medio MEF pre-calentado. Agitar lentamente las células y centrifugar a 200 xg durante 5 min.
   5. Resuspender las células en medio MEF y contar las células viables. Utilice los siguientes volúmenes de medio MEF: 2 ml de células por pocillo de una placa de 6 pocillos y 10 ml para las células de una placa de 10 cm.
   6. Las células de la placa en placas de 6 pocillos o placas de 10 cm a 2.1x 10 ⁶ por placa / placa.
   7. Incubar las placas MEF / platos a 37 ° C, 5% de CO ₂ al menos 24 horas antes de su uso.
      NOTA: Deseche las placas MEF / platos de más de una semana.
2. Preparar ratón CES
   1. Cultura del ISL1 cre-; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP ratón CES en MEFs hasta 90% de confluencia. Medio de células ES Uso compuesta de 410 ml de DMEM, 75 ml de FBS, 0,1 mM MEM NEAA, 2 mM L-glutamina, 0,1 mM de piruvato, 100 U Pen / Strep, y 0,1 mM β-mercaptoetanol.
   2. Preparar placas de 6 pocillos recubiertos con gelatina como se describe en 1.1.2.
   3. Aspirar medio de placas y enjuague células con DPBS.
      1. Aspirar DPBS y añadir 0,4 ml de 0,25% de tripsina en un pocillo de placa de 6 pocillos. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 5 min. Añadir 1 ml de medio ES pre-calentado a cesar reacción tripsina.
   4. Células Cosecha y centrifugar las células a 200 xg y aspirar medio. Resuspender las células en 1 ml de medio de células ES y contar las células.
   5. CES placa en placas recubiertas de gelatina en densidad de 3 x 10 ⁴ / cm ^2. Incubar a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante aproximadamente 2 días en que los CES alcanzan aproximadamente 90% de confluencia. Cambie el medio cotidiano.
   6. Cuando los CES son 90% de confluencia, repita los pasos 1.2.2-1.2.5 para eliminar por completo los alimentadores del MEF.
3. Inducir CPC diferenciación por la formación EB
   1. Preparar medio de diferenciación como sigue: 36 ml de IMDM, 12 ml F12 de Ham, 2 mM L-glutamina, 0,34 ml de BSA (7,5%), 0,25 ml N2, 0,5 ml B27, 50 mg / ml AA, y 0,45 mM 1-tioglicerol.
   2. Aspirar medio de las células y enjuague con DPBS. Aspirar DPBS y añadir 0,4 ml de 0,25% de tripsina en un pocillo de placa de 6 pocillos. Incubar a 37 ° C durante 5 min.
   3. Añadir 1 ml de medio de diferenciación que cese la reacción y la pipeta hacia arriba y abajo para dispersar a grupos de células en células individuales.
   4. Centrifugar los CES a 200 xg durante 5 minutos y utilizar el medio.
      1. Resuspender 1 x 10 ^{6 <}/ Sup> CES de 1 ml de medio de diferenciación. Contar las células, y cultivar las células en condiciones de poca desprendimiento placa Petri a una concentración de 1 x 10 ⁵ células / ml en medio de diferenciación a 37 ° C para la primera agregación EB.
   5. Dos días después de la formación de EB, EB transferir desde platos de tubos de 50 ml. Haz girar a 200 xg durante 1 min. Retire medio y enjuague EBS con 10 ml de DPBS sin Ca2 ⁺ y Mg2 ^+.
   6. Aspirar DPBS y añadir 1 ml de 0,25% de tripsina. Incubar a 37 ° C durante 5 min. Añadir 4,5 ml de medio de diferenciación para detener la reacción. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para disociar EBS en células individuales.
   7. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min. Células medianas y volver a suspender las Aspirar en 1 ml de medio de diferenciación.
   8. Contar las células, y se diluye 2 x 10 ⁶ células a 1 x 10 ⁵ células / ml en medio de diferenciación. Añadir VEGF, Bmp4 y activina A al medio a una concentración final de 5 ng / ml, 0,8 ng / ml, y 5 ng / ml, respectivamente. Culture las células en una placa de Petri para la segunda formación de EB a 37 ° C.
   9. 40 horas después de la segunda formación de EB, EB transferir a tubos de 50 ml. Enjuague con DPBS una vez, disociar EBS con 1 ml de tripsina 0,25% a 37 ° C durante 5 min. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para disociar EBS en células individuales.
   10. Resuspender las células en StemPro-34 medio con 5 ng / ml de VEGF, 10 ng / ml de bFGF y 12,5 ng FGF10 / ml. Placa de las células a 2 x 10 ⁵ / cm ² en placas recubiertas con gelatina. Cultura en incubadora a 37ºC durante aproximadamente 32 horas antes del aislamiento del PCCh.
4. Aislar mCPCs
   1. Aspirar medio y enjuague con DPBS. Añadir 0,5 ml 0,25% de tripsina a las placas de cultivo a 37 ° C durante 5 min. Añadir 4,5 ml de medio de diferenciación para detener la reacción. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para disociar EBS en células individuales. Recoger las células por centrifugar las células y volver a suspender en el 2% de FBS / PBS para FACS-purificación.
   2. Ejecutar CES indiferenciadas en clasificador como control negativo. Cambio de tensión para ajustar el scat adelanteter (FSC) y la dispersión lateral (SSC) para seleccionar la población deseada. Utilice adelante dispersar frente a dispersión lateral y altura de dispersión hacia adelante frente a la anchura de excluir escombros y doblete. En la sub-población seleccionada, de acuerdo con la distribución de los controles de la ESC, dibuja una puerta de YFP positivo en histograma para eliminar la autofluorescencia celular. Recoger YFP ⁺ CPC de YFP ⁺ gating.
   3. Placa de los CPC purificados (células YFP ⁺⁾ en placas de 6 pocillos con medio de diferenciación (1.3.1). Cultura adicionales 3-5 días a 37 ° C para la diferenciación de los CPC en cardiomiocitos y SMC.

2. Derivación de Human Embryonic CPC de los CES Humanos

1. Preparar Alimentadores
   1. Preparar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) capa de alimentación como se describe anteriormente a una densidad de 2 x 10 ⁴ / cm ^2.
2. Mantener humanos CES
   1. Mantener ISL1 humana: cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP o RFP CES rutinariamente en MEF utilizando medio hESC regular (Knockout DMEM / F-12 385 ml, Knockout SR 100 ml, 2 mM L-glutamina, 0,1 mM NEAA, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 10 ng / ml de FGF básico). Antes de la diferenciación cardiaca, transferir los CES humanos en condición libre de alimentador de por lo menos 2 pasajes.
3. Preparar los CES humanos en condición libre alimentador
   1. Preparar placas recubiertas para la cultura humanos CES.
      1. Descongele matrigel a 4 ° C durante la noche. Poner un tubo de 50 ml en hielo y añadir 30 ml de medio DMEM / F12 frío en el tubo.
      2. Añadir 1 ml de matrigel en el medio fría y mezclar bien. Añadir 1 ml de frío matrigel-DMEM 12 media / en un pocillo de una placa de 6 pocillos o 5 ml en una placa de 10 cm.
      3. Deja placas / platos a 4 ° C durante la noche o la temperatura ambiente durante 2 horas. Aspirar medio antes de su uso.
   2. Dividir humanos CES sobre las placas: Aspirar los medios de placa MEF y enjuague humanos CES con DPBS. A continuación, añadir 1 ml de dispasa (1 mg / ml) a un pocillo de placa de 6 pocillos. Se incuban las células en 37 ° Cincubadora hasta que los bordes de las colonias empiezan a separar.
   3. Retire la solución dispasa. Enjuague con DPBS dos veces, a continuación, añadir 2,5 ml / por medio bien mTeSR o medio MEF acondicionado a la placa.
   4. Raspe las células utilizando un rascador de células y cuidadosamente pipetear arriba y abajo para romper CES colonias humanas en pequeños grupos.
   5. La transferencia de los macizos del CES y diluir 1: 3 en las placas recubiertas.
   6. Añadir 2 ml / pocillo medio mTeSR o medio MEF acondicionado y cambiar a medio día.
   7. Cultura CES humanos en medio mTeSR o medio MEF acondicionado en placas recubiertas durante al menos 2 pasajes.
4. Inducir CPC diferenciación de los CES humanos
   1. Cuando las células son ~ 90% de confluencia, aspirar el medio y enjuague con DPBS. Entonces se incuban las hESCs en 0,5 mg / ml Dispasa a 37 ° C durante 20 min.
   2. Enjuagar los hESCs con DPBS dos veces, eliminar las células a partir de placas con un levantador de célula, a continuación, volver a suspender las abrazaderas de células en medio de diferenciación (DMEM / F12 que contiene 18% de FBS, 0,1 mM NEAA, 2 mML-glutamina, 0,1 mM β-mercaptoetanol y 50 mg / ml de ácido ascórbico).
   3. Transferir las células en placas de fijación ultra-bajas de 6 pocillos para la formación de EB.
   4. Cambie medio de diferenciación día siguiente.
   5. Reemplace medio cada 3 días y mantener EBS en cultivo en suspensión.
5. Aislar HCPCS
   1. Recoger EBS a más tardar el día 9 de diferenciación para el aislamiento CPC humano.
   2. Aspirar medio y enjuague EBS con DPBS dos veces. Añadir 0,5 ml 0,25% de tripsina a cada pocillo de placas de cultivo de 6 pocillos a 37 ° C durante 5 min.
   3. Añadir un volumen igual de medio de diferenciación para detener la reacción. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para disociar EBS en células individuales. Recoger las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min y resuspender las células en 2% FBS / DPBS. Las células de filtro con filtro celular 40 micras y purificado FACS el PP ⁺ células CPC como se describe en 1.4.3.
   4. Plate ordenadas HCPCS sobre las placas geltin-revestido. HCPCS Cultura en medio de diferenciación para 7-9 Días para diferenciarse en células de cardiomiocitos y el músculo liso. 7 días después de la siembra, cultivo de células con 5% Knockout SR en medio DMEM / F12 diferenciado.

Resultados

El protocolo muestra derivación de CPC de varias líneas de células ES. CES se agregan para formar EBS para diferenciarse en los CPC. CES se mantienen rutinariamente en alimentadores MEF (Figura 1A, F) y alimentadores se eliminan antes de la diferenciación. Tras la agregación de los CES en EBS en medio de diferenciación (Figura 1B, g), la segunda EBS formados se tratan con Bmp4 y activina A para mejorar la diferenciación del mesodermo en líneas celulares de ratón (Figura...

Discusión

This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
FBS	Thermo scentific	SH30070.03E
Knockout SR	Life technology	10828028
Knockout DMEM	Life technology	10829018
DMEM	Life technology	11965118
NEAA	Life technology	11140050
GlutaMAX	Life technology	35050061
N2	Life technology	17502048
B27	Life technology	12587010
Ham’s F12	Life technology	11765062
IMDM	Life technology	12440061
Pen/Strep	Life technology	15140122
Pyruvate	Life technology	11360070
Dispase	Life technology	17105041
Stempro-34	Life technology	10639011
DMEM/F12	Life technology	11330032
BSA	Life technology	15260037
Trypsin	Life technology	25200056
Ascobic Acid	Sigma	A5960
1-Thioglycerol	Sigma	M1753
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
VEGF	R&D	293-VE
Bmp4	R&D	314-BP
ActivinA	R&D	338-AC
bFgf	R&D	233-FB
Fgf10	R&D	345-FG
mTeSR	Stemcell technologies	5850
Matrigel	BD Biosciences	354277