El uso sinérgico de las células precursoras neuronales y Péptidos de autoensamblaje en Experimental cervical Lesión de la Médula Espinal

Resumen

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

Resumen

Lesiones de la médula espinal (SCI) causan deterioro neurológico grave y las consecuencias psicológicas, económicas y sociales para los pacientes y sus familias. Clínicamente, más de 50% de SCI afecta a la columna cervical ^1. Como consecuencia de la lesión primaria, una cascada de mecanismos secundarios incluyendo la inflamación, apoptosis, y la desmielinización se producen finalmente conduce a la cicatrización de tejidos y el desarrollo de cavidades intramedulares ^2,3. Ambos representan barreras físicas y químicas en el trasplante de células, la integración, y la regeneración. Por lo tanto, la configuración del entorno inhibitorio y la reducción de cavidades para crear un medio de apoyo para el trasplante de células y la regeneración es un objetivo terapéutico prometedor ^4. Aquí, se describe un modelo de contusión / compresión del SCI cervical usando un clip de aneurisma. Este modelo es más clínicamente relevante que otros modelos experimentales, ya que la transección completa o rupturas del cable son raros. También en COMPARACIÓNn para el modelo de caída de peso, que, en particular, el daño de las columnas dorso, la compresión circunferencial de la médula espinal parece ventajoso. Fuerza de cierre de clip y la duración se puede ajustar para lograr gravedad de la lesión diferente. Un muelle de anillo facilita la calibración precisa y la constancia de la fuerza clip. En condiciones fisiológicas, los péptidos de autoensamblaje sintéticos (SAP) auto-ensamblarse en nanofibras y, por tanto, están haciendo un llamado para la aplicación en SCI ^5. Ellos pueden ser inyectados directamente en la lesión minimizar daños en el cable. PAE son estructuras biocompatibles erigir andamios para colmar cavidades intramedulares y, por tanto, equipar el cable dañado por tratamientos regenerativos. K2 (QL) 6K2 (QL6) es una novela SAP introducido por Dong et a l. ⁶ En comparación con otros péptidos, QL6 auto-ensambla en β-hojas a pH neutro ⁶ 0,14 días después de la lesión, después de la fase aguda, los PAE se inyectan en el centro de la lesión y las células precursoras neurales (NPC) son injected en columnas dorsales adyacentes. Con el fin de apoyar la supervivencia celular, el trasplante se combina con la administración subdural continua de factores de crecimiento por medio de bombas micro osmóticos para 7 días.

Introducción

Más del 50% de las lesiones de la médula espinal están relacionadas con la columna cervical. En el contexto clínico dos principales mecanismos fisiopatológicos se describen: la contusión inicial de la médula espinal y posteriormente, la compresión en curso causada por fracturas de huesos, hemorragias o inflamación del tejido.

El clip de aneurisma imita contusión modelo / compresión de ambos mecanismos fisiopatológicos: rompiendo el clip produce una contusión y la duración de recorte representa el componente de compresión, admitiendo que la compresión en entornos clínicos causados ​​por fracturas de huesos, hemorragias o hinchazón de los tejidos última significativa más tiempo. El clip de aneurisma utilizado es modificado por un resorte anillo garantizando la fuerza exacta y reproducible de recorte. Sobre todo en comparación con el hemi-transección o el modelo de contusión, este clip de aneurisma imita modelo mejores entornos clínicos. Mientras que los pacientes con lesiones torácicas sufren de paraplejía, la mayoría de los pacientes con inj cervicaluries son tetrapléjico y completamente dependiente. La estructura anatómica de la médula cervical, sin embargo, muestra diferencias significativas en comparación con el dorsal o lumbar, y por lo tanto, se trata en particular, en este protocolo.

El desarrollo de cavidades intramedulares y cicatrices en los tejidos son obstáculos para la recuperación y regeneración. Para superar estas barreras el uso de material de soporte es un enfoque prometedor. Péptidos de autoensamblaje pueden inyectarse directamente en el epicentro de la lesión. Allí se ensamblan para formar andamios nano-fibra puente de la cavidad y mejorar el medio ambiente inhibitorio al reducir la inflamación y cicatrización de los tejidos. Mientras que los materiales rígidos causan un daño considerable de la médula espinal durante la implantación, los péptidos de fluidos pueden ser inyectados de forma segura y sin daño adicional grave.

La mejora del entorno inhibitorio con péptidos auto-montaje antes del trasplante de células madre, por lo tanto, apoyar la celda iNTEGRACIÓN, la diferenciación y, finalmente, la recuperación funcional, después de la lesión de la médula espinal cervical.

Protocolo

NOTA: El siguiente protocolo experimental fue aprobado por el comité de cuidado de los animales de la Red de Salud de la Universidad (Toronto, Canadá) y está de acuerdo con las políticas establecidas en la guía para el cuidado y uso de animales de experimentación preparados por el Consejo Canadiense de cuidado de los animales .

1. Cervical Contusión Aneurisma Clip / Compresión Modelo

1. Antes de instrumentos de autoclave de cirugía y mantener condiciones estériles durante todo el procedimiento surgcial poniendo los instrumentos en un baño de alcohol al 70%.
2. Anestesiar ratas Wistar (250-270 g) con una combinación de oxígeno (O _2), óxido nitroso (N ₂ O) (1: 1), y 1.8 a 2.2% isoflurano y apoyar la respiración espontánea a través de una máscara de anestesia de gas. Para la inducción de la anestesia comenzar con 5% de isoflurano durante 1 minuto y reducir después. Antes de comenzar la cirugía, la profundidad de control de la anestesia dando un estímulo doloroso (por ejemplo. En las patas). Aplicar pomadas grasasen los ojos para evitar la sequedad y para prevenir las infecciones posteriores.
3. Poner las ratas en un cojín de calentamiento (37 ° C) y fijar la cabeza en un marco estereotáctico.
4. Afeitarse la región quirúrgica alrededor de la columna vertebral cervical y desinfectar con yodo povidona y 70% de alcohol.
5. Hacer una incisión en la línea media por encima de la columna vertebral de la vértebra cervical (C2) que llega hasta el processus prominente del cuerpo vertebral torácica 2 (T2).
6. Corte a través de la capa externa de los músculos vertebrales directamente en la línea media (para evitar el sangrado) en una dirección cráneo-caudal y más diseccionar las capas musculares más profundas sin rodeos hasta llegar a la spinosus processus y las láminas. Inserte retractores.
7. Orientar la spinosus processus prominente de la T2 cuerpo vértebra para observar los niveles previstos para laminectomía. Después de la identificación y preparación micro-quirúrgica de las láminas seleccionado, cortar a través de la flavae ligamenti para aflojar las láminas y la spinosus processus. Por último, cut a través de las láminas con un lateral de las podadoras de hueso a la médula espinal y eliminar aquellos suavemente, evitando cualquier compresión de la médula espinal en sí.
   NOTA: Los más comunes son los niveles C5 / 6, C6 / 7, o C7 / T1. La tasa de mortalidad perioperatoria aumenta cuanto más rostral del nivel de la lesión. Sangrado del seno venoso paravertebral es común y puede abordarse mediante la compresión cuidado con esponja.
8. Antes de insertar el clip para traumatizar el cable, identificar nuevas raíces nerviosas para librarlos de recorte (especialmente a nivel C5 / 6).
9. Con el fin de garantizar el buen inducción clip, aflojar la duramadre ventral de la cara dorsal de los cuerpos vertebrales con un gancho y preparar un corredor para el clip.
10. Por último, inserte el clip abierto y dejar que se cierran de golpe (cierre rápido) para lograr una lesión por contusión. Fuerza de cierre del clip y la duración de cierre de clip determinan la intensidad del trauma y el grado de compresión. Comúnmente utilizados son fuerzas de clip de entre 15 a 35 g y un clipping duración de, por ejemplo 1 min. (Figura 1).
11. Después de la retirada de la pinza, adaptar músculos de 2 capas y cerrar la herida.
12. Deje de anestesia y deja la estela de los animales bajo su observación continua hasta que se recupera la conciencia suficiente para decúbito esternal. Por último, poner la rata en una jaula individual y seguir las pautas de tratamiento post-operatorio.
13. Puesto que los animales luchan con la gravedad de este tipo de lesión, debe prestar especial atención a los tratamientos post-operatorios:
    1. Administrar analgésicos (buprenorfina y meloxicam durante 3 días y 5 días, respectivamente y según los síntomas clínicos).
    2. Dé subcutánea solución salina adicional para 3 días (2 veces al día, 5-10 mililitro (ml)).
    3. Proporcionar antibióticos en el agua de bebida 2 días antes y hasta 7 días después de la cirugía (por ejemplo Moxifloxacina)
    4. Apriete la vejiga urinaria 2-3 veces al día hasta que la recuperación de la función de la vejiga es constanteLy aparente.
    5. Observar los déficits neurológicos y estado fisiológico de los animales operados por lo menos una vez al día.

2. La inyección de los PAE y NPCs (14 días después de la lesión)

1. Inducir la anestesia como se describe en 1.1. a 1,3, fijar la cabeza de la rata en un marco estereotáxico, retire los puntos de sutura o grapas de la herida, y desinfectar la herida y el área quirúrgica con povidona yodada y el 70% de alcohol.
2. Diseccionar cuidadosamente los músculos paravertebrales, inserte retractores, eliminar el tejido cicatrizal microscópicamente de la duramadre, y volver a exponer el sitio de la lesión.
3. Preparar los PAE en una concentración de 1% (w / v) para realizar un gel de matriz extracelular. PAE QL6 tienen un pH fisiológicamente compatibles y no necesitan ser tamponada antes de la inyección. Para la visualización de los PAE en la médula espinal, utilizar un derivado fluorescente de QL6 (QL6-FITC).
4. Inyectar PAE (5 microlitros (l) en el centro de la lesión, distribuidos en 2 porciones, cada uno2,5 l bilateral de la línea media. Utilice una jeringa Hamilton conectado al marco estereotáctico con un micro capilar de vidrio (100 micrómetros (micras) de diámetro exterior (OD)). Abrir la duramadre cuidadosamente con la punta de una aguja afilada, e insertar el capilar de vidrio estereotácticamente 2 milímetros (mm) en la médula espinal traumatizada.
5. Después de la inyección de un tercio del volumen, retire la aguja de 1,5 mm de profundidad, y después de otros 1/3 a 1 mm. Después de la inyección de todo el volumen, y antes de la retirada de la jeringa, esperar 5 minutos para estabilizar la formación de gel.
6. Para generar NPCs, utilizar ratones adultos DsRed (o YFP ratones positivos, verde) y aislar y cultivar ellos desde la zona paraventrical ^4,18,21.
7. Evaluar la viabilidad de NPC por tinción de azul de tripano que indican la presencia de ~ 90% de células vivas en la suspensión celular. Diluir las células en medio de crecimiento (50 x 103 células vivas / l) y luego usarlos para el trasplante de células.
8. Haga cuatro 2 l (8 l vo total delume, que contiene 4 x 10 ⁵ NPCs) inyecciones intraespinales bilateralmente a los 2 mm rostral y caudal de la zona de la lesión. Después de la apertura de la duramadre, inserte el micro capilar de vidrio Hamilton 1,5 mm por debajo de la superficie dorsal de la médula espinal e inyectar 2 l de la suspensión celular. Elija una velocidad de inyección a aproximadamente 0,5 l / min (min).
9. Al final de cada inyección y antes de la retirada del capilar de la cuerda, espere por lo menos 1 min permitiendo que el tejido se extiende para acomodar el nuevo volumen de la celda. (Figura 2)

3. Implantación de subdural Bombas para el Factor de Crecimiento de aplicaciones

1. Con el fin de enriquecer el fluido espinal cerebral (CSF) con factores de crecimiento apoyar la supervivencia celular, usar bombas de micro-dilución osmótica factores de crecimiento sub-durally largo de 7-14 días, con una tasa de dilución de 0,5 l / h, un diámetro de catéter de 0,04 cm OD, y un volumen de embalse de 100 l.
2. Elija factores de crecimiento preferidas(Por ejemplo, el factor de crecimiento derivado del cerebro (BDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)), llenar las bombas 6-10 hr implantación previa, y equilibre las bombas en un baño de agua a 37 ° C.
3. Inmediatamente después de las inyecciones de la APN, preparar una cavidad subcutánea para colocar la bomba. Lugares preferidos son los flancos laterales de toracolumbar región abdominal evitando importante malestar local causado por la propia bomba.
4. Para obtener la mayor concentración de factores de crecimiento, asegúrese de que la punta abierta del catéter termina cerca del lugar de la lesión. Por lo tanto, realice un salto-laminectomía del nivel superior o inferior adyacente. Por ejemplo, si el SCI es en C7 / T1, realizar una pequeña laminectomía de C5.
5. Ponga la bomba en el hueco subcutáneo, acortar el catéter a la longitud necesaria, y seguro que con varias suturas (6.0) en los músculos paravertebrales, evitando cualquier movimiento luxación asociada.
6. Después de abrir la duramadre (por ejemplo, en C5) con la punta afiladade una aguja, introducir el catéter en el espacio subdural y dejar que se deslice en una dirección caudal sin ninguna resistencia y sin dañar el cable. La lámina omitido de, por ejemplo C6 sirve punto de fijación y estabilización del catéter adicional.
7. Asegúrese de que el catéter se ejecuta sin problemas y no se pliega.
8. Cerrar músculos por capa, y la piel, con suturas o grapas. (Figura 3)
9. Deje de anestesia y deja la estela de los animales bajo su observación continua hasta que se recupera la conciencia suficiente para decúbito esternal. Por último, volver a ponerlos en una sola jaula y seguir las pautas de tratamiento post-operatorio.
10. Proporcionar tratamiento postoperatorio especial, a pesar de que, los animales podrían haber recuperado en parte en este punto del tiempo:
    1. Administrar analgésicos (Buprenorthine y meloxicam durante 3 días y 5 días, respectivamente y según los síntomas clínicos).
    2. Proporcionar antibióticos en las botellas de agua 2 días antes hasta7 días después de la cirugía (por ejemplo Moxifloxacina).
    3. Siga apretando la vejiga urinaria, si sigue siendo necesaria.
    4. Déle líquidos subcutáneos adicionales, si las ratas parecen deshidratado.
    5. Mantenga la observación de la función neurológica y la condición fisiológica de los animales operados al menos una vez al día.
    6. Administrar tratamiento inmunosupresor 2 días antes de la inyección de la APN y hasta 7 días después transplanation (minociclina) y hasta el sacrificio (Sandimmune), respectivamente.

Evaluación 4. Tejido

1. Sacrificar los animales en el final del tiempo de observación (por ejemplo. 4 semanas después de SCI) en anestesia profunda (5% de isoflurano durante 2-3 min) y perfundir ellos transcardially con 50 ml de frío (4 ° C) solución salina seguido por 150 ml de frío 4 % de paraformaldehído en 0,1 M de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Retire la médula espinal y lo puso en el 4% de paraformaldehído en 0,1 M de buffer fosfato salino (PBS) durante 24 horas.
3. Poner la médula espinal en solución de sacarosa al 25% para crioprotección durante 48 horas.
4. Proporcionar cryosections longitudinales con un espesor <30 micras.
5. Para la tinción inmunohistoquímica de todos los celulares de los núcleos que proporcionan un uso del fondo DAPI (1: 1000). NPCs DsRed positivos aparecen rojos, QL-6 FITC aparece en verde, y ambos lo tanto no necesita ser manchado especialmente. (Figura 4).
6. Por microscopía electrónica de barrido (SEM) permiten muestras remojo en glutaraldehído a 4 ° C durante 2 horas, se deshidratan lentamente en pasos de 10% de incremento de etanol durante 5 minutos y los colocan en un líquido presurizado CO ₂ sifón durante 1 hora. Andamios capa con oro utilizando un dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica. Tome imágenes con un microscopio electrónico de barrido Hitachi S-3400N. (Figura 5)

Resultados

Al realizar el procedimiento anteriormente descrito, obtendrá un andamio SAP cerrar la cavidad y que ofrece una mejora del medio ambiente inhibitorio, menos cicatrización del tejido y un aumento en la supervivencia NPC. Figura 4 muestra una sección longitudinal de una médula espinal de rata obtenido en el sitio de la lesión 6 semanas después de SCI y 4 semanas después de la inyección QL6 SAP y NPC trasplante. Péptidos QL6 fueron inyectados con éxito en el cable, agregada en el epicentro ...

Discusión

Este protocolo ha sido desarrollado para permitir al lector a realizar un modelo de lesión cervical en ratas y de utilizar un enfoque de tratamiento combinado con programas de ajuste estructural y NPCs que promueven una mejor recuperación después de la lesión cervical.

En particular, en comparación con otros modelos de trauma cervical, como la (hemi) -transection modelo o los modelos de caída de peso y de concusión, el modelo de clip contusión / compresión representa tanto principal...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aneurysmal clip	SharpTech
Surgical microscope	Leica
Micro injection system	World Precision Instruments, Inc.
Small animal stereotaxic instrument	David Kopf Instruments
Hamilton syringe	Hamilton company
Subdural pumps	Alzet osmotic micro pump 1007D
Surgical instrument	Fine Science tools
Isoflurane USP	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.
0.9% Sodium Chloride injection USP	Baxter
7.5% Povidone iodine	Purdue Pharma
70% Isopropyl alcohol USP	GreenField Ethanol Inc.
QL6 SAP	Covidien
0.4% Trypan blue	Gibco
Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)	Sigma
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma
Fibroblast Growth Factor (FGF)	Sigma