Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

Resumen

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Resumen

Procesos inherentes al desarrollo de pupa Drosophila pueden cambiar y distorsionar el epitelio del ojo de manera que tengan el comportamiento de células individuales difíciles de rastrear durante imágenes de células vivas. Estos procesos incluyen: la rotación de la retina, el crecimiento celular y el movimiento del organismo. Además, las irregularidades en la topología del epitelio, incluyendo golpes sutiles y se pliega a menudo presentados como la pupa se prepara para la imagen, hacen que sea difícil de adquirir imágenes en foco de más de unos pocos ommatidia en un solo plano focal. El flujo de trabajo describe aquí remedios estos temas, lo que permite un fácil análisis de procesos celulares durante el desarrollo del ojo Drosophila pupa. Pupas adecuadamente organizado, están dispuestos en una plataforma de imágenes que se pueden montar fácilmente en la mayoría de los laboratorios de la ubiquitina-DE-cadherina:. GFP y GMR-GAL4 impulsada UAS-α-catenina: GFP se utilizan para visualizar los límites celulares en el epitelio del ojo ^{1 -3.} Después de deconvolución esaplicado a las imágenes fluorescentes capturados en múltiples planos focales, las imágenes de proyección máxima se generan para cada punto de tiempo y mejorar el uso de software de edición de imágenes. Algoritmos de alineación se utilizan para estabilizar rápidamente el movimiento superfluo, haciendo que el comportamiento célula individual más fáciles de seguir.

Introducción

El compuesto Drosophila ojo se caracteriza por la disposición de sus estereotipada ~ 750 ommatidia separadas por un panal de celosía de las células de pigmento de accesorios ^4,5. Estas células pigmentarias se modelan mediante una combinación coordinada de eventos: los movimientos celulares locales, el crecimiento celular, los cambios en la forma celular y la apoptosis. La visualización en directo de este epitelio permite estudiar los mecanismos moleculares que sustentan estos eventos en un contexto tridimensional fisiológicamente relevante e imperturbable.

En contraste con los protocolos anteriores ^6,7, la técnica descrita aquí incorpora un método eficaz para estabilizar el movimiento tejido extraño que no puede ser desacoplado del proceso de formación de imágenes. Este método mejora estudios de comportamiento de las células en el desarrollo de Drosophila epitelio ojo pupal - un tejido que crece, gira, y los cambios en el curso de formación de imágenes. Además, el movimiento de estabilización técnica dedescrito aquí será de gran utilidad para el estudio de las células en otros contextos donde se produce el movimiento extraño.

Para visualizar límites de las celdas en el campo de la retina Drosophila, líneas de moscas transgénicas se generaron que expresan ubi-DE-cadherina: GFP, así como UAS-α-catenina: GFP bajo el control del controlador de ojos específica GMR-GAL4 ^1-3. El uso de dos marcadores de membrana GFP-etiquetados permite la visualización de límites de las celdas en la luz de menor intensidad. Esto minimiza el daño tisular y photobleaching en la exposición repetida a longitudes de onda de alta energía, lo que permite una mayor velocidad de fotogramas y la duración de la película. Para mejorar la eficacia de los transgenes RNAi, UAS-DCR-2 también se incorporaron a una segunda línea de la mosca ^8.

En una tercera actualización de los protocolos anteriores, un equipo de formación de imágenes más simple que se monta fácilmente en la mayoría de los laboratorios se describe. Este aparato evita la necesidad de tener una imagen especializada rig genera de una universidad 'tienda de máquina o un servicio similar. Este aparejo de formación de imágenes es similar a la utilizada para otros tejidos imagen pupal ^9,10.

Se presenta aquí es un simple protocolo de imágenes de células vivas que se puede utilizar para evaluar directamente los eventos morfogenéticos que contribuyen a modelar el ojo del ~ 17 a 42 horas después de la formación pupario (hr APF). En concreto, este protocolo permite a uno para determinar las consecuencias de la modificación de la expresión génica durante el desarrollo pupal.

Protocolo

La Figura 3 muestra un resumen del procedimiento experimental.

1. Preparación del tejido

1. Para determinar las consecuencias de la expresión modificada de un gen de interés, establecer la siguiente cruz por duplicado y se mantiene a 25 ° C: UAS transgenes (machos) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6B (hembras vírgenes) NOTA: Para obtener el control cruzado tejido UAS-lacZ varones de GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: hembras GFP. β-galactosidasa no genera defectos en el comportamiento celular en la retina.
2. Para mejorar la eficacia de los transgenes RNAi, cruz UAS-RNAi varones de GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6B hembras vírgenes.
   NOTA: defectos ocasionales en el comportamiento de células que expresan en retinae se han observado ectópico DCR-2 (datos no mostrados). La vigilancia se recomienda si el uso de este enfoque.
3. Selecto blanco pre-pupas de genotipos adecuados y colocar en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Si el pupas expresar DCR-2, seleccione pupas ya sea hombre o mujer: expresión de UAS-DCR-2, una inserción en el cromosoma X, es más fuerte en los hombres. Las pupas se debe sexuado a 0 h APF antes de la pigmentación de la envoltura pupal - las gónadas de los machos se ven como grandes globos translúcidos en los lados laterales de la pupa (aproximadamente un tercio de la parte posterior).
4. Incubar los tubos de microcentrífuga que contienen pupas, en un plástico punta-caja limpia a 25 ° C. Para evitar la desecación de lugar pupas a 10 cm ² de tejido, empapado en agua destilada, a la caja de punta.
   NOTA: si la humedad en la caja de la punta es demasiado alta el caso de pupa puede llegar a ser empapado y difícil de diseccionar en los pasos posteriores.
5. Incubar durante el tiempo adecuado. Para capturar comportamientos celulares asociadas con modelar el ojo, preparar pupas para imágenes en torno a 17 horas APF, APF 20 horas o 24 horas APF. Ver representativos Resultados para mayor discusión sobre si se respetan mejor los comportamientos específicos de células.
6. Coloque un pedazo de cinta adhesiva de doble cara fresca en un plato de disección Sylgard negro. Coloque un lado pupa, dorsal hacia arriba, con la cabeza de la pupa adherido a la cinta de doble cara (Figura 1A) .Try no se adhieren las regiones torácica y abdominal de la pupa a la cinta de doble cara. Con pinzas levante con cuidado y quitar el opérculo para exponer la cabeza de pupa. Tear a lo largo del lado de la caja de pupa para exponer el área alrededor de un ojo.
7. Retire con cuidado la pupa de la cinta adhesiva. Si la pupa permanece adherente, aplicar un pequeño volumen de agua destilada a la unión entre el caso pupal y la cinta para debilitar la adhesión.

2. Montaje

1. Construir una pequeña 15 mm ² marco de papel secante y perforar un agujero en la middlethat es de 5,5 mm de diámetro (Figura 1B). Sumergir en agua destilada y colocar enel centro de un portaobjetos de microscopio. Con una jeringa de 30 cc, exprima un anillo uniforme de vaselina para rodear el marco de papel secante. Asegúrese de que el anillo de vaselina es ligeramente mayor que la anchura de la pupa y que el diámetro del anillo es ligeramente menor que la anchura de una hoja de cubierta.
2. Añadir una pequeña gota de vaselina directamente sobre la diapositiva, en el agujero perforado en el papel secante (Figura 1C) .Carefully organizar la pupa, por su parte, con el apoyo de la perla de vaselina (Figura 1D).
3. Coloque un cubreobjetos en la parte superior del anillo de la jalea de petróleo de manera que entra en contacto con el epitelio encima de la neuroepitelio ojo (Figura 1D). Comprimir ligeramente la preparación para sellar el cubreobjetos contra la vaselina y generar una pequeña superficie de contacto plana entre la región de los ojos de pupa y el cubreobjetos.

3. La fluorescencia de imágenes

1. Image la preparación de pupa utilizando unamicroscopio de fluorescencia. Cada 7 min captura de secciones en serie a través del dominio apical del neuroepitelio ojo, en la región de las uniones adherentes.
   NOTA: a) las secciones de serie apropiados son generalmente 4-5 por z-pila compuesta de 0,2 micras z pasos. b) Irregularidades en la topología del epitelio, incluyendo golpes suaves y pliegues, puede hacer que sea difícil para adquirir imágenes en foco de grandes regiones del tejido. Si bien las imágenes, se puede encontrar parte de un área de interés para estar en foco, y una región vecina a estar fuera de foco. La inclusión de una pequeña gota de agua destilada entre el ojo y el cubreobjetos pupal puede eliminar algunos pliegues de tejido aguda, pero no la característica topología ligeramente desigual de las primeras etapas de la morfogénesis del ojo de pupa. En estos casos sobremuestrear el tejido mediante la ampliación de la z-pila hasta de enfoque rebanadas se adquieren por todo el campo. c) La captura de secciones seriadas cada 7 min debe permitir en vivo de imágenes de 3 a 4 horas sin un importante reducción en la intensidad de fluorescencia de GFP que puede comprometer la calidad de la imagen. Intervalos de tiempo más cortos pueden reducir el tiempo total de formación de imágenes.
2. Continuar imágenes para 3 a 4 horas. No utilice un enfoque automático y función de tiempo que está disponible en muchos microscopios fluorescentes ya que el crecimiento de pupa y el bombeo de la hemolinfa mueve la posición de la retina y vigilante reorientar se requiere cada 14-21 min. NOTA que la imagen más allá de 4 horas puede retardar o detener la morfogénesis del ojo.
3. Utilice software de deconvolución adecuada para reducir el fondo y mejorar el contraste de las imágenes en la sección de serie. Para cada archivo z-stack, realice lo siguiente en software LAS AF (véase la Tabla de Materiales): Navegue hasta el panel Herramientas, seleccione 3D Deconvolución y haga clic en Aplicar.
4. Generar una imagen de proyección máxima (MP) para cada archivo de pila deconvoluted: Navegue hasta el panel Herramientas, seleccione la proyección en 3D y haga clic en Aplicar.
   NOTA: El algoritmo de máxima proyección puede no generar un uniformely imagen enfocada para el tejido que ha sido muestreada. Una técnica para el afilado de las regiones fuera de enfoque se describe en el paso 5.2.

4. Post-proyección de imagen Pupal Rescate y fenotipo Verificación

1. Para determinar si los artefactos fueron introducidos o la pupa dañado durante la exploración, retire con cuidado la pupa de la plataforma de formación de imágenes: el uso de fórceps quitar el cubreobjetos y transfieren la pupa a un vial limpio de comida. Guarde a temperatura ambiente o 25 ° C hasta que emerge la mosca adulta.
2. Examine cuidadosamente el fenotipo del ojo adulto y comparar a los ojos de las moscas adultas emergen de la cruz mosca originales.

Procesamiento 5. Imagen

1. Alineación automática de imagen:
   NOTA: El tejido Drosophila vivo cambiará y crecer a lo largo del proceso de formación de imágenes. En consecuencia, los centros de imágenes recogidas en puntos de tiempo sucesivos pueden no corresponder al mismo punto en el tejido Drosophila. Además, eltodo el disco retina gira alrededor de 30 ° entre ~ 21 y 23 horas APF. Para resaltar los comportamientos individuales de células y reducir las distracciones causadas por el crecimiento del organismo, alinear cada MP image.While esto se puede realizar de forma manual, el software de edición de imagen utilizada aquí (véase la Tabla de Materiales) ha algoritmos incorporados que pueden acelerar el proceso.
   1. En la ficha Archivo del menú principal, Scripts abiertos y seleccione Archivos de carga en la pila.
   2. Importe los archivos de imagen de MP en el panel de capas de la carga y seleccione Aceptar. Asegúrese de que no está seleccionada la opción Intentar Images Fuente para alinear automáticamente.
      NOTA: Si se selecciona esta opción, el software puede utilizar un algoritmo de alineamiento que distorsiona los datos de la imagen.
   3. Una vez que todos los archivos MP han cargado en el panel Capas, asegúrese de que todas las imágenes están en orden cronológico tal que el menor período de tiempo es en la parte superior de la pila de capas. Si las capas no están en el orden correcto, arrastrar y soltar hasta que se ordenancorrectamente.
   4. Seleccione Alinear capas automáticamente desde la pestaña Editar del menú principal. Elija Reposición y haga clic en Aceptar.
   5. Si el algoritmo de alineación automática falla para orientar los marcos de un centro de coordinación pertinente, realizar pequeños ajustes con la herramienta Mover.
2. Afilado Compuesto:
   NOTA: las regiones fuera del foco de una imagen inicial MP pueden ser afiladas por 'recorte' del correspondiente pila deconvoluted en software LAS AF. Recorte de un archivo de pila permite que uno restringir manualmente el intervalo de un z-pila que se somete al algoritmo de proyección máxima.
   1. Busque la función Recortar en el panel Herramientas (en la pestaña de procesos). Restringir manualmente las rebanadas iniciales y finales de tal manera que abarcan sólo el cinturón de la adhesión dentro de la región inicialmente fuera de foco. Haga clic en Aplicar para generar un nuevo archivo de pila que está optimizado para esta región.
   2. Generar una nueva proyección máxima de la pila optimizada a nivel local y de exportación como un archivo TIFF.
   3. En ªe software de edición de imagen (véase la Tabla de Materiales), Scripts abiertos (ubicadas en la ficha Archivo del menú principal) y seleccione Cargar archivos en pila.
   4. Importe el archivo de imagen MP inicial y archivo MP optimizado localmente para un momento determinado punto en el panel de capas de la carga y seleccione Aceptar. Asegúrese de que no está seleccionada la opción Intentar Images Fuente para alinear automáticamente.
   5. Seleccione las dos capas en las capas panel y seleccione Fusionar capas automáticamente (ubicado en la ficha Edición del menú principal) para enmascarar automáticamente las regiones apropiadas de las dos imágenes, produciendo una manera uniforme en-foco del campo de la retina. Guarde esta imagen compuesta como un archivo TIFF.
   6. Repita los pasos 5.2.1 a través de 5.2.5 para todas las imágenes subóptimas MP.
3. Ajustes Adicionales: girar, recortar y ajustar los niveles de las capas de película:
   1. Con todas las capas seleccionadas, utilice la herramienta de transformación (Edición> Transformación libre) para girar las imágenes de forma que el eje dorsal-ventral de la retina está alineadopara el eje y de la trama de la película.
   2. Si es necesario, utilice la herramienta de recorte para reducir el campo de visión de un tamaño y forma deseados.
   3. Use ajuste de nivel (de fotogramas individuales) para ayudar a mejorar el contraste entre la membrana celular y cuerpo celular.
   4. Para efectos estilísticos y hacer hincapié en los comportamientos específicos de células, introducir falso color para resaltar los puntos de interés en cada fotograma.
4. Animación: convertir las imágenes en una película:
   1. Abra el panel Animación desde la ficha de Windows del menú principal. Seleccione Crear cuadros de Capas en el menú situado en la esquina superior derecha del panel Animación.
   2. Tenga en cuenta que las capas se añaden al panel de animación en orden secuencial comenzando desde la parte inferior de la pila. Para invertir el orden de los marcos, primero seleccionar todos los fotogramas y seleccione Invertir fotogramas desde el menú del panel Animación.
   3. Seleccione un tiempo de demora de fotogramas para cada fotograma utilizando el menú desplegable debajo del pulgar marcouña.
      NOTA: La demora de fotogramas de películas 1 a 4 se presenta en este documento es de 0,8 seg.
   4. En la ficha Archivo del menú principal, abierta Exportación y seleccione Render video. Elige QuickTime exportación bajo Opciones de archivo y seleccione un formato de vídeo deseado. Bajo Render opciones SET Frame Rate en Personalizado, introduzca una velocidad de 15, y haga clic en Render.

Resultados

Live-proyección de imagen del ojo de pupa es una estrategia exitosa para observar comportamientos celulares que contribuyen al patrón del neuroepitelio. El papel de las proteínas específicas se puede evaluar fácilmente mediante la expresión de transgenes que modifican los niveles de proteína durante el desarrollo del ojo. Para ello GMR-GAL4 se utiliza para conducir la expresión del transgen detrás de la morfogénesis surco. Esto ofrece la ventaja de no perturbar eventos anteriores que establecen el cam...

Discusión

La descripción del desarrollo de tipo salvaje (arriba) forma la base para las comparaciones de eventos patrones en RNAi o genotipos sobreexpresión. Las comparaciones de desarrollo de tejido vivo son muy valiosos para determinar con precisión qué comportamientos celulares están regulados por una proteína de interés. Además, y no se describe aquí, imágenes de células vivas permite a uno hacer descripciones cualitativas y / o cuantitativas de la función de un gen de interés en los eventos que el patrón del oj...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
Scotch double stick tape	3M	665
Black Sylgard dissection dish			Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize
Sylgard	Dow Corning	SYLG184
Sylgard (Black)	Dow Corning	SYLG170
Glass petri dish	Corning	7220-85
25 x 75 x 1 mm glass microscope slide	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm glass coverslip	VWR	48393-172
Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Whatman 3mm Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-713-336
Vaseline	Fisher Scientific	19-086-291	Or purchase at local pharmacy.
30 ml syringe	Fisher Scientific	S7510-30
Leica TCS SP5 DM microscope	Leica Microsystems
LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software	Leica Microsystems