El Conejo Modelo Blood-shunt para el Estudio de la aguda y secuelas tardías de Hemorragia subaracnoidea: Aspectos Técnicos

Resumen

The experimental intracranial pressure-controlled blood shunt subarachnoid hemorrhage (SAH) model in the rabbit combines the standard procedures — subclavian artery cannulation and transcutaneous cisterna magna puncture, which enables close mimicking of human pathophysiological conditions after SAH. We present step-by-step instructions and discuss key surgical points for successful experimental SAH creation.

Resumen

Lesión cerebral temprana y tardía vasoespasmo cerebral tanto contribuyen a resultados desfavorables después de una hemorragia subaracnoidea (HSA). Modelos animales reproducibles y controlables que simulan ambas condiciones son actualmente poco común. Por lo tanto, se necesitan nuevos modelos con el fin de imitar las condiciones fisiopatológicas humanos como resultado de la HSA.

Este informe describe los matices técnicos de un modelo SAH sangre-shunt conejo que permite el control de la presión intracerebral (ICP). Una derivación extracorpórea se coloca entre el sistema arterial y el espacio subaracnoideo, que permite SAH-examinador independiente en un cráneo cerrado. Paso a paso las instrucciones de procedimiento y el equipo necesario se describen, así como las consideraciones técnicas para producir el modelo con un mínimo de mortalidad y morbilidad. Se describen los detalles importantes que se requieren para la creación quirúrgica exitosa de esta robusta, simple y consistente modelo de conejo SAH ICP-controlado.

Introducción

La hemorragia subaracnoidea (HSA) es una de las más potencialmente mortal condiciones neuropatológicos, con frecuencia conduce a un daño neurológico permanente o la muerte ^1. Las investigaciones anteriores se ha centrado en el vasoespasmo cerebral retardada (DCVS) como la etiología primaria de los déficits neurológicos asociados con SAH ^2. Sin embargo, los pobres en general, los resultados clínicos de los pacientes que sufren de la HSA después del tratamiento del vasoespasmo ha llevado a una expansión del enfoque de la investigación para incluir los efectos de la lesión cerebral temprano (EBI) después de la HSA ^3. Una mayor comprensión de la importancia de ambos EBI y DCVS en contribuir a pobres resultados clínicos después de la HSA es esencial para el desarrollo de estrategias terapéuticas más eficaces.

Hasta ahora, la inyección de sangre autóloga simple y doble en la cisterna magna ha sido el método estándar para SAH inducción para el estudio de DCVS ^2-6. Aunque se utiliza comúnmente en estudios anteriores,este modelo muy probablemente no reproduce los principales cambios neuropatológicos asociados con HSA inducida EBI ^7. En contraste, la perforación endovascular es conocida por producir graves cambios fisiopatológicos agudos que imitan parcialmente los síntomas de EBI ^7.

Este informe describe un nuevo modelo de conejo de SAH diseñada para permitir la investigación de ambos EBI y DCVS, permitiendo así la caracterización más precisa de la patología inducida por SAH _^8-10. Con la técnica descrita, el modelo estándar cisterna magna se adapta mediante la conexión del sistema arterial de la arteria subclavia y la cisterna magna a través de una derivación extracorpórea. El flujo de sangre está por lo tanto ligado a la fisiología del conejo y accionado por el gradiente de presión entre la sangre arterial y la presión intracraneal. El sangrado se detiene cuando la presión intracerebral (ICP) es igual a la presión arterial diastólica y la sangre en el sistema de derivación se coagula. Utilizando el host & #8217; s fisiología reduce examinador dependiente de la inducción de la HSA, dando lugar a un modelo más consistente de la HSA que produce de forma fiable tanto EBI y fenotipos DCVS ^3,8-10.

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Protocolo

Tres meses de edad hembra conejos de Nueva Zelanda que pesan 2.5 a 3.5 kg se utilizaron para este procedimiento. El estudio se realizó de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el cuidado y uso de animales de experimentación y con la aprobación del Comité de Cuidado de Animales del cantón de Berna, Suiza (aprobación N. ° 105/13). Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron bajo condiciones estériles en el Instituto de Cirugía Experimental del Departamento de Investigación Clínica del Hospital Universitario de Berna en Berna, Suiza. Un anestesiólogo veterinario supervisa los animales durante la cirugía y durante la recuperación.

1. Preparación de los animales, Posicionamiento y Arteria subclavia Canulación

1. Inducir la anestesia general en el conejo con la inyección intramuscular de ketamina (30 mg / kg; Ketalar, 50 mg / ml) y xilazina (6 mg / kg; Xylapan 20 mg / ml) y la profundidad de control de la anestesia mediante la comprobación de la respuesta del conejo para nocivo stimulatión (por ejemplo, una pizca dedo del pie). Ver 1.7 en caso de respuesta positiva.
2. Tire hacia abajo el párpado inferior de ambos ojos y aplique una pequeña cantidad de ungüento en los párpados para evitar la sequedad y la irritación adicional.
3. Cateterizar la vena lateral de la oreja con un Gbutterfly intravenoso periférico 20 (20 catéter vascular G), fijar con cinta adhesiva, y conectarse a una bolsa de gravedad que contiene cloruro de sodio al 0,9% (500 ml / 24 hr) y ketamina (40 mg / kg / hr) / xilazina (4 mg / kg / h) para la administración intravenosa continua (iv) la anestesia. Administrar analgésicos adicional cada 15 min iv (fentanilo, 1 mcg / kg). Nota: Evite los anestésicos volátiles de gas, que se asocia con la reducción de la PPE, el aumento de la CBF, y la disminución de la tasa metabólica cerebral de oxígeno ¹¹ anestésicos intravenosos proporcionan características más idóneas para neuroanestesia preservando CBF y la vasoconstricción cerebral, ^12, que tiene una importancia superior al estudiar cerebral. vasoespasmo. Además, aunque la mortalidad se incrementa en SPONTanimales respirar aneously, puede imitar mejor la situación humana de la HSA aguda.
4. Proporcionar oxígeno (1 - 2 L / min) a través de una máscara respiratoria que permite dióxido de carbono al final de las mareas (ETCO ₂₎ seguimiento.
5. Instale un electrocardiograma de 3 canales (ECG) .place tres electrodos subcutáneos en una disposición triangular en la parte ventral del conejo; específicamente, colocar un electrodo sobre la región centrotorácico derecha (con la distancia al campo afeitado estéril para la canulación de la arteria subclavia) y dos electrodos en el abdomen inferior distribuidos en ambas extremidades.
6. Monitorear la profundidad de la anestesia cada 15 minutos durante la cirugía siguiendo la frecuencia respiratoria, frecuencia cardíaca (FC) monitoreado desde la señal de ECG, y la reacción a la estimulación nociva.
7. En caso de respuesta positiva a la estimulación nociva (pizca dedo del pie), adaptar la profundidad de la anestesia mediante bolo de ketamina (6 mg / kg) iv en bolo y xilazina (0,05 mg / kg) iv y / o un bolo analgesia adicional con Fentanilo (1 mcg / kg) iv
8. Fijar el conejo en una posición supina sobre una placa de calentamiento cuerpo, inclinando la cabeza 20 ° hacia abajo y girando ligeramente contralateral al lado en el que se expone la arteria subclavia.
9. aplicar pomada para los ojos y preparar la zona para la cirugía por el afeitado el pelo sobre el músculo pectoral derecho alrededor del tercio medio de la clavícula, y sobre el cráneo frontal-, parietal- y occipital, el cuello, y sobre la arteria femoral común derecha.
10. Desinfectar la piel durante 3 min con un amplio espectro antiséptico, por ejemplo., Povidona-yodo.
11. Cubrir el conejo con sábanas estériles. Realizar todos los procedimientos adicionales en condiciones estériles y con frecuencia aplicar 4% papaverina HCl y solución de antibiótico (sulfato de neomicina 5 mg / ml) por vía tópica para prevenir el vasoespasmo arterial por la manipulación del vaso y las infecciones locales.
12. Infiltrarse en el músculo pectoral con anestésicos locales (lidocaína 1% de la máxima 6 mg / kg). Hacer una incisión en la piel paraesternal y preparar elmúsculo pectoral. Usando el microscopio, diseccionar la arteria subclavia y seguro con una ligadura proximal y distal (4-0 suturas multifilamento) alrededor del extremo expuesto. Mantenga una ligadura cerca del control proximal en el lugar para asegurar el catéter y ligar el vaso distal.
13. Realizar una arteriotomía en la pared de la arteria subclavia por la incisión de la arteria con un microscissor curvada y canular la arteria subclavia retrógradamente con un pequeño intravasal de 3 vías llave de paso. Asegurar el catéter por ligadura doble nudo hacia la ligadura distal con el fin de impedir la torsión arterial o la flexión de la parte proximal de la arteria y para evitar el sangrado deslizamiento o masiva.

2. la presión arterial y Monitoreo La gasometría arterial

1. Conecte el stop de 3 vías polla para i) la cánula intravasal de gases en sangre arterial (ABG) analiza, pH, PaCO _2, PaO _2, bicarbonato, exceso de base, y SO _2, ii) la sangre arterial invasivadispositivo de medición de presión, y iii) el dispositivo de derivación.
2. Recoger muestras de sangre para el estado de ABG (PaCO _2, PaO ₂₎ y un seguimiento continuo de los parámetros estándar cardiovasculares y respiratorias (presión arterial, de recursos humanos, ECG, frecuencia respiratoria y telerrespiratorias CO ₂₎ y de transferencia de datos a través de la interfaz de salida analógica a un analógico- convertidor A / registrador de datos digital y tienda.
   NOTA: Las presiones se centraron en los niveles del corazón antes y después de cada sesión, y calibración de la presión de la analógica / digital convertidor y el sistema de registro de datos se llevará a cabo una vez antes de que comience la serie.

3. Base angiografía por sustracción digital

1. Coloque un dispositivo de encolado externo (pequeña esfera) sobre ambos ángulos de la mandíbula con el fin de calibrar el angiograma.
   NOTA: Esto permite la comparación exacta de las mediciones post hoc de la línea de base y seguimiento diámetro del vaso.
2. Realizar la angiografía por sustracción digital (DSA) por retrógrada dentro de uninyección en bolo rterial de Iopamidol no iónico (0,6 ml / kg, 5 ml / seg durante 2 segundos) a través de la arteria canulada y enjuagar la cánula inmediatamente después de la inyección en bolo con solución salina con el fin de evitar la oclusión de este último.
3. Obtener imágenes (7 imágenes en 14 segundos) del sistema vertebrobasilar utilizando una rápida grabación angiografía secuencial en una posición oblicua 5 ° izquierda-anterior.
4. Infíltrate en la zona alrededor de la arteria femoral común derecha con anestésicos locales (lidocaína al 1%, máximo de 6 mg / kg). Haga una pequeña incisión en la piel inguinal. Usando el microscopio para la visualización, diseccionar la arteria femoral común y seguro con una ligadura proximal y distal (4-0 suturas multifilamento) alrededor del extremo expuesto.
5. Después de arteriotomía, canular la arteria femoral con una vaina de 5-F. Enjuague el puerto lateral de la funda con solución salina.
6. Avanza un catéter 5-F en la arteria innominada a través de la vaina bajo fluoroscopia. Crear una hoja de ruta, para luego avanzar un alambre de guía a thsistema vertebrobasilar e. Inyectar un bolo de Iopamidol no iónico (0,6 ml / kg, 5 ml / seg en 2 seg) para DSA como se describe en el paso 3.2.

4. rotación a la posición propensa

1. Siguiendo la línea de base DSA, vuelva a colocar el conejo de posición supina a la posición prona. Tenga cuidado de no manipular o cambiar de lugar la posición de los catéteres intra-arteriales.
2. Coloque la cabeza en un soporte del cabezal en un ángulo de 30 °, la cabeza orientada hacia abajo.

5. Cisterna Magna Punción

1. Desinfectar la piel que cubre la cabeza y el cuello con povidona yodada 3 veces durante 1 minuto cada uno, y cubrir el área quirúrgica con sábanas estériles.
2. Insertar un 22 G x 40 mm aguja de acceso espinal infantil transcutánea en la cisterna magna sin ninguna incisión en la piel antes o desplazamiento del músculo.
3. Confirme que el animal esté totalmente anestesiado, garantizando una falta de respuesta del dedo del pie-pellizco antes de deslizar la aguja hacia abajo a lo largo del hueso protuberancia occipital externahasta que se detecta una brecha; no empuje la aguja más.
4. Confirmar el correcto posicionamiento de la aguja mediante la observación de goteo espontáneo de líquido cefalorraquídeo con la cabeza del conejo inclinado hacia abajo en un ángulo de 20 ° para unos pocos min.

6. Instalación de la presión intracraneal y Monitoreo del flujo sanguíneo cerebral

1. Después de la piel en la línea media y la incisión galea, insertar un pequeño retractor quirúrgico.
2. Hacer tres osteotomías ronda (2 mm de diámetro) utilizando un microtaladro de alta velocidad en la parte frontal del cráneo de acuerdo con los puntos de referencia del cráneo exteriores (Figura 1) ^9, es decir, sobre el bulbo olfativo y frontal bilateral para la colocación de un dispositivo de neuromonitorización si necesario. Use una regla escala milimétrica para determinar las coordenadas de rebabas colocación agujero de la siguiente manera: monitorización de la presión intracraneal (PIC) en la línea midpupillary, una o dos mm de la línea sagital medio; sondas láser-Doppler intraparenquimatosascuatro y cincuenta y seis mm anterior y lateral a la bregma (Figura 1).
3. Visualice la duramadre, y realizar una hemostasia meticulosa: utilizar cera de hueso para la hemostasis ósea en virtud de su acción taponamiento y realizar la hemostasia local mediante coagulación bipolar de la duramadre.
4. Coloque la presión intracraneal (ICP) de punta monitor de intraparenquimatosa en el bulbo olfatorio derecho a una profundidad de 2 mm y luego calibrar.
5. Coloque las sondas con aguja fina los dos laser-Doppler flujometría utilizando un sistema de abrazadera externa e insertarlos en los agujeros de trépano correspondientes, tanto en los hemisferios derecho e izquierdo frontales lateral al sistema ventricular, es decir, en la línea media para evitar interferencias con el líquido cefalorraquídeo. Coloque sondas de aguja a una profundidad de 2,5 mm.
6. Después de la colocación de las sondas de neuromonitorización, selle todos los orificios de trepanación con un tapón grueso de cera de hueso para mantener el cráneo estanca a los fluidos.
7. Medir los parámetros basales de la presión arterial media (MAP), ICP y el flujo sanguíneo cerebral (CBF) usando un monitor multiparamétrico y de cuatro canales tejido láser-Doppler monitor de perfusión de la sangre.

7. Derivación Inducción

1. Conecte la aguja de acceso espinal en la cisterna magna de la arteria subclavia previamente sondaje mediante un tubo de control de presión llena de sangre. Utilice la llave de paso de 3 vías para la medición de la presión arterial y como puerto de muestreo de sangre.
   NOTA: La gravedad de SAH depende de la cantidad de sangre, y se puede estimar más o menos por la extensión de la formación de coágulos subaracnoideos en el momento de la cosecha cerebro ^5,11.
2. Monitorear continuamente PAM, FC, ECG, frecuencia respiratoria y la final de la espiración de CO ₂ a una velocidad de muestreo de 1 Hz de 6 minutos antes hasta por lo menos 20 minutos después de la HSA.
3. Confirmar que el animal está totalmente anestesiado asegurando una falta de respuesta pizca dedo del pie antes de abrir la conexión de derivación entre la arteria subclavia y la cisterna magna para inducir SAH por la presión gradient.
   NOTA: A HSA controlado puede lograrse mediante el cierre de la derivación en cualquier punto de tiempo (por ejemplo, a un nivel deseado de ICP.).
4. Registre los valores en estado estacionario durante un período de tiempo de aproximadamente 15 min.
5. Después de ICP alcanza su punto máximo, mantenga la aguja de acceso espinal en su lugar hasta que la PIC vuelve a un estado estacionario cerca de los valores basales. Si se mantiene la meseta ICP durante más de 10 segundos o si la PIC disminuye de forma espontánea, cierra la derivación.
6. Retire CBF sondas con aguja fina y la sonda ICP, tapar los agujeros de trépano con cera de hueso, quitar todos los catéteres (incluyendo catéter subclavia, desde la manipulación del catéter con sangrado consecutivo se asocia con una alta morbilidad y mortalidad, y aumenta la tasa de infección), lleve a cabo el lavado de heridas rigurosa con El sulfato de neomicina y suturar la piel.

8. Tratamiento postoperatorio

1. El procedimiento tiene una duración de aproximadamente 2 horas. Debido a la vida media de ketamina y xilazina, el tiempo de recuperación del ánimal es bastante corto - aproximadamente 1 hr. Los animales se mantuvieron bajo una lámpara de calentamiento durante la recuperación. Líquidos adicionales no se proporcionan. Durante esta fase inicial de la recuperación postoperatoria, aplicar buprenorfina 0,02 mg / kg sc cada 8 horas durante 24 horas.
2. Aplicar parches de matriz de fentanilo transdérmico de liberación de 12,5 mg / hr en la región del cuello afeitada de los animales para la analgesia efectiva durante el próximo 72 hr.
3. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
4. No devuelva un animal que ha sido sometido a cirugía en la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente.

9. Seguimiento angiografía por sustracción digital para evaluar DCVS en el Día 3

1. Realice los pasos 1.1 hasta 3.6 como se describe anteriormente.
2. La eutanasia a los animales mediante la inyección intraarterial bolo de thiopenthal de sodio (40 mg / kg) (pentotal, Ospedalia AG, Hünenberg, Suiza). En los casos en que la histología y immunohistochemistry es necesario, realizar una perfusión-fijación intracardíaca a temperatura ambiente a una presión de perfusión de 100 cm H ₂ O.

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Resultados

El modelo de derivación de sangre de conejo de SAH se describe en este informe produce EBI en el hipocampo (Figura 2A, B), la corteza basal (Figura 2A, B), y la vasculatura cerebral (Figura 2C) tan pronto como 24 horas después de la lesión y muestra una característica distribución de la sangre (Figura 2D) ^8. Además, el modelo desencadena moderada a severa grados de DCVS en tres días después de la HSA de inducción (Figur...

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Discusión

El modelo de shunt produce patología similar a la observada en seres humanos después de la HSA aguda ^3,8,10. Se ha sugerido que puede exacerbar EBI, mantener e incluso desencadenar DCVS ^12, y como tal, este modelo puede ayudar en la investigación de las fases tempranas y tardías DCVS, incluyendo EBI y DCVS interacciones siguientes SAH. En particular, repetible en vivo DCVS técnicas de monitoreo incluyendo DSA ^13, angiografía por tomografía computarizada ¹⁴ y Do...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Operation microscope	Zeiss, Jena, Germany		Zeiss, OPMI-MD surgical microscope
Surgical equipment	B. Braun, Germany		Forceps medical no. 5; vessel scissors 8 cm; microclip 4 mm
Respirator	Hugo Sachs
Hair clipper	3M Surgical Clipper		Starter Kit 9667A
Body warm plate	FHC
Blood gas analyzer	Radiometer, Copenhagen, Denmark	ABL 725
Cardiac monitoring	Camino Multi-Parameter Monitor, Integra, Plainsboro, NJ, US	AP-05
Software analysis	BIOPAC Systems, Inc., Goleta, CA, USA		Biopac MP100 and acqKnowledge software,version 3.8.1
Software analysis	ImagePro Discovery, MediaCybernetics, Silver Spring, MD, USA		Image-Pro Plus version
Angiography apparatus	DFP 2000 A-Toshiba	MIIXR0001EAA
ICP monitor	Camino Laboratories, San Diego, CA, USA		ICP monitor, Model 110-4B
Blood flow monitor	Oxford Optronix Ltd., Oxford, UK		CAL KIT microsphere solution
Laser-Doppler flowmetry fine needle probes	Oxford Optronix Ltd., Oxford, UK		MNP110XP, 0.48 mm diameter
Pressure tube	B. Braun, Germay		PE 1.0 mm × 2.0 mm
Anesthesia monitor	GE Medical Systems, Switzerland		Datex S5 Monitor
Material
20 G vascular catheter	Smiths Medical		Jelco i.v. catheter, REF 4057
5.5 F three-lumen central venous catheter	Connectors, Tagelswangen, Switzerland		Silicone catheter STH-C040
22 G x 40 mm needle	Emergo Group Inc., Netherlands
High-speed microdrill	Stryker, Solothurn, Switzerland	5400-15
Bone wax	Ethicon, Johnson & Johnson,NJ, USA	ETHW31G
Bipolar forceps	Aesculap, Inc., PA, US	US349SP
Ketamin			Any generic product
Xylazine			Any generic product
Buprenorphine			Any generic product
Fentanyl			Any generic product
Transdermal fentanyl matrix patches			Any generic product
Lidocaine 1%			Any generic product
4% papaverin HCl			Any generic product
Neomycin sulfate	Research Organics Inc., OH, USA		Any generic product
Povidone-iodine			Any generic product
0.9% sodium chloride			Any generic product
Iopamidol	Abott Laboratories, IL, USA		Any generic product
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP824G
5-0 non absorbable suture	Ethicon Inc., USA	8618G
4-0 polyfilament sutures	Ethicon Inc., USA	VCP284G