Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Resumen

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Resumen

/ Terapia Red de infrarrojo cercano luz (R / NIR-LT), entregado por láser o diodo emisor de luz (LED), mejora los resultados funcionales y morfológicos en una gama de lesiones del sistema nervioso central in vivo, posiblemente mediante la reducción del estrés oxidativo. Sin embargo, se han mostrado efectos de R / NIR-LT sobre el estrés oxidativo a variar dependiendo de la longitud de onda o la intensidad de la irradiación. Los estudios que compararon los parámetros de tratamiento se carece, debido a la ausencia de dispositivos disponibles en el mercado que ofrecen múltiples longitudes de onda o intensidades, apto para alta rendimiento de procesamiento en los estudios de optimización vitro. Este protocolo describe una técnica para la entrega de la luz en una gama de longitudes de onda e intensidades para optimizar las dosis terapéuticas requeridas para un modelo de lesión dado. La hipótesis de que un método de entrega de la luz, en el que los parámetros de longitud de onda e intensidad podría modificarse fácilmente, podría facilitar la determinación de una dosis óptima de R / NIR-LT para la reducción de especies reactivas de oxígeno(ROS) in vitro.

Luz no coherente Xenon se filtró a través de filtros de interferencia de banda estrecha para proporcionar longitudes de onda diferentes (longitudes de onda centrales de 440, 550, 670 y 810 nm) y flujos de energía (8,5 x 10 ^-3 a 3,8 x 10 ^-1 J / cm ²⁾ de la luz a las células cultivadas. La salida de luz del aparato se calibró para emitir dosis cuantales terapéuticamente relevantes, iguales de luz en cada longitud de onda. Se detectaron especies reactivas en glutamato destacó las células tratadas con la luz, utilizando DCFH-DA y H ₂ O ₂ tintes fluorescentes sensibles.

Nos éxito librados luz en una gama de longitudes de onda fisiológica y terapéuticamente e intensidades pertinentes, a las células cultivadas expuestas a glutamato como un modelo de lesión del SNC. Mientras que las fluencias de R / NIR-LT utilizados en el estudio actual no ejercer un efecto sobre ROS generado por las células cultivadas, el método de suministro de luz es aplicable a otros Systems incluyendo mitocondrias o más fisiológicamente modelos de cultivo rebanada organotípicos pertinentes aislado, y podría utilizarse para evaluar los efectos sobre una serie de medidas de resultado del metabolismo oxidativo.

Introducción

Se requieren especies reactivas de oxígeno (ROS) para una serie de vías de transducción de señales y reacciones normales del metabolismo celular, incluidos los de neuroprotección ^1. Sin embargo, cuando el mecanismo antioxidante endógeno no son capaces de controlar la producción de ROS, las células pueden sucumbir a estrés oxidativo ^2,3. Después de una lesión en el SNC, se cree que los aumentos asociados en la presencia de ROS y el estrés oxidativo a desempeñar un papel importante en la progresión del daño ^4,5. A pesar de la extensa serie de estrategias para atenuar el estrés oxidativo que se han evaluado, actualmente no existen estrategias de anti-oxidantes completamente eficaces, clínicamente relevantes para la atenuación de la producción de ROS y el estrés oxidativo asociado en uso clínico siguiente neurotrauma ^6. Por lo tanto la atenuación del estrés oxidativo sigue siendo un objetivo importante para la intervención terapéutica ^7.

Mejoras siguening R / NIR-LT se han reportado en una amplia gama de lesiones y enfermedades, incluyendo reducciones en el tamaño del infarto de miocardio, las complicaciones renales y hepáticas durante diabetes, degeneración de la retina, la lesión del SNC y accidente cerebrovascular ^8, quizás al reducir el estrés oxidativo. Con especial atención a la lesión del SNC, los estudios preclínicos de eficacia de la luz 670 nm han demostrado buenos efectos en los modelos de degeneración retiniana ^9-11, lesión de la médula espinal ^12, la muerte neuronal ^13. Se han llevado a cabo ensayos clínicos para la edad seco degeneración macular relacionada y están actualmente en curso para el accidente cerebrovascular ^14, sin embargo los resultados de estos ensayos no parecen prometedores, quizás debido a la imposibilidad de emplear un tratamiento efectivo parámetros ^15. Como tal, R / NIR-LT no ha sido ampliamente adoptado como parte de la práctica clínica normal en neurotrauma, a pesar de ser una fácil de administrar, no invasiva y tratamiento relativamente barato. Las barreras a la traducción clínica incluyen la falta de un cltemprano entendido mecanismo de acción y la ausencia de un protocolo de tratamiento efectivo ^16,17 estandarizado. La literatura actual con respecto a la terapia de luz revela una gran cantidad de variación en los parámetros de tratamiento con respecto a las fuentes de irradiación (LED o láser), longitud de onda (por ejemplo, 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), la dosis total (julios de irradiación / unidad de superficie), la duración (tiempo de exposición), el tiempo (insulto previo o posterior), la frecuencia del tratamiento y el tipo de parto (pulso o continua) ^8. La variabilidad en los parámetros de tratamiento entre los estudios dificulta la comparación y ha contribuido al escepticismo respecto a la eficacia ^16.

Por lo tanto, la optimización de R / NIR-LT está claramente necesario, con los sistemas de cultivo de células capaces de proporcionar el mecanismo de selección de alto rendimiento necesario comparar las múltiples variables. Sin embargo, hay pocos sistemas de iluminación disponibles en el mercado que pueden proporcionar la flexibilidad y el control suficiente sobre wavelength e intensidad para realizar este tipo de experimentos de optimización. Comercialmente dispositivos LED disponibles son generalmente no capaz de entregar múltiples longitudes de onda o intensidades, resultando en investigadores que emplean múltiples dispositivos LED de diferentes fabricantes, que pueden variar no sólo en la intensidad, sino también el espectro de longitud de onda de la luz emitida. Hemos abordado este problema mediante el empleo de una banda ancha de xenón fuente de luz filtrada a través de filtros de interferencia de banda estrecha, generando de ese modo una gama de longitudes de onda y fluencias de luz, lo que permite un estrecho control y precisa de los parámetros de R / NIR-LT.

Es importante señalar que la dosis terapéutica de tratamiento se define por el número de fotones que interactúan con el photoacceptor (cromóforo), que, en el caso de R / NIR-LT se postula que el citocromo c oxidasa (COX) ^18. La energía fotónica entregado varía con la longitud de onda; es decir, dosis iguales de energía a diferentes longitudes de onda será compreciada de diferentes números de fotones. Por lo tanto, la luz emitida desde el dispositivo fue calibrado para emitir un número igual de fotones para cada una de las longitudes de onda elegidas para ser probado. Hemos desarrollado un sistema que puede ser utilizado para entregar R / NIR-LT en un rango de longitudes de onda e intensidades a las células in vitro y ha demostrado la capacidad de medir los efectos de la entrega R / NIR-LT sobre la producción de ROS en células sometidas a estrés glutamato.

Protocolo

1. Calibración óptica: Medición de luz de salida

1. Para preparar el aparato de suministro de luz, conectar una fuente de luz de banda ancha (por ejemplo, xenón o lámpara de tungsteno) a una fuente de alimentación adecuada. Colocar una lente de colimación en frente de la fuente de luz para producir un haz de luz colimado. Pasar la luz a través de un filtro de calor líquido para eliminar la mayor parte del calor del haz de luz. Dependiendo de la aplicación, enfocar el haz colimado a la abertura de entrada de una guía de luz líquida, que proporciona para la entrega más flexible de la luz (por ejemplo., En una incubadora).
2. En el otro extremo de la guía de luz líquida, posicionar una segunda lente de colimación y, a continuación un soporte para la interferencia y filtros de densidad neutra. Compruebe que esta disposición produce una mancha uniformemente iluminada de luz de la banda de frecuencia y la intensidad deseada.
   Nota: La distancia entre el extremo de la guía de luz y el plano de la muestra puede tener que variar dependiendoel área que debe ser iluminada, pero recuerda que como la distancia desde el extremo de la guía de luz aumenta, intensidad de la luz disminuye. En el presente estudio, esta distancia es de 14cm y produce una sección transversal del haz que ilumina uniformemente un área bien 3x3 en una placa de 96 pocillos.
3. Asegúrese de que la luz difusa de la lámpara y los componentes ópticos asociados no puede llegar a la muestra.
4. Encienda la fuente de agua para el filtro de calor líquido y asegurar que existe intercambio de agua a través del filtro de la chaqueta. Encienda la fuente de energía de la lámpara y espere por lo menos 5 minutos para la fuente de luz de banda ancha a estabilizarse. Nota: Se requiere el uso del enfriador de agua para evitar el sobrecalentamiento del dispositivo.
5. Seleccionar un filtro de interferencia de banda estrecha (por lo general descrito por su longitud de onda central, la transmitancia de pico y anchura total a la mitad del máximo (FWHM) de ancho de banda) para generar la banda de frecuencias deseada de la iluminación. Nota: Los filtros de interferencia de banda estrecha utilizadas en el estudio fueron 442 nm, 550 nm, 671 nm y 810 nm.
6. Medir la luz producida por la lámpara en el plano en que el espécimen se va a colocar durante el tratamiento. Medir la luz utilizando una sonda calibrada irradiancia (colector coseno) conectado a un espectrorradiómetro adecuado, el uso de software de propiedad de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
7. Utilice filtros de densidad neutra para ajustar la intensidad de la luz hasta que se obtiene la salida deseada. Nota: En el presente estudio, la intensidad de luz que pasa por cada filtro de interferencia se ajusta para dar una salida quantal igual en cada una de las cuatro bandas de frecuencia de tratamiento. Es importante comprobar la calibración con regularidad, como la salida de la lámpara está sujeta a cambios.
   Nota: Tras la puesta en marcha del aparato, las células están listas para ser iluminada Figura 1 es una representación del aparato de suministro de luz utilizada en el estudio actual..

Figura 1. Imagen del aparato de suministro de luz. Illustrated son la fuente de energía de luz, lámpara de xenón con la vivienda, la lente de colimación, filtro de agua, la abertura de entrada, guía de luz líquida, segunda lente de colimación, soporte de filtro, marco de tratamiento y mate tarjeta de negro. Tenga en cuenta que los filtros de longitud de onda e intensidad de banda estrecha no se muestran.

2. Preparación de la célula

1. El método de entrega / NIR-LT R descrito puede ser aplicado a cualquier tipo de célula o en el sistema de modelo in vitro; como tal, las siguientes descripciones de cultivo celular son generales, usando técnicas bien establecidas para la cultura feocromocitoma (PC12), Müller (RMC1) y células de la retina mixtos primarios.
2. Antes de la siembra de células para el tratamiento de la luz y el ensayo de estrés oxidativo, la cultura células en sus respectivos medios de cultivo que contiene suplementos apropiados (por ejemplo., FBS, antibióticos) en flas T75 inmortalizóks hasta 70-80% de confluencia.
3. Separar las células inmortalizadas de los matraces T75, usando el método apropiado para el tipo de célula para ser probado por ejemplo., Tripsina. Si es necesario, antes de proceder con la siembra de células en placas de 96 pocillos de ensayo, pocillos de placas de ensayo de capa con 10μg / ml de poli-L-lisina durante 1 h (por ejemplo., Para las células PC12) o 10μg / ml de poli-L-lisina para 1H seguido de un / O N incubación con 10μg / ml de laminina (por ejemplo., por células de la retina mixtos).
4. Centrifugar las células a recoger en su caso (por ejemplo., A 3 minutos a 405 xg para las células PC12 o 10 min a 218 xg durante células RMC1), eliminar el sobrenadante y resuspender en 8 ml de medio de cultivo celular apropiado.
5. Si las células de la retina son mezclados para ser utilizado, preparar a partir de crías de rata neonatal P0-5 por digestión enzimática (papaína) de acuerdo con procedimientos establecidos ¹⁹
6. Contar el número de células viables con exclusión de 0,4% (w / v) de colorante azul de tripano, usando un hemocitómetro.
7. Ajuste suc densidad celularh que las células serán de aproximadamente 70-80% de confluencia después de 24 o 48 horas en cultivo. (Para las células PC12 de la densidad de siembra es de 4,0 x 10 ⁵ células viables / ml, para las células RMC1, es 2,5 x 10 ⁵ células viables / ml y para células de la retina mixtos es 8 x 10 ⁵ células viables / ml). Después de añadir las células ya sea a placas de 96 pocillos claros o negros (utilizados para el H ₂ O ₂ o ensayo DCFH-DA, respectivamente), en 100 l de medio de cultivo adecuado, permiten placa para sentarse en una superficie plana a 37 ° C, 5 % de CO ₂ (o lo que las condiciones son apropiadas para el tipo específico de célula) durante al menos 24 horas para permitir la adherencia celular.
8. Cultivar las células en medio de crecimiento en las 96 bandejas así apropiadas hasta que son 70-80% de confluencia (24h para PC12 y las células RMC1, 48h para las células de la retina mixtos).

3. La adición de glutamato Stressor a células

1. Preparar monosódico ácido concentraciones estresantes hidrato de sal de L-glutámico de 0-10mm en cultivo completo apropiadomedios de cultivo XX.
2. Retire el medio de las células y lavar suavemente las células 3 veces con PBS (PC12) o HBSS (RMC1 y células de la retina mixtos). Después de lavados, añadir medios que contienen glutamato a un volumen total de 100 l / pocillo.

4. Primera Dosis de Tratamiento Luz

1. Inmediatamente después de la adición de glutamato o el factor estresante de elección, exponer las células a tratamiento con luz en las longitudes de onda e intensidades deseadas colocando bajo el aparato de suministro de luz preparada. Asegúrese de alterar la salida quantal del haz de luz usando las combinaciones establecidas de filtros de densidad neutra en función de la longitud de onda que se administra.
   Nota: En los experimentos actuales, exponer las células para el tratamiento de luz durante 3 min mantener la temperatura en reposo las placas de 96 pocillos en una almohadilla de calor C ³⁷ °. El tiempo de tratamiento puede variar según se requiera.
   1. Coloque una tarjeta mate negro debajo de las células para evitar que la luz refleja en los pozos adyacentes en el 96-well bandeja designado para otros parámetros de tratamiento.
2. Si se desea un tratamiento para longitudes más largos de tiempo, añadir tampón Hepes 25 mM para mantener el pH del medio de cultivo celular o, idealmente, colocar las placas de aparatos y de tratamiento dentro de una incubadora con CO ₂ concentración regulada a 5% de CO _2, o condiciones que son óptimas para el tipo específico de célula.
3. Tras la finalización del tratamiento con luz, colocar las células en una superficie plana y se incuba a 37 ° C y 5% de CO ₂ (o lo que las condiciones son óptimas para el tipo de célula) durante 24 horas.
   Nota: las dosis adicionales de R / NIR-LT se pueden administrar como se ha descrito anteriormente, según se desee.

5. Final de la dosis de tratamiento con luz y detección de ROS

1. Antes de realizar la ronda final del tratamiento de la luz, se preparan los reactivos que se utilizan para la detección de ROS. Prepare el buffer de 50 mM de citrato (pH 6,0), Triton X100, y H ₂ O ₂ reactivo de detección de trabajosolución (1: 2: 97 proporción de 10 mM H ₂ O ₂ de detección de solución de reactivo de valores; 10 U / ml de peroxidasa de rábano; citrato de sodio 50 mM (pH 6,0)). Preparar DCFH-DA a una concentración final de 100μM en el medio adecuado.
   Nota: DCFH-DA reactivo para las células PC12 se encuentra en medio RPMI, DCFH-DA reactivo para células RMC1 está en medio DMEM. Tenga en cuenta que los reactivos de detección disponibles en el mercado tienen sensibilidades diferenciales a lo específico ROS y los reactivos deben ser elegidos cuidadosamente para proporcionar la información deseada para una aplicación individual.
2. Administrar tratamiento con luz a las células, como se describe en el paso 4.1-4.1.2. Asegurarse de que las células están siendo tratados con los deseados influencias / longitudes de onda de la luz.
3. Inmediatamente después de tratamiento con luz, retire los medios que contienen glutamato y lavar dos veces con solución tampón apropiado (para las células PC12, PBS y se utiliza para las células RMC1, se utiliza HBSS). Realizar los ensayos de ROS en las células como sigue:
   1. H ₂ O ₂ ensayo: añadir 45 l de tampón de citrato 50 mM (pH 6,0) y 5 l Triton X100 a cada uno de los pocillos. Agite suavemente las células en un agitador orbital durante 30 segundos y se incuba a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 15 min. Añadir 50 l de H ₂ O ₂ solución de trabajo de detección y se incuba durante 30 min a TA. Medir la fluorescencia usando un lector de placa con una longitud de onda de excitación de 530 nm y una longitud de onda de emisión de 480 nm.
   2. Ensayo de DCF: añadir 100 l de la solución de DCFH-DA a cada uno de los pocillos 100 mM y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C y 5% de CO _2. Retire el medio que contiene 100 mM DCFH-DA y lavar con solución de tampón apropiado (como se describió anteriormente) dos veces. Añadir 90 l de solución tampón y 10 l Triton X100 a cada uno de los pocillos y agitar suavemente en un agitador orbital durante 30 segundos antes de 15 min de incubación a 37 ° C. Mida DCF fluorescencia derivada usando un lector de placas con una longitud de onda de excitación de 480 nm y una emisión wavelength de 530 nm.
   3. Expreso ROS valora con respecto a la concentración de proteína de las células restantes en los pocillos, utilizando un kit colorimétrico para cuantificar la concentración de proteína de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con referencia a una curva estándar para calcular mg de proteína.

Resultados

La salida de la luz entregada a una longitud de onda de 670 nm fue calibrado usando filtros de densidad neutra con el fin de irradiar las células con una gama de fluencias que abarcan una dosis de luz de 670 nm previamente demostrado ser beneficioso en vivo (0,3 J / cm ^{2) 20.} Como el número de filtros de densidad neutra en frente de la fuente de luz aumenta, la intensidad (W / m ²⁾ disminuyó, lo que permite menos luz para pasar a la zona objetivo. La Tabla 1 presenta los datos de calibr...

Discusión

Hemos adaptado con éxito un sistema de suministro de luz precisa y calibrado para proporcionar un mecanismo para el estudio de optimización de R / NIR-LT in vitro. Longitud de onda y la intensidad de los parámetros de R / NIR-LT son capaces de ser manipulado con precisión y eficacia el uso de este sistema. Hemos establecido que el tratamiento de luz de las células no dio lugar a la muerte celular, aunque ROS no se reduce a las longitudes de onda y las dosis entregadas, de los tipos celulares de la prueba. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reagent	Molecular Probes	A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp	Newport Corporation	6258	Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer	Ocean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection	Ocean Optics
200μm diameter quartz fibre optic	Ocean Optics
SpectraSuite Spectroscopy Platform	Ocean Optics
2300 EnSpire Multimode Plate Reader	Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Acute toxicity, wear gloves when handling.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells	American Type Culture Collection	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media	Gibco	11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Gibco	10082-147	Warm to 37 °C in water bath before use
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050-122	Warm to 37 °C in water bath before use
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	Warm to 37 °C in water bath before use
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	Warm to 37 °C in water bath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Warm to 37 °C in water bath before use
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050	Warm to 37 °C in water bath before use
Retinal Muller (rMC1) cells	University of California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Warm to 37 °C in water bath before use
75 cm2 Flasks	BD Biosciences	B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-134	Warm to 37 °C in water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot and store at -20 °C
1X Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black	Corning	CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.	Costar	07-200-103
Seesaw Rocker	Standard lab epuipment
Centrifuge	Standard lab epuipment
Neutral Density Filter Paper (0.3)	THORLABS
442 nm Bandpass Filter	THORLABS	FL441.6-10
550 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB550-10
670 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB670-10
810 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)	THORLABS	NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)	THORLABS	NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)	THORLABS	NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)	THORLABS	NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)	THORLABS	NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)	THORLABS	NE10B