Imaging 3-D y Análisis de neuronas infectadas<em&gt; En Vivo</em&gt; Con<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Resumen

El uso de este protocolo, hemos sido capaces de imagen de 160 micras de espesor secciones de cerebro de ratones infectados con el parásito Toxoplasma gondii, que permite la visualización y el análisis de la relación espacial entre el parásito enquistamiento y la neurona infectada.

Resumen

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado con una amplia gama de huéspedes, incluidos los seres humanos y roedores. En los seres humanos y roedores, Toxoplasma establece una infección persistente de por vida en el cerebro. Mientras que esta infección cerebral es asintomática en la mayoría de las personas inmunocompetentes, en el desarrollo del feto o personas inmunodeprimidas, como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) pacientes, esta predilección por y persistencia en el cerebro puede conducir a la enfermedad neurológica devastadora. Por lo tanto, es evidente que la interacción de cerebros Toxoplasma es crítico para la enfermedad sintomática producida por Toxoplasma, sin embargo, tienen poco entendimiento de la interacción celular o molecular entre células del sistema nervioso central (CNS) y el parásito. En el modelo de ratón de la toxoplasmosis del SNC se ha conocido por más de 30 años que las neuronas son las células en las que el parásito persiste, pero hay poca información disponible sobre la queparte de la neurona es generalmente infecta (soma, dendritas, axón) y si esta relación celular cambia entre cepas. En parte, esta falta es secundaria a la dificultad de formación de imágenes y la visualización de las neuronas infectadas enteras de un animal. Estas imágenes se suelen requerir seccionamiento en serie y costuras de tejido fotografiado por microscopía electrónica o microscopía confocal después de inmunotinción. Mediante la combinación de varias técnicas, el método descrito aquí permite el uso de secciones gruesas (160 micras) para identificar y células de imagen completa que contienen quistes, lo que permite la visualización y el análisis de las neuronas individuales, crónicamente infectadas en tres dimensiones sin la necesidad de inmunotinción, microscopía electrónica o seccionamiento y la costura serie. Usando esta técnica, podemos comenzar a entender la relación celular entre el parásito y la neurona infectada.

Introducción

El objetivo general de este método es la obtención de alta resolución, las imágenes tridimensionales de las neuronas individuales que están infectadas por el parásito intracelular obligado Toxoplasma gondii.

Toxoplasma se considera a menudo uno de los parásitos más exitosos debido a su gran rango de huésped intermediario, que incluye seres humanos y roedores. En los seres humanos y roedores, después de la infección aguda por ingestión de alimentos o agua contaminados, Toxoplasma es capaz de provocar una infección persistente del SNC mediante la conversión de su forma de replicación rápida (taquizoíto) a su lenta replicante y encysting forma (la bradyzoite ). En individuos inmunocompetentes, se cree que esta infección latente CNS a ser relativamente asintomática, pero en individuos inmunocomprometidos, como los pacientes con SIDA o receptores de trasplantes, el recrudecimiento del parásito puede provocar encefalitis por toxoplasma ^1,2 fatal. Además, estudios recientes hahan demostrado que la infección latente por Toxoplasma puede conducir a cambios de comportamiento en roedores ^3,4, aunque el mecanismo sigue siendo desconocido.

Sorprendentemente, a pesar de estos datos destacan la importancia de la interacción CNS Toxoplasma, se sabe relativamente poco acerca de esta relación, sobre todo a nivel celular y molecular. La capacidad para estudiar los aspectos más simples de la interacción parásito-cerebro se ha visto obstaculizada en parte por las limitaciones tecnológicas. Por ejemplo, la mayoría del trabajo que demuestra que las neuronas son las células en las que los quistes persisten se ha hecho con la microscopía electrónica (EM) ^5,6. Aunque EM da alta resolución, es mucho tiempo, mano de obra intensiva, y caro. Ensayos de inmunofluorescencia (IF) han sido recientemente utilizado en conjunción con la microscopía confocal para confirmar el trabajo realizado por EM ^7. Si los análisis son técnicamente fácil de realizar y relativamente barato, pero el uso de estas técnicas para understand la relación espacial entre el quiste y la neurona infectado requiere la reconstrucción de serie, que es mucho tiempo, técnicamente difícil, y puede conducir a la pérdida de información valiosa. Por lo tanto, hemos desarrollado un método que se puede utilizar con el modelo de ratón de la toxoplasmosis CNS y nos permite la imagen de la totalidad de las neuronas infectadas sin EM o inmunohistoquímica (IHC). Mediante el desarrollo de esta técnica, podemos empezar a explorar la relación entre el celular de la célula infectada y el quiste de una manera relativamente rápida y económica.

El método que hemos desarrollado combina nuevas técnicas para la compensación óptica y de imagen secciones de cerebro de espesor por microscopía confocal ⁸ con un sistema que marca en las células in vivo que han sido inyectados con proteínas del parásito ^9,10. En este sistema, se infectan ratones Cre-reportero que expresan una proteína fluorescente verde (GFP) sólo después de la recombinación ^Cre-11 mediada con Toxoplasma Cepas que expresan una proteína fluorescente roja (RFP) y se inyectan la recombinasa Cre en las células huésped ^9. Esta combinación nos permite cosechar el cerebro de ratón infectado después de establecida la infección del SNC, cortar secciones de cerebro de espesor, y rápidamente identificar las áreas pertinentes a la imagen mediante la búsqueda de la RFP ⁺ quistes. Es importante tener en cuenta que a medida que la expresión célula hospedadora de la GFP depende únicamente de la inyección de Cre por parásitos, y no en la infección, un número de las células GFP ⁺ no contienen parásitos ^10. Como el objetivo de este protocolo es capaz de neuronas infectadas imagen enteros, la atención se centra sólo en las buenas prácticas agrarias ⁺ neuronas que contienen también un RFP ⁺ quiste, pero el protocolo también se puede usar para la imagen de la GFP ⁺ / RFP ^- neuronas.

Una vez que el cerebro infectado se cosecha y se seccionó, las secciones se convierten transparente por compensación de glicerol. Regiones apropiadas de secciones se avistaron con microscopía confocal, almugido visualización sin precedentes de las células huésped infectadas y los parásitos enquistados en su totalidad. Aquí le ofrecemos un completo protocolo para la identificación, la compensación óptica y, a las neuronas de imágenes infectado.

Protocolo

NOTA: Los ratones fueron criados y mantenidos en un ambiente controlado de temperatura y humedad con 12 hr invertido ciclos de luz / oscuridad con alimento y agua ad libitum en la Universidad de Arizona. Los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices y aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Arizona. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Los ratones Cre-reportero están en un C57BL / 6 de fondo ¹¹ y están disponibles comercialmente.

1. Ratón Infección

NOTA: El método de infección de ratón con Toxoplasma gondii se describe a continuación ha sido utilizado en los estudios previamente publicados ^{10 - 12.}

1. Cultivar las cepas de Toxoplasma en fibroblastos de prepucio humano (HFFS) cultivadas en alta glucosa de Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) suplementado con 10% FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml streptomycin, y 2 mM L-glutamina (cDMEM) en un matraz T-25 dentro de una incubadora de _CO2 al 5% hasta que los parásitos han formado grandes vacuolas parasitóforas.
2. Parásitos de liberación jeringa raspando las células de la parte inferior del matraz y pasar la solución resultante a través de una aguja de calibre 25 conectada a una jeringa de 3 ml 2 veces interior del matraz a continuación, transferir toda la solución a un caso de la jeringa de 5 ml conectada a una aguja de calibre 27 que se ha colocado boca abajo dentro de un tubo cónico de 15 ml. Conecte el émbolo a la jeringa y pasar la solución del parásito en el tubo cónico.
3. Centrifugar el tubo durante 10 min a 300 x g. Aspirar el sobrenadante a continuación, resuspender el precipitado en 4-6 grado USP ml estéril 1x tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4 (Solución Stock).
4. Cargar un hemocitómetro con 10 l de solución madre, esperar 5-10 minutos para que los parásitos se depositan entonces cuentan el número de parásitos en las cuatro esquinas y el centro de la gran plaza central.
5. Diluir párrsitios a tamaño del inóculo apropiado de 100K / 200 l 1x PBS luego se inyectan ratones por vía intraperitoneal (ip) con un volumen total de 200 l.
   NOTA: Para este procedimiento, los ratones fueron inoculados con 100K Tipo III (CEP) ¹³ taquizoítos en 200 l 1x PBS. Al infectar ratones con otras cepas de Toxoplasma, puede ser necesario ajustar para tener en cuenta el nivel de virulencia concentración de inóculo.

2. Perfusión Cerebral y Cosecha

NOTA: Este protocolo se realizó a 21 días después de la infección (dpi), ya que esto representa el punto de tiempo en el que los números máximos de los quistes se encuentran en el cerebro de ratón, pero otros puntos de tiempo puede ser utilizado. Tamaño, el número, la ubicación, y la presencia o ausencia de quistes depende de muchos factores, incluyendo la cepa de ratón, parásito cepa de tipo, así como el tamaño del inóculo ^{7,14 - 17.} Los investigadores deberán determinar individualmente el inóculo adecuado para el ratón y Toxoplascepa ma él / ella utiliza.

1. Configuración de todas las herramientas de cosecha quirúrgicos (Figura 1).
2. Para cada ratón, preparar y mantener en hielo: jeringa de 20 ml lleno con 0,9% de cloruro de sodio (NaCl) + 10 U / ml de heparina en 1x grado USP estéril PBS (heparina / solución salina); 20 ml jeringa llena con 4% de paraformaldehído (PFA); Vial de centelleo con 15 ml de PFA al 4%. Para múltiples ratones, preparar un vaso lleno de toda la cantidad de cada solución necesaria para todos los ratones luego elaborar una jeringa fresca llena de solución para cada perfusión.
3. Anestesiar al ratón ip con 200 l / 25 g de peso corporal de ketamina cóctel / xilazina (24 mg / ml y 4,8 mg / ml, respectivamente) en el día de su interés. Monitorear el ratón para el nivel de anestesia comprobando reflejo pizca dedo del pie. Continúe con el protocolo sólo una vez que el ratón no muestra respuesta a una pizca dedo del pie firme.
   NOTA: Otros métodos de anestesia se puede utilizar siempre y cuando se alcanza el nivel apropiado de anestesia antesde proceder con el protocolo.
4. Coloque el ratón en la posición supina sobre la plataforma de espuma cubierto. Pin las cuatro extremidades a cabo en los pies y luego rociar el pecho y el abdomen con un 70% de etanol (EtOH) (Figura 2). La adición de varias toallas de papel estéril bajo el ratón puede ser utilizado para ayudar a absorber el desbordamiento de los fluidos de perfusión.
5. Levante la piel justo debajo del esternón con pinzas a continuación, utilizar tijeras para hacer una incisión. Tire de la piel para exponer el pecho (Figura 2B).
6. Levante xifoides proceso y hacer una incisión abdominal justo debajo del diafragma, exponiendo el hígado que se disección roma de distancia desde el diafragma. Hacer dos incisiones, una a la izquierda y de la derecha a través del diafragma y la parte inferior de las costillas. Extender las incisiones izquierda y derecha aproximadamente 1 / 2-2 / 3 manera encima de la caja torácica, que se refleja a continuación, volver a abrir la cavidad torácica (Figura 2C).
   NOTA: Tenga cuidado de no cortar cualquier órgano o los vasos sanguíneos principales dusonar este procedimiento ya que al hacerlo se comprometer la calidad de la perfusión.
7. Perfundir transcardially con 10-20 ml de heparina / solución salina seguido de 10-20 ml 4% PFA.
   NOTA: Si la perfusión se realiza correctamente, el hígado cambia de rojo a bronceado (Figura 2D). Si no se hace correctamente, los vasos sanguíneos serán visibles (Figura 2E).
8. Ponga el ratón sobre su abdomen, pies re-pin luego rociar la cabeza y el cuello con EtOH al 70%. Levantar la piel de la base del cuello y hacer una incisión. Quite la piel para exponer el cráneo (Figura 2F). Decapitar a la cabeza al nivel de los hombros. Retire el cráneo, retire con cuidado el cerebro, y colocarlo en un vial de centelleo lleno de PFA al 4% (Figura 2G-H).
   NOTA: Si bien perfundido, aparecerá blanca sin vasos sanguíneos visibles (Figura 2I) del cerebro. Si el cerebro no está bien perfundido, los vasos sanguíneos serán visibles (Figura 2J).
9. Coloque el scintillación vial con el cerebro en el 4% PFA a 4 ° C durante la noche, cubierto de la luz. Enjuague el cerebro en USP no de grado 1 × PBS y traslado a un nuevo vial de centelleo lleno de frío 1x PBS. Guarde el cerebro en 1x PBS a 4 ° C, protegido de la luz.
   NOTA: claro éxito y la imagen se ha logrado con secciones almacenados en 1x PBS hasta por un mes, pero lo mejor es la sección es el cerebro en pocos días como el almacenamiento prolongado en PBS invertirá la fijación PFA y podría conducir a menos de imágenes óptimas . Autofluorescencia y el aumento de la falta de definición se han observado en algunas secciones fotografiados después de un almacenamiento en 1X PBS durante un mes o más.

3. Cerebro Seccionado

1. Retire el cerebro desde 1x PBS y colocarlo en una matriz de cerebro (Figura 3) para permitir más precisa e incluso cortes a través del cerebro. Se quita los bulbos olfatorios cerebelo y, si está presente, y luego se corta el cerebro coronal en 2 o 3 secciones.
   NOTA: El recorte y corte del cerebro puede hacerse sin la ayuda de una matriz de cerebro. Número de secciones cortadas coronal dependerá de la distancia de corte de la Vibratome siendo utilizado. El cerebro puede ser seccionado en cualquier orientación, aunque secciones sagitales y coronales son los más utilizados para la identificación neuroanatómica.
2. Pegue cada sección del cerebro en un bloque de montaje espécimen con cianoacrilato. Colocar un pequeño bloque de 5% de gel de agarosa detrás de la sección del cerebro de apoyo (Figura 3B).
   NOTA: Otros mecanismos de apoyo pueden ser utilizados, pero sin el apoyo, la Vibratome pueden hacer presión en el cerebro que causa seccionamiento desigual.
3. Cortar tejido en 160 m (distancia de trabajo del objetivo utilizado para formación de imágenes) secciones gruesas con el Vibratome ajusta a una velocidad de 4 y la amplitud de 9.
   NOTA: Los ajustes para la velocidad y la amplitud pueden ajustarse dependiendo de la máquina particular que se usa con el fin de obtener incluso, las secciones lisas. Si los valores sonno es correcto, el resultado puede ser secciones desiguales, desgarro de marcas de tejidos o charla.
4. Recoger las secciones de tejido en un vial de centelleo lleno de frescos, refrigerados 1x PBS si van a ser limpiado en una semana. Si las secciones no van a ser limpiado en una semana, lugar secciones en 1,5 ml tubos de microcentrífuga llenas de solución crioconservante y almacenar a -20 ° C.

4. Compensación óptica de secciones de tejido cerebral

NOTA: Este protocolo ha sido modificado a partir de un método publicado previamente ^8.

1. Preparar 25%, 50%, 75% y 90% de glicerol vol / vol en 1X PBS + 2% de Tween-20 (Gl / PBST).
2. Retire secciones de 1x PBS o, si en crioconservante, enjuague en PBS 1x y transferir a un vial de centelleo que contiene 10 ml de 25% Gl / PBST. Colocar el vial en un agitador a 4 ° C, cubierta de la exposición a la luz, durante 12 h.
3. Confirme que todas las secciones se han hundido a la bottom del vial. Aspirar el 25% Gl / PBST, dejando sólo lo suficiente para cubrir las secciones a continuación, llenar el frasco con 10 ml de 50% Gl / PBST y se deposita en un agitador a 4 ° C, cubierto por la exposición a la luz, durante 12 horas. Repita este proceso para el 75% Gl / PBST entonces el 90% Gl / PBST. Deja secciones en el 90% Gl / PBST durante 24 horas para llegar a la compensación máxima. En el transcurso del proceso de compensación, observar compensación óptica gradual (Figura 4).
   NOTA: Este proceso puede acelerarse si las soluciones se cambian inmediatamente después de las secciones han hundido en el fondo del vial. En el 75% y 90% de soluciones, las secciones no se hundirán todo el camino hasta la parte inferior del vial, pero flotan en el medio.

5. Montaje de secciones de tejido cerebral

1. Corte un No. 1.5 cubreobjetos en 5 piezas para crear un espaciador. Use un lápiz regla y con punta de diamante para anotar y romper el cubreobjetos lo largo de las líneas de trazo discontinuo en la figura 5A. Descartar tque centrar pieza, organizar las 4 piezas exteriores en un portaobjetos de vidrio claro para crear una ventana, y luego cepille esmalte transparente en las costuras para adherir las piezas del separador a la diapositiva en la configuración correcta (Figura 5B).
   NOTA: El separador se utiliza para crear el espacio necesario entre la corredera y el cubreobjetos para el montaje de las secciones despejadas. El cubreobjetos se puede cortar en diferentes formas de crear cualquier tamaño de ventana necesario. Espaciadores de espuma precortadas también están disponibles comercialmente. Para permitir que el esmalte de uñas se seque por completo, lo mejor es hacer diapositivas con espaciadores al menos un día antes de las secciones de montaje.
2. Secciones de traslado a una diapositiva utilizando una pipeta de plástico con la punta cortada. Asegúrese de llenar en los alrededores con un 90% Gl / PBST. Baje cuidadosamente un cubreobjetos sobre las secciones, asegurándose de no introducir burbujas. El exceso de Gl / PBST puede ser malo lejos con un sin pelusas limpie.
3. GFP Imagen ⁺ neuronas que contienen RFP ⁺ Quistes de Toxoplasma gondii con un microscopio confocal de inmediato (Figura 7A-B) y luego almacenar diapositivas plana y protegido de la luz a 4 ° C.
   NOTA: Como alternativa, el sello se desliza completamente alrededor de todos los bordes para almacenar y fotografiados en un momento posterior. El uso de esmalte de uñas transparente para sellar diapositiva es opcional y es posible que sea más difícil de quitar cubreobjetos si uno fuera a eliminar secciones de la diapositiva en una fecha posterior para su posterior procesamiento.

6. Imaging

NOTA: Cualquier microscopio puede ser usado que tiene la capacidad de obtener de alta resolución z-pilas.

1. Después de encontrar inicialmente el plano focal en 10 veces, cambiar a un objetivo de 20X y escanear a través de la sección para identificar un quiste localizado en el interior de un GFP ⁺ células. Centre la región de interés (ROI) en el campo de visión.
2. Cambie a un objetivo de 40X. Enfoque arriba y hacia abajo a través de toda la ROI para asegurarse de que toda la célula y Cyst son visibles.
   NOTA: Las imágenes se obtuvieron usando un microscopio confocal con un objetivo de 40X / 1.30 Petróleo DIC M27.
3. Utilizando el software de imágenes instalado, obtener una pila z que incluye toda la celda con un quiste. Promedio de ajustes utilizados para obtener las imágenes se muestran en la Figura 6.
   NOTA: Los ajustes pueden necesitar ser ajustado en función de cada una las secciones de tejido investigadores y capacidades de microscopio.
4. Obtener una imagen de máxima proyección de la z-stack estableciendo el número de proyecciones a 1. Obtenga una vista rotación completa estableciendo el número de proyecciones a 64.
   NOTA: Otros paquetes de software están disponibles y pueden ser usados ​​para obtener la máxima proyección, de rotación, así como otros puntos de vista de imágenes z-pila.
5. Analizar imagen con el software de análisis de imágenes.

Resultados

La Figura 7 incluye imágenes representativas de dos GFP ⁺ neuronas a partir de dos secciones diferentes 160 m de espesor, así como una medición representativa de la distancia desde quiste a célula-cuerpo para la Figura 7B. Cifras que contiene quiste-7 A y B ilustran que este nuevo protocolo permite la visualización de la neurona infectada en su totalidad. La Figura 7C muestra que con esta técnica de imagen, ahora es pos...

Discusión

Dado que los cambios celulares en las células huésped infectadas han sido vinculados a resultados de la enfermedad en infecciones con otros organismos intracelulares tales como el VIH, la rabia, y Chlamydia ^18,19, hemos desarrollado una técnica que nos permitirá estudiar las interacciones íntimas que se producen entre el SNC sede de célula y Toxoplasma. El método aquí descrito logra este objetivo al permitir imágenes eficiente de las neuronas infectadas crónicamente. Antes del desarrollo de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome Series 1000 Sectioning System	Technical Products International, Inc.		Other vibratomes are compatible
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Premium Slides	Fisher Scientific	12-544-2
#1.5 Coverslips	VWR	48393 251
Diamond Scriber	VWR	52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml	Western Medical Supply, Inc.	4165
AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml	Lloyd Inc.
ZsGreen Mice	Jackson Laboratories	7906	B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment			Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells			These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)	HyClone	SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-Cl
200 mM L-alanyl-L-glutamine	Corning	25-015-Cl
25 cm2 Canted neck flask	Fisher Scientific	1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	VWR	45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade	amresco	K813-500ml
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-aldrich	Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-aldrich	H3393-100KU
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042-500
20 ml Disposable Scintillation Vials	Fisher Scientific	FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof	In-house	17212945	This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software	Bitplane
Clear nail polish			Other brands are compatible
10 ml Syringe with Luer-Lok	VWR	BD309604	Other syringes are compatible
Three-way Stopcock			Any brand is compatible
Hypodermic needle			Any brand is compatible - used to pin down mouse.
Cell Scraper			Any brand is compatible
25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter	Greiner Bio-One	450099	Other brands are compatible