Superficie de medición de potencial de bacterias usando Kelvin Sonda de Microscopía de Fuerza

Resumen

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Resumen

Potencial de superficie es una característica física comúnmente pasado por alto que desempeña un papel dominante en la adhesión de los microorganismos a las superficies del sustrato. Kelvin fuerza sonda microscopía (KPFM) es un módulo de microscopía de fuerza atómica (AFM) que mide la diferencia de potencial de contacto entre las superficies en la nano escala. La combinación de KPFM con AFM permite la generación simultánea de potencial de superficie y mapas topográficos de muestras biológicas tales como células bacterianas. Aquí, empleamos KPFM para examinar los efectos de potencial de superficie sobre la adhesión microbiana a superficies médicamente relevantes como el acero inoxidable y oro. Superficie potencial mapas revelaron diferencias en el potencial de superficie para las membranas microbianas en diferentes sustratos de material. Un gráfico de paso a la altura fue generado para mostrar la diferencia en el potencial de superficie en una zona límite entre la superficie del sustrato y los microorganismos. Los cambios en el potencial de la superficie de la membrana celular se han relacionado con el cambios en el metabolismo celular y la motilidad. Por lo tanto, KPFM representa una herramienta poderosa que se puede utilizar para examinar los cambios de potencial de superficie de la membrana microbiana sobre la adhesión a diversas superficies de sustrato. En este estudio, se demuestra el procedimiento para caracterizar el potencial de la superficie de las células individuales resistentes a la meticilina Staphylococcus aureus USA100 en acero inoxidable y oro usando KPFM.

Introducción

Los biofilms producidos en las superficies del equipo y en las heridas cutáneas presentan un problema para la industria médica como biofilms son recalcitrantes a la eliminación y puede conducir a un aumento de las tasas de transmisión de enfermedades y la resistencia a los antimicrobianos. El apego es el primer paso en la formación de biopelículas y es el paso más crítico debido a su reversibilidad ^1-3. Características de la superficie del sustrato juegan un papel crucial en el apego microbiana. Factores tales como la dureza superficial, porosidad, rugosidad, y la hidrofobicidad se ha demostrado que efectuar la unión microbiana; sin embargo, poca investigación examinar el papel de potencial de superficie de sustrato (SP) en la adhesión microbiana se ha hecho ^4,5. Superficies cargadas negativamente impiden la unión de las esporas de Bacillus thuringiensis a la mica, silicio, y oro ^6. Los cambios en el potencial de la membrana celular son indicativos de los cambios en la unión celular y la motilidad ^5,7. Se ha observado que hom eléctricamentesuperficies ogeneous promueven más fácilmente microbiana adhesión ^5. Caracterizar el potencial de superficie de las bacterias en la nanoescala puede proporcionar una forma novedosa para entender la cinética de adhesión de las bacterias a diversas superficies, y por lo tanto puede ayudar en el desarrollo de estrategias anti-incrustación biológica. A diferencia de otros métodos utilizados para caracterizar la cinética de electro de bacterias, tales como la dispersión de luz electroforética, el potencial zeta, y la determinación del punto isoeléctrico, Kelvin fuerza de sonda de microscopía (KPFM) permite el examen de las células individuales en lugar de culturas enteras ^8-11. Esto es beneficioso cuando se quiere comparar célula-célula o del biofilm características eléctricas con alta exactitud y precisión.

KPFM es un módulo de microscopía de fuerza atómica (AFM). AFM fue desarrollado como resultado directo del microscopio de efecto túnel (STM) ^12. Las primeras imágenes publicadas usando STM fueron hechas por Gerd Binnig y Heinrich Rorhrer en 1982 ¹² . Su invención fue capaz de resolver las estructuras atómicas por trama escanear una punta conductora fuerte sobre una superficie conductora en el aire. Las implicaciones de lograr imágenes de alta resolución biólogos que rápidamente intentaron utilizar STM a imagen muestras secas de ADN, las proteínas y los virus ¹² emocionado. STM también se puede hacer en líquidos utilizando puntas de las sondas especializadas ^13. Esto fue demostrado por Lindsay et al., Que utiliza STM y AFM a moléculas de ADN de imagen en 10 mM HClO ₄ y en el agua, sobre electrodos de oro ^13. KPFM se ha demostrado en la determinación de los potenciales superficiales de ADN y proteína de análisis ²⁵ y biomoléculas interacción con ligandos ^26.

KPFM funciona midiendo la diferencia de potencial de contacto (CPD) entre una punta de AFM en voladizo conductora y una muestra idealmente conductor (Figura 1, i) ^14,15. Las muestras no necesariamente tienen que ser conductora (es decir, sampl biológicaes). Imaging puede llevarse a cabo sobre mica, vidrio, y superficies de silicio (no conductores), siempre que la superficie no conductora es fino y no es un material conductor subyacente ^6,7. El CPD es equivalente al potencial de tensión de la superficie y puede ser descrito como la diferencia en las funciones de trabajo entre la punta _(punta φ) y la muestra _(muestra φ), dividido por la carga del electrón negativo (- e). Cuando una punta de AFM conductora se pone cerca de una superficie de la muestra (separados por la distancia d), se genera una fuerza electrostática (F _es) debido a la diferencia en las energías de Fermi (Figura 1, ii, a) ^15. En este punto, las energías de vacío de la punta y la muestra (E _v) están en equilibrio y alineado. Al llevar la punta más cerca de la superficie de la muestra, la superficie de la punta y la muestra entra en contacto eléctrico y actuar como condensadores de placas paralelas (Figura 1, ii, b ) ^14,15. En el punto, las energías de Fermi de la superficie de la punta y la muestra se alinean, alcanzando un equilibrio de estado estacionario (Figura 1, ii, b). La superficie de la punta y la muestra se cargará y se formará una V _CPD debido a una diferencia en E funciona 's _V y de trabajo. Actos Un F _es en el área de contacto eléctrico debido a la _CPD V formada. Esta fuerza se anula posteriormente a través de la aplicación de una V _DC externa a la punta que tiene la misma magnitud que el _CPD V formado (Figura 1, ii, c). Esto aplica voltaje DC elimina la carga superficial en el área de contacto eléctrico, y la cantidad de V _DC necesario eliminar las F _es de _CPD V es igual a la diferencia en las funciones de trabajo entre la sasuperficie mple y propina ^15. Cabe señalar que la función de trabajo de la punta es conocido y es proporcionada por los fabricantes. En todos los métodos KPFM, una tensión de CA (V _AC, aproximadamente 100 - 500 mV) se aplica también a la punta con el fin de generar fuerzas eléctricas oscilantes entre la punta y la muestra ^14. Esto proporciona una mejor resolución en la medición de los cambios en V _CPD y / o F _es. En este sentido, los cambios en la frecuencia o amplitud de la oscilación eléctrica pueden ser corregidos por V _DC, y la superficie de mapas de potencial pueden ser generados. Los datos de las áreas específicas de estos mapas pueden ser analizados para proporcionar información eléctrica sobre las características topográficas específicas.

KPFM puede funcionar en tres modos: (1) el modo de elevación, el modo (2) la modulación de amplitud (AM) y modulación de frecuencia (FM) ^14,16 (3). Modo de elevación fue el inc inicialarnation de KPFM. Modo de elevación se basa en un método de dos pasos en el que una punta de oscilar, se arrastra a través de la superficie para obtener una imagen topográfica. Para el segundo pase la punta se eleva una distancia predeterminada por encima de la muestra (10 a 100 nm) y se explora de nuevo a través de la misma zona. Debido a este método de dos pasos, modo de elevación, en comparación con AM- FM-KPFM, toma más tiempo para la adquisición de imágenes. El aumento de la punta lejos de la superficie asegura que sólo se mide de largo alcance F _es. Además, la diafonía entre topografía y de la superficie mediciones de potencial se desacopla a expensas de una mayor resolución lateral y sensibilidad.

AM-KPFM mejora la resolución lateral y la sensibilidad mediante el uso de personas con doble frecuencias para medir simultáneamente la topografía de la muestra y potencial de superficie (exploración de una pasada) ^14. En el modo AM, el voladizo se hace oscilar mecánicamente, generalmente 5% por debajo de su primera frecuencia de resonancia (f _0), y eléctricamente oscilado (tediante una V _AC) en su segunda frecuencia de resonancia (f _1). Los cambios en la amplitud de f ₀ conducen a la generación de los datos topográficos, mientras que los cambios en la amplitud de f _1, debido a los cambios en _es F y V _CPD, dan superficiales posibles datos de medición. f ₀ y f ₁ del voladizo están separados por frecuencias y energías importantes que señalan la diafonía se minimiza ^14. La caja electrónica de cabeza (HEB) de la AFM separa las dos señales para indicar tanto topográfica y datos de superficie potenciales simultáneamente en una exploración. FM-KPFM mejora la resolución incluso más allá de AM-KPFM sobre superficies biológicas ^14. FM-KPFM funciona de manera distinta AM-KPFM en que mide los cambios en los gradientes de fuerza electrostática en lugar de fuerza electrostática (F _es) ^15. Al igual que el modo AM, el modo de FM utiliza dual-frecuencias y una singlmecanismo de análisis de correo-pass para obtener topográfico y superficie de datos posibles de forma simultánea ^14. En el modo FM, el voladizo se hace oscilar mecánicamente a f ₀ y eléctricamente oscila a una frecuencia baja modificada (f _mod, típicamente 1 - 5 kHz). Al interacciones electrostáticas, f ₀ y f mezcla _mod para producir bandas laterales f ₀ ± f _mod. Estas bandas laterales son muy sensibles a cambios en la fuerza electrostática, y pueden separarse de f ₀ HEB a través de la AFM. Desde FM-KPFM mide los cambios en los gradientes de fuerza electrostática, las puntas forma del ápice y su mantenimiento / integridad juegan un papel crítico en la superficie global potencial de resolución ^{14, 15.} Superficie resolución potencial utilizando AM y FM están en el rango de 1 nm lateralmente ^{14 -16.} Cabe señalar que la imagen KPFM se puede hacer en líquidos no polares, y más recientemente, se ha demostrado que ser hecho en (<10 mm) líquidos polares iónica baja (enKPFM modos de bucle abierto que no requieren una realimentación de polarización, obviando la aplicación de una polarización DC) como el agua MilliQ; Sin embargo, las imágenes KPFM aún no se ha hecho en las células vivas en soluciones polares ^17-20. Retos adicionales asociados con la formación de imágenes SP en el líquido es que las soluciones comúnmente utilizados para las células que mantienen (es decir, tampón fosfato salino) tienen altas concentraciones de iones móviles, lo que llevaría a reacciones de Faraday, la dinámica de carga de polarización inducida, y difusión de los iones / redistribución ^20. Por lo tanto, para este experimento, las mediciones se tomaron a partir de células de MRSA secos y muertos en superficies de acero inoxidable funcionalizados con poli-L-lisina acero y oro en condiciones ambientales. Imaging puede llevarse a cabo en condiciones de aire o de vacío en muestras biológicas que han sido previamente secado o inmovilizadas sobre superficies ^20. Las condiciones de humedad también se han demostrado afectar de imágenes KPFM de las superficies ^6.

En este estudio, hemos empleado FM-KPFMy AFM para examinar el papel de la SP en la unión de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina USA100 (MRSA) a las superficies de acero inoxidable y oro funcionalizadas poli-L-lisina. MRSA ganó recientemente condición de resistente a múltiples fármacos (MDR) "superbacteria" debido a su resistencia seleccionado naturalmente a muchos antibióticos β-lactámicos y cefalosporinas ^21. Infecciones de MRSA son ahora más difícil, difícil, y formidable para tratar, lo que lleva a la utilización de los antimicrobianos más severas tales como vancomicina o oxazolidinonas que tienen altos niveles de toxicidad en los seres humanos, y por lo tanto no se puede utilizar como tratamientos a largo plazo ^22. El acero inoxidable fue elegido debido a su relevancia médica y el uso común como material en agujas hipodérmicas, orinales, manijas de puertas, lavabos, etc. El oro fue utilizado como un metal comparativa. FM-KPFM se utilizó para examinar si la membrana microbiana SP cambia tras la unión de los sustratos.

Protocolo

1. Preparación de Cristalería y Culturas

1. Antes de continuar con este experimento, preparar agar sangre al 5% de oveja (SBA) placas para el cultivo de MRSA. Incubar las placas SBA durante 24 horas a 37 ° C. Después de este tiempo, las colonias individuales, bien aisladas deben estar presentes para ser utilizado para inoculaciones subsiguientes en medios líquidos. Tienda rayado placas SBA con colonias individuales a 4 ° C durante 1-2 meses.
   NOTA: placas de agar sangre de oveja vienen en paquetes pre-hechos que contienen entre 20 a 25 platos basados ​​en el fabricante, y típicamente consisten en una base de agar de soja tríptico con la adición de 5% w / v de sangre de oveja.
2. Hacer 500 ml de caldo de soja tríptico (TSB) suplementado con 1% de glucosa y 0,1% de NaCl. Después de esto, recoger y limpiar 2 tubos de ensayo de vidrio. Si tapas autoclavables no están disponibles para tubos de ensayo, utilice papel de aluminio como una tapa. Autoclave TSB y tubos de ensayo, junto con una caja de puntas de pipeta 1 ml.
3. En virtud de un gabinete de bioseguridad o cerca de un Bollosen la hornilla, una pipeta 5 ml de TSB previamente en autoclave en tubos de ensayo en autoclave. Tenga cuidado para asegurarse de que el tiempo suficiente se le ha dado para que la TSB y tubos de ensayo enfriar a temperatura ambiente. Desde un 5% placa SBA previamente rayada, inocular una sola colonia en 6 ml de caldo TSB. Una contendrá el SARM, y el segundo tubo de ensayo se utilizó como control negativo para asegurar la esterilidad.
4. Tome tubos de ensayo TSB inoculadas y colocarlos en una incubadora recíproca durante 24 horas a 37 ° C ya 200 rpm. Después de este tiempo el crecimiento microbiano debería ser evidente en el tubo de ensayo MRSA mientras que ningún crecimiento debería haber ocurrido en el tubo de ensayo control.
5. Tomar 1 ml de cultivo de 24 horas y la pipeta en 6 ml de TSB fresco. Incubar a 37 ° C durante 6 horas a 200 rpm.
6. Pipeta 1 ml de 6 hr subcultura en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar durante 3 min a 850 x g. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de _H2O desionizada Centrífuga, repetir y volver a suspender.

2. Limpieza y Inoculación de Acero Inoxidable y Oro Sustratos

1. Tome acero inoxidable y discos de la muestra de AFM de oro (20 mm y 10 mm de diámetro, respectivamente) y limpiar cada lado con 5 ml de _H2O desionizada Mantenga discos de la muestra en la mano dominante con unas pinzas y usar la mano subdominante de pipeta de 5 ml en cada lado del disco de la muestra. Después de lavar ambos lados, discos lugar de la muestra en un vaso que contiene 20 ml de _H2O desionizada seguido por ultrasonidos durante 1 minuto.
2. Después de su uso sonicación fórceps para extraer discos de la muestra del vaso de precipitados. Coloque los discos de forma que se inclinan en un ángulo de 60 ° contra el borde de una placa de Petri abierta sobre una toalla de papel. Utilice la tapa de la placa Petri para cubrir los discos de secado. Deje que los discos se secan totalmente antes de continuar. El tiempo de secado puede variar entre 4 - 8 hr.
3. Una vez seco, el uso de fórceps para colocar discos de la muestra en una placa de Petri.
   1. Opcionalmente, funcionalizar la superficie de discos de la muestra con cualquier material (por ejemplo, colágeno, ácido hialurónico, las nanopartículas de plata, etc.).
   2. Para este experimento, el uso de poli-L-lisina para recubrir la superficie del sustrato. Para poli-L-lisina funcionalización, pipeta de 200 a 400 l de 0,1% de poli-L-lisina (en H ₂ O) en discos de muestra, y dejar incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en una placa de Petri.
   3. Después de 1 hora, use pinzas para sujetar el disco de muestra, y se lava con 1 ml de _H2O desionizada Deje que se seque con toallas de papel como se describe en el paso 2.2.
4. Tome 2x células resuspendidas lavadas y placa 200-400 l en discos de la muestra dentro de un gabinete de bioseguridad. Si los discos de muestra están recubiertas con poli-L-lisina, se incuba durante 0,5 horas a temperatura ambiente.
5. Después de la incubación de las células en discos de muestra, lavar suavemente con discos de la muestra 1 ml de _H2O desionizada Deje secar durante la noche antes de discos de formación de imágenes.

3. KPFM Imaging

NOTA: Para este experimento,utilizar una serie Agilent 5500 ILM-AFM.

1. Para iniciar AFM, encienda la unidad de cómputo junto con el controlador HEB y MAC III de la AFM. Software de imágenes Abrir AFM (por ejemplo, PicoView de Agilent). Asegúrese de seleccionar inicialmente ACAFM o el que sea la denominación correcta es en el AFM para la imagen en modo intermitente contacto.
2. Con unas pinzas de AFM en la mano dominante, y la celebración de la titular de clip de resorte abierto con la mano subdominante, coloque un voladizo KPFM en la cabeza pieza. Tenga cuidado al manipular y transferir la pieza de cabeza a la AFM AFM como esta unidad (al menos en el 5500 ILM-AFM) contiene la unidad de cristal piezo frágil que controla X, Y, Z y direccionalidades de escaneo.
   NOTA: Los voladizos KPFM utilizados en este caso eran Mikromasch DPE conductor (bajo ruido) voladizos con frecuencias de resonancia promedio de 80 kHz y constantes de resorte de 2,7 N / m. Voladizos con estas frecuencias de resonancia y constantes de resorte se eligieron debido a su facilidad de uso.Voladizos con constantes de resorte más grandes y frecuencias de resonancia más altas también se pueden usar para formación de imágenes.
3. Coloque con cuidado la cabeza pieza en el AFM y conectar los cables adecuados (en este caso dos cables tienen que ser enchufado: la luz láser y motor de elevación de fase).
4. Alinear el láser sobre la punta del cantilever. Algunas unidades contienen una funcionalidad de la cámara que permite una alineación más fácil. Si funcionalidad de la cámara no está presente en AFM, alinear en la punta en voladizo como se describe a continuación:
   1. Gire el mando a la derecha de adelante hacia atrás para mover el láser overtop el chip en voladizo. Cuando el láser alcanza el chip será bloqueado y ya no será visible. Sólo gire la perilla de un par de veces.
   2. Gire el mando de adelante hacia atrás en sentido antihorario hasta el punto láser vuelve a aparecer. El láser es ahora en el borde del chip.
   3. Gire el botón de izquierda a derecha para colocar el láser en el voladizo. A medida que el láser pasa sobre el voladizo desaparecerá y reaparecerá in rápida sucesión. El punto de láser debe ser visible en la cubierta de vidrio esmerilado en la unidad fotodiodo tarde sentarse.
   4. Gire el mando de adelante hacia atrás hacia la izquierda para mover el punto por el voladizo hacia la punta hasta el punto en el vidrio esmerilado desaparece.
   5. Gire el mando de adelante hacia atrás las agujas del reloj sólo ligeramente con el fin de posicionar el láser de modo que sólo se sienta en el extremo en voladizo. El punto láser volverá a aparecer en el cristal esmerilado.
      NOTA: Este es el método de posicionamiento láser para voladizos trampolín. Para ménsulas triangulares, el proceso de alineación difiere ligeramente.
5. Una vez que el láser está alineado, mantenga el motor de elevación de fase en la posición "abierto" durante 10 segundos para asegurar suficiente espacio entre la palanca y la muestra al colocar la muestra a la AFM.
6. Coloque la muestra en la etapa de la muestra KPFM. Planta la muestra usando un alambre de cobre. Conecte los cables apropiados desde el AFM para la etapa de la muestra. Conecte los sTage a la AFM. En la mayoría de los casos, la etapa se mantiene en su lugar mediante imanes.
7. En el software de AFM, sintonice el voladizo y luego comenzar enfoque de la punta en voladizo a la muestra. Asegúrese de que el tiempo de estabilización se fija en no más de 10 mseg, y que las velocidades de aproximación no exceda de 2,0 m / seg, a fin de evitar daños en la punta.
8. Una vez que la punta en voladizo está en la superficie de la muestra, seleccione un tamaño de la ventana de imágenes y zona ideal de formación de imágenes. Optimizar ganancias I y P, junto con el punto de modo que la imagen topográfica se optimiza conjunto voladizo.
   1. Una vez que la imagen topográfica se optimiza, encienda módulo KPFM (modo AM FM o; aquí, use el modo FM). Cabe señalar que la imagen KPFM es muy difícil fuera de 5 micras ventana de imagen x 5 m. También, para la proyección de imagen óptima KPFM, utilice una resolución de 512 x 512 con una velocidad lenta exploración (desde 0,02 hasta 0,05 líneas / seg).
9. Para la configuración de FM-KPFM (no ACAFM ajustes), establezca el porcentaje de transmisión entre 5-10%. Ajuste el fr voladizoecuencia entre 1 - 5 kHz con un ancho de banda de 2 kHz. Set I y P ganancias para los ajustes de FM-KPFM a 0,3%.
   1. Varíe el ancho de banda de la señal y yo y ganancias P entre las superficies de la muestra. Para optimizar las imágenes SP, ajustar aún más el ancho de banda de la señal y I y P ganancias para obtener imágenes óptimas. El rango recomendado de ganancias I y P son 0,22 a 0,35%.
10. Procesar y analizar recoge imágenes KPFM utilizando software de procesamiento posterior de las imágenes para recopilar datos SP.

Resultados

La capacidad de medir SP usando KPFM se basa en el principio de que tanto la superficie de la muestra y la punta en voladizo son conductoras hasta cierto punto. Acero inoxidable y oro actuaron como superficies conductoras a las que se adjuntaban MRSA. KPFM imágenes fueron tomadas de 15 células de MRSA en ambas superficies con 512 x 512 resoluciones, y con áreas de escaneado que van desde 5 x 5 m a 10 x 10 m. Scanning se llevó a cabo con velocidades de línea que van desde 0,02 líneas / seg a 0,05 líneas / seg. Por...

Discusión

KPFM fue empleado como una novedosa técnica para la obtención de los datos eléctricos de superficie. Comúnmente se ha utilizado como un método para examinar la distribución de carga en química y sólo recientemente ha comenzado a aplicar para el estudio de sistemas biológicos en la micro y nano-escala. A partir de los datos recogidos, se encontró que los microbios no parecían adjuntar fácilmente para limpiar las superficies de acero inoxidable y oro, incluso después de 3 horas de incubación estática. Super...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5500ILM Atomic Force Microscope	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16219	Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16218-G	Gold sample discs
PicoView Software	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BD	#221261	Pre-made plates
Tryptic Soy Broth	BD	#257107	Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container.