Modelo murino de la arteria femoral Lesiones Alambre con implantación de un perivascular Drug Delivery Patch

Resumen

We describe a surgical technique that produces wire injury in the femoral artery of mice to induce neointimal hyperplasia to serve as a model testing system for the perivascular delivery of therapeutic compounds for the inhibition of restenosis.

Resumen

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. While these therapies lead to the rapid restoration of blood flow, these technologies remain limited by restenosis in the case of bare metal stents and angioplasty, or reduced healing and possibly enhanced risk of thrombosis in the case of drug eluting stents. A key pathophysiological mechanism in the formation of restenosis is intimal hyperplasia caused by the activation of vascular smooth muscle cells and inflammation due to arterial stretch and injury. Surgeries that induce arterial injury in genetically modified mice are useful for the mechanistic study of the vascular response to injury but are often technically challenging to perform in mouse models due to the their small size and lack of appropriate sized devices. We describe two approaches for a surgical technique that induces endothelial denudation and arterial stretch in the femoral artery of mice to produce robust neointimal hyperplasia. The first approach creates an arteriotomy in the muscular branch of the femoral artery to obtain vascular access. Following wire injury this arterial branch is ligated to close the arteriotomy. A second approach creates an arteriotomy in the main femoral artery that is later closed through localized cautery. This method allows for vascular access through a larger vessel and, consequently, provides a less technically demanding procedure that can be used in smaller mice. Following either method of arterial injury, a degradable drug delivery patch can be placed over or around the injured artery to deliver therapeutic agents.

Introducción

Arterial injury and inflammation caused by angioplasty and stent implantation can induce neointimal hyperplasia that contributes to the thickening of the arterial wall, a process known as restenosis.^1,2 The formation of restenosis is major mode of failure for interventions such as angioplasty and stenting with bare metal stents.³ Due to recent concerns with the inhibition of vascular healing in arteries treated with drug eluting stents, there is also a need to find compounds that can inhibit restenosis while maintaining vascular healing and re-endothelialization.^4-7 In addition, while stents have had success in the coronary vasculature, percutaneous interventions of all types in the peripheral arteries continue to fail at a higher rate due to restenosis.^8-10 Mouse models of surgical interventions allow the use of powerful genetic manipulations that can provide mechanistic insight into the mechanisms underlying the failure of clinical therapies and can provide an initial test bed for compounds to inhibit intimal hyperplasia.

Here, we describe a mouse model of vascular injury that allows the testing of therapeutic compounds to inhibit neointimal hyperplasia and assess whether their effects on re-endothelialization following endothelial denudation. A key challenge in executing vascular injury in mice is the technical skill needed to obtain vascular access and to restore flow to the injured artery following the wire injury. For this reason, simple arterial ligation models have been used to study neointimal hyperplasia in mice that do not require endovascular manipulations but are easier to implement.¹¹ However, this type of surgical model differs substantially from the mechanical and biological aspects of a percutaneous intervention, lacking key aspects including arterial wall stretch, endothelial denudation and luminal blood flow following injury.

We present two methods for obtaining and closing vascular access for wire injury of the femoral artery in mice. The first technique is the conventional method described by several groups previously and uses vascular access through a side branch of the femoral artery.^12-14 This method requires older, larger mice and more surgical skill to implement the endoluminal access through the smaller artery. It also requires the ligation of the muscular branch of the femoral artery following the procedure. The second method we describe uses an arteriotomy in the branch point of the main and side branch and thereby allows for a larger access to the artery for performing wire injury. In this method, the arteriotomy is closed using controlled local cauterization that leaves both branches with blood flow following the procedure. The conventional method is applicable to mice of at least 20 weeks of age while the alternative method can be used in mice of at least 15 weeks of age. In both methods, the wire creates arterial stretch and abrasion leading to injury and endothelial denudation. Following either procedure a perivascular drug delivery patch can be implanted that allows the delivery of compounds to alter the response to injury. The use of the drug delivery patch allows mice to be used as a test bed for new compounds to inhibit restenosis through perivascular therapies.^15,16

Protocolo

NOTA: Todos los métodos que se muestran en este protocolo han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional.

1. Preparación de la Tabla quirúrgico

1. Configurar la almohada eléctrica con recirculación de agua caliente en la mesa de operaciones, bajo el microscopio de disección. Colocar la placa base de acero inoxidable en la almohadilla de calefacción. Coloque una almohadilla absorbente estéril en la placa base y el cojín de la calefacción.
2. Organizar las herramientas quirúrgicas estériles sobre una almohadilla absorbente estéril adyacente. Reunir dos pares de pinzas finas con punta en ángulo, dos pares de pinzas en ángulo, tres pinzas hemostáticas, dos hilos retractores, pequeñas tijeras quirúrgicas, micro-tijeras, alambre de una angioplastia (diámetro 0,15 pulgadas) y tres segmentos de 6 pulgadas de sutura de seda 6.0 .
3. Doblar el extremo redondo del cable de angioplastia para que coincida con la curvatura de la arteria femoral. Esto hará que sea más fácil para avanzar el alambre durante la cirugía.

2. Preparación deRatón de Cirugía

1. Anestesiar a un ratón por inhalación continua de 2,5% de isoflurano. Asegúrese de controlar el estado de los animales durante todo el procedimiento. Realizar una prueba del pellizco del pie del ratón para confirmar que está totalmente anestesiado. Asegúrese de que el animal no se mueve cuando se administra la prueba del pellizco.
2. Aplicar una pomada lubricante a los ojos del animal para evitar la desecación. Asegurar el animal en posición supina a la almohadilla absorbente utilizando cinta quirúrgica. Continuar administrando 2,5% isoflurano a través de cono de la nariz.
3. El uso de una crema depilatoria, quite la piel de la pierna y el abdomen a la línea media. Enjuagar bien la piel con agua. Depilación puede realizarse un día antes de la cirugía. Tenga en cuenta que el tratamiento excesivo con la crema puede dar lugar a irritación de la piel.
4. Inmediatamente antes de la cirugía, aplicar povidona yodada al área depilada con un aplicador con punta de algodón para esterilizar la piel. Enjuague la piel depilada con etanol al 70% y secacon un aplicador con punta de algodón estéril. Repetir 3 veces.
5. Administrar una dosis pre-operatorio de 5 mg / kg de carprofeno a través de inyección subcutánea.

3. El aislamiento de la arteria femoral

1. El uso de pequeñas tijeras quirúrgicas, hacer una incisión curva en la piel sobre la arteria femoral. Sin rodeos diseccionar y asegurar los tejidos circundantes utilizando retractores fijadores retractores magnética para localizar la arteria femoral. Humedezca los tejidos utilizando periódicamente salina para el riego Aplique solución salina utilizando un aplicador con punta de algodón estéril.
2. Aislar la arteria femoral utilizando fórceps. Separar suavemente el nervio del paquete vascular utilizando pinzas de punta fina. Evite punción de la vena, y no dañar el nervio. Empuje el nervio lejos del paquete para evitar estimularla.
3. Separar suavemente la vena femoral de la arteria femoral, la localización de la bifurcación femoral. La región de la bifurcación es especialmente difícil para diseccionar.
4. Posterior a la bifurcación, bucle de una sutura de seda 6.0 debajo de la arteria femoral y seguro con una pinza hemostática. Esta sutura proximal se utiliza para restringir el flujo sanguíneo en la arteria.
   NOTA: Hay una ligera variación en los lazos cuando se realiza el método de ligadura en comparación con el método de cauterización (ver Figura 1 y Figura 2).
5. Distal a la bifurcación, bucle de sutura de seda 6.0 debajo de la arteria femoral y seguro con una pinza hemostática. Este distales ayudas de sutura en el posicionamiento de la arteria.
6. Loop dos suturas bajo la rama muscular de la arteria femoral, pre-atarlos y seguros con una pinza hemostática. Recuerde humedecer los tejidos con solución salina. Si la realización del método de cauterización de la lesión de alambre, sólo una sutura en bucle es necesario en la rama muscular.

4. Rendimiento de la arteria femoral Lesiones alambre

1. Restringir el flujo sanguíneo en la arteria femoral, tirando del hilo de sutura proximal. Levemente tire el hemost distalen pinza hemostática y asegurar la rama para exponer el sitio de la arteriotomía. Ligar la rama muscular, atando la sutura alrededor.
   NOTA: El levantamiento de la arteria hacia arriba restringirá de manera más eficaz el flujo de sangre que tirando horizontalmente solo.
2. Cortar la rama pequeña con el cauterio entre los dos puntos de sutura. El uso de micro-tijeras, realizar una arteriotomía en la rama lateral de la bifurcación. El uso de fórceps en equilibrio sobre un rollo de cinta quirúrgica para estabilizar los micro-tijeras.
3. Confirmar la presencia de la arteriotomía usando pinzas de punta fina. Levante suavemente la apertura de la arteriotomía con las pinzas. Introducir el extremo redondeado del cable en la arteriotomía usando pinzas. Para facilitar el avance del alambre, añadir una o dos gotas de lidocaína para la región usando una jeringa.
4. Cuando el cable alcanza la sutura proximal, liberar la sutura y ajustarlo de manera que no puede impedir el avance del alambre. Inserte el cable hasta que no pueda avanzar más. La punta del XXe alambre debe parar en la región del ligamento inguinal.
5. Permita que el cable permanezca en la arteria femoral durante un minuto. Después de un minuto, retraer y avanzar en el alambre en un movimiento de sierra diez veces a herir y despojar el endotelio de la arteria femoral. Para una lesión de menor gravedad, disminuir el número de veces que se tira del cable dentro y fuera de la arteria o dejar el cable en la arteria por sólo 1 min.
6. Retraer el cable lentamente. Cuando el extremo redondo del cable ha pasado la sutura proximal, restringir el flujo en la arteria tirando de la sutura proximal. Retraer el cable completamente.

5. ligando el Poder Muscular

1. Apriete la sutura restante en la rama muscular. Esto evitará el sangrado de la arteriotomía. Flujo de retorno a la rama muscular, y confirme que la sangre no se está escapando de ella. Recorte los extremos de las suturas en la rama muscular.

6. Método alternativo: Localizada Caurización de la arteriotomía

NOTA: Un enfoque alternativo se pueden tomar para evitar la ligadura de la rama muscular y permitir el acceso vascular a través de la arteria femoral principal más grande.

1. A partir de 4,1, restringir el flujo a la arteria femoral, tirando de la sutura proximal. Tire de la sutura distal y el aseguramiento de la sutura muscular de la rama ligeramente para exponer el sitio de la arteriotomía (Figura 1 y Figura 2).
2. El uso de micro-tijeras, realizar una arteriotomía en el punto de la arteria femoral y la rama musculoso rama. Si la incisión se hace en el lado de la arteria, puede ser más fácil para cauterizar. El uso de fórceps en equilibrio sobre un rollo de cinta quirúrgica para estabilizar los micro-tijeras.
3. Para probar el éxito de la cauterización, para restaurar el flujo de la arteria femoral aflojando la sutura proximal. Si el sangrado se produce a partir de la arteriotomía, repita el cauterio. Si el cauterio tiene éxito, el flujo de sangre será realmacenado distal a la arteriotomía.
4. Introducir el cable y realizar la lesión de alambre como se describe en la sección 4.
5. Continuar restringir el flujo sanguíneo en la arteria femoral. Calentar un cauterio fino con punta de al menos 6 pulgadas de distancia del ratón. Como la punta de cauterización se enfría, se aplican a la ligera lado de la arteriotomía para cerrar la incisión.
6. Para probar el éxito de la cauterización, para restaurar el flujo de la arteria femoral aflojando la sutura proximal. Si el sangrado se produce a partir de la arteriotomía, repita el cauterio. Si el cauterio tiene éxito, el flujo sanguíneo se restaurará distal a la arteriotomía. Retire el proximal temporal y lazos distales.

7. Implantación de perivascular Drug Delivery Patch

1. Crear un parche de drogas perivascular se puede crear como se ha descrito en estudios previos ¹¹ o mediante el uso de métodos similares. Blunt los rincones de la región de la barrera del parche de administración de fármacos utilizando tijeras estériles
2. Coloque la palmadita de administración de fármacosch en la arteria femoral lesionado con el lado de liberación de fármaco frente a la arteria. Según sea necesario, el uso de fórceps para mejorar la posición del parche.

8. cierre de la herida y Recuperación

1. Cierre de la herida con una sutura interrumpida simple que consiste en nudos cuadrados. Una sutura discontinua prolonga cierre de la herida en el caso de que el animal intenta quitar la sutura.
2. Apague la anestesia y retirar al animal de la puesta en marcha. Deje que el animal se recupere en la plataforma de calentamiento.
3. Continúe controlando la recuperación del ratón. Revise el sitio de la incisión todos los días para asegurarse de que permanece cerrado. Para el tratamiento del dolor post-quirúrgico, administrar una inyección subcutánea de 5 mg / kg del carprofeno cada 12 hr después de la cirugía y luego cada 12 horas durante 2 días. Si el dolor continúa después de los primeros 2 días, consulte a un veterinario para obtener instrucciones sobre más medicamentos para el dolor.

9. Las arterias femorales cosecha de Histología

1. A los 28 días posteriores a la cirugía, lleve a cabo la eutanasia de dióxido de carbono en el ratón.
   NOTA: La velocidad de flujo adecuada de dióxido de carbono debería desplazar el 10-30% de la cámara por minuto y pueden variar dependiendo del tamaño de la cámara utilizada. El corte de diafragma y punción cardiaca debe realizarse como un método secundario de la eutanasia.
2. Asegure el ratón en la posición supina utilizando cinta quirúrgica. Hacer una incisión sobre la arteria femoral, donde se hizo la incisión quirúrgica inicial.
3. Por tanto la arteria lesionada y no lesionada de la arteria de la pierna contralateral, sin rodeos diseccionar y asegurar los tejidos circundantes utilizando retractores y fijadores retractor magnéticas para localizar la arteria femoral. Humedezca los tejidos utilizando periódicamente salina para el riego. Aplicar solución salina utilizando un aplicador con punta de algodón estéril. Tenga cuidado de no dañar la arteria.
4. Después de la arteria femoral ha sido aislado desde el sitio de la arteriotomía original a la aorta abdominal, atar un segción de sutura de seda cerca del sitio original de la arteriotomía. Esta sutura ayudará a identificar el extremo más distal de la arteria femoral y la facilidad de manipulación de la muestra.
5. Con las tijeras micro-disección para extirpar la arteria femoral. Hacer una incisión distal a la sutura. Hacer que la otra incisión en el extremo opuesto de la arteria femoral, al lado de la aorta abdominal.
6. Transferencia de la arteria extirpado a una placa petri de vidrio que contiene solución salina. Diseccionar la arteria posterior para eliminar el exceso de tejido conectivo o grasa. Retire suavemente la sangre desde el lumen de un enjuague con solución salina.
7. Transferencia de la arteria de un vial de 10% de formalina tamponada. Guarde el vial a 4 ° C con agitación suave durante 48 horas.
8. Transferencia de la arteria fijado a 70% de etanol, para almacenar hasta que se procesó para histología.
9. Insertar la arteria en bloques de parafina y sección de los bloques para la tinción.
10. Realizar tinción histoquímica y inmunoquímica para evaluar el alcance de la lesión y de la íntima hyperplasia.
    NOTA: Para obtener los resultados representativos, utilizamos hematoxilina y eosina para visualizar los núcleos y morfología general o Pentachrome mancha de un Movat para visualizar las láminas elásticas y otros componentes arteriales.

Resultados

Tras la lesión de alambre, hiperplasia neointimal se desarrolla con el tiempo y se examina típicamente después de 14 a 28 días. Las técnicas descritas en este cable de trabajo a la generación robusta de la hiperplasia intimal en ratones como se muestra los resultados histológicos en la Figura 3. Una arteria femoral ileso demostrarán laminillas elástica intacto y un espesor normal y circunferencia. Una arteria femoral heridos mostrará hiperplasia de la íntima, degradado laminillas elásticas y...

Discusión

We have presented a method for performing vascular injury in mice and delivery therapeutic compounds to the injured region through a perivascular cuff. The ligation method for femoral and carotid arteries has been described in conventional methods papers and characterized extensively^11-14,19-23 and we present an alternative method for achieving the same vascular injury that is less technically demanding procedure that can often be used in younger mice. One of the chief advantages of the using a mouse wire inju...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight spring wire, 0.15” diameter	Cook	G02426
High Temperature cautery	Bovie Medical Corp.	HIT1
High-temperature fine tip for cautery	Bovie Medical Corp.	H101
Micro-scissors	Fine Science Tools	15000-13	For performance of arteriotomy
Angled fine-tipped forceps	Fine Science Tools	11251-35	For blunt dissection of vascular bundle
Angled forceps	Roboz	RS-5069	For clearing tissues
Surgical scissors	Roboz	RS-5840	For cutting skin
Retractor	Fine Science Tools	18200-10
Retractor wire	Fine Science Tools	18200-05	Attached to retractor
Base plate	Fine Science Tools	18200-03	For use with retractor
Magnetic retractor fixator	Fine Science Tools	18200-01
Needle Holder	Roboz	RS-7822
Hemostatic forceps	Biomedical Research Instruments, Inc.	34-1000
Dissecting microscope	Meiji Techno	EMZ-5TR
Microscope light source	Meiji Techno	FT191
Warm water recirculator	Gaymar	TP-500	For maintaining mouse body temperature
Reusable heating pad	Gaymar	TP-R 22G	For maintaining mouse body temperature
Lidocaine	Various
4.0 Vicryl suture with half circle needle	Ethicon	J494G	For post-surgical wound closure
Sterile cotton-tipped applicators	Puritan	25-806-2WC	For application of depilatory cream and absorbing fluids
Depilatory cream	Nair
Isoflurane	Various
Betadine	Various
70% ethanol	Various
6.0 braided silk suture	Teleflex Medical	4-S	For isolation of femoral artery during surgery
0.9% sodium chloride	Various		For irrigating tissues
Gel eye lubricant	Various
Glass Petri dish	Pyrex	3160-60	For femoral artery harvest
10% buffered formalin	Various		For fixation of femoral artery
70% ethanol	Various		For fixation of femoral artery
Bouin's fluid	Electron Microscopy Sciences		For Movat's Pentachrome staining
Alcian blue, 1%	Electron Microscopy Sciences	26385-01	For Movat's Pentachrome staining
Alkaline alcohol	Electron Microscopy Sciences	26385-02	For Movat's Pentachrome staining
Orcein, 0.2%	Electron Microscopy Sciences	26385-03	For Movat's Pentachrome staining
Hematoxylin alcoholic, 5%	Electron Microscopy Sciences	26385-04	For Movat's Pentachrome staining
Ferric chloride, 10%	Electron Microscopy Sciences	26385-05	For Movat's Pentachrome staining
Lugol's Iodine	Electron Microscopy Sciences	26385-06	For Movat's Pentachrome staining
Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution	Electron Microscopy Sciences	26385-07	For Movat's Pentachrome staining
Acetic acid, 0.5%	Electron Microscopy Sciences	Various	For Movat's Pentachrome staining
Phosphotungstic acid, 5%	Electron Microscopy Sciences	26385-09	For Movat's Pentachrome staining
Alcoholic saffron, 6%	Electron Microscopy Sciences	26385-10	For Movat's Pentachrome staining