Examen de Rapid dopamina Dinámica con Fast Scan voltametría cíclica Durante intraoral Administración saborizante en ratas Awake

Resumen

Rapid fluctuations in extracellular dopamine (DA) mediate both reward processing and motivated behavior in mammals. This manuscript describes the combined use of fast scan cyclic voltammetry (FSCV) and intra-oral tastant administration to determine how tastants alter rapid dopamine release in awake, freely moving rats.

Resumen

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. Fast scan cyclic voltammetry (FSCV) is an electrochemical technique with high spatial and temporal (sub-second) resolution that has been utilized to examine phasic DA release in several types of preparations. In vitro experiments in single-cells and brain slices and in vivo experiments in anesthetized rodents have been used to identify mechanisms that mediate dopamine release and uptake under normal conditions and in disease models. Over the last 20 years, in vivo FSCV experiments in awake, freely moving rodents have also provided insight of dopaminergic mechanisms in reward processing and reward learning. One major advantage of the awake, freely moving preparation is the ability to examine rapid DA fluctuations that are time-locked to specific behavioral events or to reward or cue presentation. However, one limitation of combined behavior and voltammetry experiments is the difficulty of dissociating DA effects that are specific to primary rewarding or aversive stimuli from co-occurring DA fluctuations that mediate reward-directed or other motor behaviors. Here, we describe a combined method using in vivo FSCV and intra-oral infusion in an awake rat to directly investigate DA responses to oral tastants. In these experiments, oral tastants are infused directly to the palate of the rat – bypassing reward-directed behavior and voluntary drinking behavior – allowing for direct examination of DA responses to tastant stimuli.

Introducción

Phasic DA release plays an important role in mediating reward-directed behavior ^[1-3]. However, isolating and studying how a primary reward alters phasic DA release is often complicated by co-occurring behavioral or cognitive processes that are also capable of altering phasic DA release - such as decision making processes or reward-directed motor behavior to acquire the reward. In the current work, we isolate phasic DA responses to tastants through the use of in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) combined with tastant delivery through intraoral cannulae. This technique bypasses choice and action and allows us to examine extracellular DA release during direct infusion of a tastant to the palate of a rat.

FSCV is an electrochemical technique with high temporal and spatial resolution, permitting measurements of DA release in a discrete local area (approximately 100 µm) on a sub-second scale (10 Hz resolution). The combination of intra-oral delivery and FSCV provides the advantage of observing rapid, 'real-time' DA responses to a tastant, which cannot be examined using conventional microdialysis methods. Furthermore, phasic DA release in response to either rewards or reward-associated cues occurs at concentrations between 20-100 nM, which is above the 10-20 nM detection threshold for FSCV ^[4]. The high spatial resolution of FSCV also permits recording from sub-regions of small brain areas, such as the nucleus accumbens core (NAc). Thus, FSCV combined with intraoral infusions of tastants is an ideal model for studying how tastants or other stimuli alter phasic DA release in an awake, behaving animals. Indeed, these techniques have permitted experiments investigating how rewarding and aversive tastants alter extracellular DA release ^[5].

Over the last decade, FSCV analyses have been successfully combined with intravenous drug delivery ^[6] and rat self-administration paradigms ^{[7, 8]} to identify the role of phasic DA mechanisms in drug addiction models. In addition, combined intraoral delivery with FSCV has been used to examine how tastant cues paired with cocaine availability modulate phasic DA release and behavioral responses that reflect emotional affect ^[3]. This combined intraoral and FSCV methodology can also be powerfully utilized to examine phasic DA responses to flavorants, such as menthol and oral sweeteners, that are added to cigarettes and dissolvable tobacco products ^[9-11]. Although many of the flavorants added to tobacco products are appetitive ^[9-11], it is unknown if these flavorants increase phasic DA release in a manner consistent with a rewarding hedonic valence. Indeed, flavorants added to cigarettes and to dissolvable tobacco products may have direct effects on the DA reward system and may act through dopaminergic mechanisms to influence the rewarding valence of cigarettes and other tobacco products. Thus, intraoral delivery combined with FSCV can provide new understanding on how flavorants modulate rapid DA release. The use of combined intra-oral and in vivo FSCV methodology, and the data obtained from such studies, can also facilitate future studies to determine how flavorants and nicotine interact to alter DA signaling and to potentially modulate nicotine reinforcement. Further, the data gained from such studies can be used to inform regulatory decisions about tobacco product flavorants.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el animal de Atención Institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Yale (IACUC).

Preparativos 1) Pre-quirúrgicos

1. Preparación de la solución oral
   1. Crear soluciones de 10% de sacarosa y 0,005% de L-mentol en agua desionizada (pH 7,4). Guarde estas soluciones en envases cerrados, a temperatura ambiente, y rehacer cada 2 semanas, para evitar la degradación.
2. Soluciones de calibración del electrodo
   1. Hacer tampón Tris (pH 7,4) en cualquier momento antes de la calibración. La solución consiste en 12,0 mM Tris-HCl, NaCl 140 mM, 3,25 mM KCl, 1,20 mM de CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM de MgCl _2, y 2,00 mM Na ₂ SO _4.
   2. Crear una solución madre de 10 mM de dopamina (DA; clorhidrato de dopamina) en ácido perclórico 0,1 M. El ácido perclórico ayuda a prevenir la oxidación de la dopaminae. Guarde esta solución madre a -20 ° C y utilizar durante un máximo de 6 meses. Haga varias alícuotas de la solución madre DA para el almacenamiento de usar cada alícuota sólo una vez.
   3. De la población de 10 mM DA, soluciones diluidas en tampón Tris a concentraciones de 1 M, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, y 31,25 nM.
   4. Para la calibración de pH, se preparan soluciones de tampón Tris con el pH de 7,2, 7,3, 7,5, y 7,6. Esto proporcionará soluciones que imitan los cambios de pH que pueden ocurrir durante el experimento in vivo.
3. La fabricación de electrodos
   1. Por succión al vacío, aspirar una fibra de carbono T-650 (7 m de diámetro) en un capilar de vidrio de borosilicato (longitud 10 mm, de diámetro exterior de 0,6 mm, 0,4 mm de diámetro interior).
   2. Coloque capilar de vidrio lleno de fibra de carbono en un extractor de electrodos vertical. Para los parámetros iniciales, establezca el calentador a 55,0 y apague el imán. Sin embargo, una optimización adicional puede ser necesario ya que tanto el calentador y los ajustes magnéticos varían frlaboratorio om al laboratorio.
      Nota: El electrodo debe ser al menos 5,5 cm de largo (incluyendo conicidad) de manera que puede encajar fácilmente en el micromanipulador y ser insertado al menos 6,9 mm por debajo de la duramadre en el cerebro de rata. Si el electrodo es demasiado corto, las grabaciones de la porción ventral del núcleo accumbens no serán alcanzables. Por otro lado, la longitud total del electrodo no debe exceder de 6,5 cm de lo contrario será demasiado largo para encajar en el micromanipulador.
   3. El uso de un microscopio de luz, cortar la fibra de carbono expuesta de modo que se extiende 75-100 micras más allá del final de la copa. Verificar que el electrodo tiene un muy estrecho, apenas discernible, sello entre el electrodo de vidrio y fibra de carbono, que producirá un mínimo de ruido durante la grabación posterior. Deseche el electrodo si hay grietas visibles en el vidrio o si el sello está floja, lo cual es indicativo de un sello pobre. Para obtener instrucciones más detalladas, consulte [12] y [13].
4. Montaje del electrodo en el micrófonoromanipulator
   1. Obtener un 3 en, alambre 30G que está aislado a lo largo de la mitad de la longitud del alambre y utilizar un pequeño cepillo para aplicar una fina capa de pintura de plata directamente al cable. Inmediatamente después de aplicar la pintura de plata, insertar el cable en el orificio en la parte superior del electrodo para proporcionar una conexión física y eléctrica a la fibra de carbono. Bajo el microscopio, asegúrese de que el hilo de plata entra en contacto con la fibra de carbono.
   2. Asegure el alambre de plata y el electrodo a la micromanipulador usando encogimiento del calor.
   3. Coloque el electrodo de fibra de carbono preparado en alcohol isopropílico purificado (IPA) durante al menos 10 min para limpiar la superficie del electrodo y para aumentar la posterior sensibilidad a la dopamina. Después de remojar en IPA, enjuagar la fibra de carbono con el agua del grifo para eliminar el IPA.
5. Referencia fabricación de electrodos
   1. Tome un alambre de 13 mm de plata que contiene una malla de aproximadamente 6 mm de Ag / Ag Cl (alambre de plata 7 mm solos, malla de 6 mm, 0.4 mm de diámetro),cortar la parte de plata hasta aproximadamente la mitad de su longitud original y soldar la porción de plata del alambre a un alfiler de oro.
   2. Aplicar epoxi sobre la soldadura en el pasador.
   3. Sumergir el Ag / Ag Cl malla extremo en un copolímero de 5% politetrafluoroetileno y perfluoro-3,6-dioxa-4-metil-7octene-sulfónico ácido 5 veces, con periodos de secado al aire 30 min entre cada inmersión.
   4. Deje que el recubierto de Ag / Ag Cl malla se seque al aire O / N.
   5. Curar en el horno a 120 ºC durante 1 hora.

2) Cirugía Combinada intraoral y Cirugía intracraneal Canulación (aproximadamente 75 min)

1. Fabricación Oral catéter
   1. Hacer que el catéter oral, y esterilizar por esterilización con óxido de etileno, al menos 10 días antes de la cirugía.
   2. Cortar PE 100 tubo en 6 cm segmentos largos.
   3. El uso de un soldador, fundir un extremo de la tubería de PE e inmediatamente presionar contra una superficie sólida para enfriar el tubo de PE. El resultado debe crearun disco pequeño, plano en un extremo de la tubería de PE y no debe ser embridado. Use una aguja (18 G) o contacto del empuje para crear un agujero en el centro de este disco.
   4. En el otro extremo de la tubería de PE, perfectamente insertar el extremo romo de una aguja G 18 en el tubo.
   5. Usando una perforadora de papel estándar, perforar varias piezas circulares de una hoja de politetrafluoroetileno (3,18 mm de espesor, 6 mm de diámetro) para crear arandelas politetrafluoroetileno.
   6. Crear un agujero en el centro de la lavadora. Tome la aguja unida a la tubería de PE y empujarla completamente a través de la lavadora. Una vez que la aguja es a través de, deslice la lavadora a la parte inferior de la tubería de PE de modo que quede al ras contra la arandela.
2. Cirugía Oral
   1. Después de la esterilización de la herramientas quirúrgicas, cánula (recortado a 2,5 mm por debajo del pedestal antes de la esterilización), y el electrodo de referencia, anestesiar la rata con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg).
      1. After 5 min, se aplica una prueba de estímulo nocivo (pie o pellizcar la cola) para evaluar el nivel de la anestesia. Si el sujeto muestra ninguna reacción física a la prueba de estímulo nocivo (estremecerse respuesta, aumento en la frecuencia respiratoria o del corazón), administrar un impulso ketamina de 10% a 15% de la dosis original y repetir el protocolo de estímulo nocivo anteriormente.
   2. Después de la rata es totalmente anestesiado y no muestra ninguna reacción a la prueba de estímulo nocivo, utilice cortar el pelo de animales para afeitar la piel de la rata de los ojos de unos 2 mm detrás de las orejas. A continuación, coloque la rata en una recirculación de agua almohadilla eléctrica delgada para mantener la temperatura corporal durante la cirugía. Aplicar lubricante ocular. Administrar el fármaco no esteroide anti-inflamatorio (NSAID), carprofeno (5 mg / kg), por inyección intraperitoneal antes de realizar ninguna incisión y antes de la inserción de cánulas intraorales. Utilice una técnica aséptica en todo momento.
   3. Aplicar betadine seguido por etanol al 70% para limpiar la piel. Repita 3 veces.
   4. Place la rata en su parte posterior, y abra la boca con un hisopo de algodón estéril. Encuentra el primer molar superior.
   5. Inserte la aguja en el tejido entre la mejilla y el primer molar superior hasta que la aguja sale justo detrás y medial a los oídos.
   6. Pierce la aguja a través de la piel hasta que el tubo PE sale de la piel y es accesible.
   7. Tire hacia arriba de la cánula (agarre por la propia cánula y no la aguja) y asegure la arandela politetrafluoroetileno en los molares para que el catéter permanece en su lugar.
      Nota: Cortar la lavadora en una forma trapezoidal y asegurar contra los molares con el lado plano hacia la mejilla hace que este paso sea más fácil.
   8. Tome otra arandela de politetrafluoroetileno y deslícela sobre la aguja expuesta, abajo el tubo de plástico, y se apoyan contra la incisión.
   9. Para asegurar la arandela de politetrafluoroetileno, utilice cinta esterilizada para crear una "bandera" triangular de manera que la lavadora no se desliza hacia arriba. Asegure el lavadoer contra la piel de la rata y la cinta esterilizada.
   10. Cortar el catéter expuesto para permitir 2-4 cm de tubo que se expone sobre la cabeza de la rata.
   11. Repita los pasos 2.2.1 a 2.2.10 para el otro lado de la boca.
3. Cirugía intracraneal por voltamperometría
   1. Coloque la rata en el marco estereotáxico y limpiar el cuero cabelludo del animal usando un exfoliante dos etapas (un exfoliante betadine seguido por un lavado de etanol al 70%, lleve a cabo con una repetición 3 ciclo).
   2. Utilice unas pinzas esterilizadas de punta fina y tijeras quirúrgicas para cortar una sección de 15 x 15 mm de tejido del cuero cabelludo.
   3. Limpie suavemente la superficie del cráneo usando aplicadores con punta de algodón esterilizados. Además limpiar el cráneo mediante la aplicación de 2 a 3 gotas de peróxido de hidrógeno al 3%.
   4. Use un taladro estereotáxica para hacer 3 pequeños (1 mm de diámetro) agujeros en el cráneo para la posterior inserción de tornillos, 1 orificio para la cánula guía, 1 orificio para el electrodo de estimulación y 1 orificio para los elegidos de referenciamontó.
   5. Para grabaciones en el núcleo NAC, coloque la cánula guía en 1,2 mm anterior y 1,4 mm lateral al bregma. Baje el aparato cánula hasta que la base de plástico esté al nivel del cráneo.
   6. Coloque el electrodo de referencia esterilizada en el hemisferio contralateral a la cánula guía. Baje la referencia aproximadamente 2 mm por debajo de la duramadre.
   7. Coloque el electrodo de estimulación en 5,2 mm posterior y 1,0 mm lateral al bregma y bajado 8,0 mm por debajo de la duramadre para dirigir el área tegmental ventral (VTA).
   8. Use un destornillador pequeño quirúrgico esterilizado para asegurar los tornillos en el cráneo. Luego, inserte el electrodo de referencia, estimulando el electrodo, y guiar la cánula. Por último, asegurar que todos los componentes utilizando cemento Cranioplastic.
   9. Durante las primeras 48 horas de cuidado post-operatorio, para administrar el fármaco no esteroide anti-inflamatorio (NSAID) Carprofeno por inyección subcutánea (5 mg / kg). Deje por lo menos 1 semana para la recuperación quirúrgica completa antes de realizar voltamgrabación metría.
      1. Durante la atención post-operatoria, catéteres orales ras diaria con agua. Proporcionar alimentos saturado en agua durante 2 días para ayudar al animal en la masticación y de comer. Proporcionar un seguimiento diario en busca de signos de estrés potenciales de dolor (debido a la infección leve o deshidratación) y proporcionar intervenciones apropiadas según sea necesario (incluida la administración de fluidos, la administración tópica de antisépticos, o la administración de AINE y carprofeno a 5 mg / kg).

3) Voltamperometría Grabaciones en Despierta, Rata con libertad de movimientos

1. Bajar el electrodo y la adquisición de un conjunto de entrenamiento DA.
   1. En el día del experimento, comprobar la permeabilidad de la cánula por vía oral mediante la infusión de 200 l de agua y observar las respuestas orofaciales (para verificar que la rata está probando el agua).
   2. Conecte el cabezal de la platina FSCV a la rata mediante la inserción del electrodo de estimulación (en el cabezal de la platina) en el electrodo de estimulación bipolar cannula (en la rata). Por lo tanto, el cabezal de la platina (miniaturizado convertidor de corriente a voltaje) se conecta directamente al electrodo bipolar estimulante.
   3. Retire la cánula maniquí desde el aparato de cánula y aplicar dos gotas de solución de heparina 50% en la cánula. A continuación, inserte suavemente una cánula ficticia (ligeramente más largo que la cánula ficticia que se ha eliminado previamente) para borrar cualquier coágulo de sangre o cicatrización glial que pueda haber ocurrido, que rompa electrodos de fibra de carbono que se insertarán posteriormente durante el experimento. Extender la cánula utilizada para despejar los coágulos de 3-4 mm por debajo del cráneo (al menos 2 mm por encima del sitio de la grabación).
   4. Inserte el micromanipulador, con electrodo, en la cánula guía y coloque el anillo de omega en una posición "cerrada".
   5. Conecte el cable de electrodo de referencia del cabezal de la platina al pin apropiado. A continuación, conecte el cable de electrodo de trabajo desde el micromanipulador para el cable apropiado en el cabezal de la platina.
   6. Baje las elecatropelló a aproximadamente 4-4,5 mm por debajo del cráneo.
   7. Utilice un potenciostato para aplicar una forma de onda triangular (400 V / s, -0,4 a 1,3 V). Aplicar la forma de onda al electrodo a 60 Hz por lo menos durante 10 minutos, a continuación, cambiar la frecuencia de aplicación de forma de onda de 10 Hz para las grabaciones experimentales posteriores.
      Nota: La etapa de aplicación de forma de onda de 60 Hz produce una superficie de fibra de carbono estable y le ayudará a prevenir la deriva eléctrica
   8. Aplicar la estimulación eléctrica a la VTA usando varias frecuencias (de 10 a 60 Hz) impulsos (10 a 30 pulsos) y las corrientes (50 a 150 mu), todas con un ancho de pulso de 2 ms / fase, para evocar diferentes concentraciones de pH y la liberación de DA turnos. Adquirir al menos 5 concentraciones diferentes de liberación de DA y 5 cambios de pH diferentes. Espere (2 - 3 minutos mínimo) entre estimulaciones para permitir la recarga vesicular [14].
      Nota: Es importante obtener estímulos que producen concentraciones de DA en toda la gama que se recogerán durante el posteriorexperimento, ya que se utilizarán como un conjunto de entrenamiento para el Análisis de Componentes Principales (ver sección 5.1).
   9. Baje el electrodo en el núcleo NAC (6,3 mm ventral a Durá). Posteriormente bajar el electrodo en incrementos de 100 micras dentro del núcleo NAc hasta que se observaron eventos transitorios liberación de DA en las frecuencias de al menos 1 por min.
   10. Conectar el tubo (diámetro interior de 1/32 ", diámetro exterior 3/32") a una jeringa de 20 ml, unido a una bomba de jeringa. En el otro extremo del tubo, utilizar una aguja 23 G biselado para conectar la tubería a la cánula de la rata. Asegúrese de que el tubo se llena completamente con el saborizante deseada y compruebe que no existen burbujas en el tubo.
       Nota: Por lo general, administrar una pequeña cantidad de saborizante en la boca de la rata antes de grabar para asegurar que la primera infusión para la grabación entrega la cantidad completa de infusión y no cualquier agua residual o de aire en el tubo. Además, esto permite que el animal pueda tener algo de ingenio experiencia previah el saborizante ya nuevos estimulantes del gusto, incluso los apetitiva, puede ser aversivo inicialmente debido a su novedad.
   11. Para la recolección de datos, infundir 200 l de saborizante (6,5 seg usando una bomba y tubos descrito anteriormente). Infundir el saborizante cada 1-3 min. Infundir un total de 25 veces por saborizante. Cada infusión entrega 200 l de solución.
   12. Si varios estimulantes del gusto se están entregando en un solo experimento, lave el catéter oral con agua después de la recolección de datos para un saborizante y espere al menos 20 minutos antes de la infusión de la nueva saborizante.
   13. Después de la sesión de grabación DA, prepararse para la verificación histológica mediante la creación de una pequeña lesión en el lugar de grabación. Para preservar el electrodo de fibra de carbono para la posterior calibración, primero retraer el electrodo y eliminar el micromanipulador. A continuación, utilice una nueva micromanipulador con un microelectrodo de vidrio y un alambre de tungsteno (que se extiende 100 m más allá de la punta de vidrio) a la misma profundidad (por debajo de la duramadre) como el f de carbono original,microelectrodos iber.
   14. Para la verificación histológica, crear una pequeña lesión mediante la aplicación de 3 V en el alambre de tungsteno y el aumento de la tensión en incrementos de 1 V, cada 10 seg, hasta que se alcanza el ajuste de 10 V.
   15. Si una curva de concentración estándar que ya ha sido creado usando múltiples electrodos de fibra de carbono, realice el paso por encima de la lesión (3.1.14) aplicando el potencial directamente el electrodo de fibra de carbono.
       Nota: Este método lesión dañará la fibra de carbono y prevenir la posterior calibración con ese electrodo específico.
   16. La eutanasia del animal usando una inyección letal de pentobarbital (150 mg / kg, ip).
   17. Desalojar el casquete con las cánulas con unos alicates tirando directamente hacia arriba en el casquete. No tuerza el casquete ya que esto puede causar daños innecesarios al cerebro y hacer que sea difícil de identificar la localización del electrodo durante la histología.
       1. Retire el cerebro y colocar en formalina al 4% durante 3 días seguidos en un 30% suCrose durante 1 semana. Crear 30 micras rodajas usando un criostato, montar en cubreobjetos y examinar rebanadas bajo un microscopio de luz para identificar la ubicación de la fibra de carbono o lesión de tungsteno.
          Nota: La perfusión es opcional para 3.1.17.

4) calibración del electrodo

1. El uso de la celda de flujo para crear un factor de conversión de corriente de la concentración.
   1. Con el fin de determinar la sensibilidad del electrodo, calibrar los electrodos después de cada experimento utilizando un aparato de flujo "de células t". Bajar el electrodo en la "células T", mientras tampón Tris, soluciones de pH, o soluciones DA se lavan sobre la superficie del electrodo (a una velocidad de 2 ml / min). Use un actuador solenoide de aire de seis posiciones para alternar entre la memoria y el pH o solución DA.
   2. Para cada calibración, recoger datos voltamétricos durante 5 seg aplicación de tampón Tris (línea de base), seguido de 5 seg aplicación del pH o solución DA, seguido de 20 segundos de unplicación de tampón Tris (total del archivo 30 seg). Repita cada carrera 3 veces para cada concentración del patrón de calibración, de contrapeso entre las diferentes concentraciones de cada norma.
   3. Para cada toma de muestras, medir el pico DA o corriente pH-evocado. Un promedio de la corriente de pico a través de cada ensayo para obtener una concentración frente a la relación de corriente de pico. Para obtener instrucciones más detalladas, consulte [12] y [13].

5) Análisis de Datos

1. El uso de un conjunto de entrenamiento en el análisis de componentes principales (PCA)
   Nota: Durante un experimento de voltametría, la salida se produce como corriente, que es el resultado de la oxidación y la reducción de la dopamina, los cambios de pH, y el ruido electroquímico. PCA permite la separación de estos factores para que se pueda aislar los componentes deseados (DA y pH) y quitar componentes adicionales que podrían distorsionar las señales deseadas (para una descripción más detallada, véase ^{15, 16).}
   1. Asignar un factor de calibración a thactual e salida (aproximadamente 5.10 nA / M) después de PCA para permitir que los valores de concentración de los analitos a determinar.
   2. Utilice el conjunto de entrenamiento obtenida durante un experimento para "entrenar" el modelo PCA para separar a cabo DA, pH y otros factores. PCA toma el conjunto de entrenamiento voltamogramas cíclicos (recogidos en la sección 3.1.8) y determina qué características esenciales de la voltamograma pueden ser utilizados para identificar cada analito recogida durante grabaciones en vivo de voltametría.
   3. Para determinar el número de componentes principales para mantener, utilizar una prueba F Malinowski. Por lo general, mantener sólo 2 o 3 componentes principales que normalmente explican sobre 95-99% de la varianza en los datos. Para más discusión sobre la aplicación de la prueba F Malinowski, ver ^17.
      Nota: Una vez que se determina el número de componentes, el análisis PCA efectivamente proyectará los voltamogramas medidas a partir de DA y la formación pH establece en los principales componentes que han sido retenidas.El resultado es un conjunto de datos que ha sido filtrada de manera que sólo los datos de DA (o pH) se mantiene y se elimina los datos residuales que no se parece DA o pH (Ver representativos Resultados para salida esperada). Para una explicación más detallada y paso a paso las instrucciones para el uso de la ACP para el análisis voltamétrica ver hoja Materiales y ^{16, 17.}

Resultados

FSCV combinada con la implantación del catéter intraoral se utilizó para examinar cómo sacarosa, un saborizante apetitiva, modula fásica la liberación de DA en el núcleo NAc. Antes de la infusión saborizante, la estimulación eléctrica (150 mu, 60 Hz, 24 pulsos, indicada por la barra roja) de la VTA produce aumentos sólidos en fásica liberación de DA en el NAc (Figura 1) Figura 1 muestra un gráfico de color con potencial sobre. el eje y, el tiempo en el eje x, y la corriente (representado c...

Discusión

Entrega saborizante intraoral combinada con FSCV permite el análisis del "tiempo real" respuestas DA a saborizantes orales. Hay tres pasos críticos en el protocolo que se requieren para mediciones exitosas DA. En primer lugar, la implantación adecuada del catéter oral es crítico para la entrega de saborizantes. Asegurarse de que el catéter se inserta detrás de la primera molar y encajada en su lugar evita que el catéter de la pérdida de permeabilidad y evita la extracción accidental por el animal. La...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stimulating electrode	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	when ordering, request a 22 mm cut below pedestal
Cannula for electrode	BioAnalytical Systems	MD-2251
Glass capillary	A-M systems	624503
Carbon fiber	Thornel	T650
Electrode puller	Narishige International	PE-22
Neurolog stimulus isolator	Digitimer Ltd.	DS4
Heat shrink	3M	FP-301
Insulated wires for electrodes	Squires electronics	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop
Epoxy	ITW Devcon	14250	"5 minute epoxy"
Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene	Ion Power	LQ-1105	i.e., Nafion
Silver paint	GC Electronics	22-023
Power supply	BK Precision	9110
Tubing for intra-oral catheters	Intramedic	427426	PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm
Tubing for intra-oral infusion	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Syringe pump for flow cell	Pump Systems Inc.	NE 1000
Surgical cement	Dentsply Caulk	675571 and 675572
Air actuator	VICI	A60	6 position digital valve interface
Digital valve interface	VICI	DVI	230 VAC
Quad headstage	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI power supply	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI breakout box	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Power supply for tastant syringe pump	Med Associates	SG-504
Tastant syringe pump	Med Associates	PHM-107
Tungsten microelectrode	MicroProbes	WE30030.5A3
Silver wire reference with AgCl	InVivo Metric	E255A
Sucrose	Sigma	80497
Magnesium chloride	Sigma	M8266
Sodium chlroide	Sigma	S7653
Perchloric acid	Sigma	244252
Hydrochloric acid (4 M)	Sigma	54435
Soidum hydroxide	Sigma	306576
Hydrogen peroxide	Sigma	H1009
Dopamine hydrochloride	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	University of North Carolina-Chapel Hill		Must request software: click here for link to software request page