El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

Resumen

La capacidad del endotelio inflamado para reclutar leucocitos de flujo se regula por las células estromales mesenquimales. Se describen dos modelos in vitro que incorporan células humanas primarias que se pueden utilizar para evaluar el reclutamiento de neutrófilos de flujo y examinar el papel que las células estromales mesenquimales desempeñan en la regulación de este proceso.

Resumen

Las células del estroma regulan el reclutamiento de leucocitos circulantes durante la inflamación a través de la diafonía con células endoteliales vecinas. Aquí se describen los dos modelos "in vitro" en vasculares para estudiar el reclutamiento de neutrófilos circulantes de flujo por las células endoteliales inflamadas. Una gran ventaja de estos modelos es la capacidad de analizar cada paso en la cascada de adhesión de leucocitos en orden, como ocurriría in vivo. También describimos cómo ambos modelos se pueden adaptar para estudiar el papel de las células del estroma, en este caso las células madre mesenquimales (MSC), en la regulación de reclutamiento de leucocitos.

Células endoteliales primarias se cultivaron solas o junto con MSC humano en contacto directo en microportaobjetos ibidi o en lados opuestos de un filtro Transwell durante 24 horas. Los cultivos se estimularon con factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) durante 4 horas y se incorporan en un ensayo de adherencia basado en el flujo. Un bolo de neutrófilos se perfundiósobre el endotelio durante 4 min. La captura de fluir neutrófilos y sus interacciones con el endotelio fue visualizado por microscopía de contraste de fase.

En ambos modelos, la estimulación de citoquinas-aumento del reclutamiento de neutrófilos endotelial que fluyen de una manera dependiente de la dosis. Análisis del comportamiento de los neutrófilos reclutados mostró una disminución dependiente de la dosis en la rodadura y un aumento dependiente de la dosis en la transmigración a través del endotelio. En co-cultivo, MSC suprimida la adhesión de neutrófilos al endotelio TNF estimulada.

Nuestros modelos de adhesión basados ​​en el flujo imitan las fases iniciales de reclutamiento de leucocitos de la circulación. Además de leucocitos, pueden usarse para examinar el reclutamiento de otros tipos de células, como las células tumorales circulantes MSC o administrados terapéuticamente. Nuestros modelos de co-cultivo de varias capas han demostrado que el MSC se comunica con el endotelio de modificar su respuesta a las citoquinas pro-inflamatorias, Altering el reclutamiento de neutrófilos. Se requiere investigación adicional utilizando dichos modelos para entender completamente las células estromales de la forma de diferentes tejidos y condiciones (trastornos inflamatorios o cáncer) influyen en el reclutamiento de leucocitos durante la inflamación.

Introducción

La inflamación es una respuesta protectora a la infección microbiana o la lesión del tejido que requiere una estrecha regulación de la entrada de leucocitos y salida de el tejido inflamado para permitir la resolución ^1,2. Cross-talk entre las células endoteliales (CE) que los vasos sanguíneos línea, leucocitos circulantes y las células del estroma residente de tejidos es esencial para coordinar este proceso ^3. Sin embargo, la contratación incontrolado de leucocitos y su limpieza ineficaz de apuntalan el desarrollo de enfermedades inflamatorias crónicas ^4. Nuestra comprensión actual de reclutamiento de leucocitos en la salud y la enfermedad es incompleta y se necesitan modelos más robustos para analizar este proceso.

Los mecanismos de apoyo el reclutamiento de leucocitos de la sangre a través de CE vascular en las vénulas post-capilares han sido bien descritos ^1,2,5. Leucocitos circulantes son capturados por los receptores especializados (por ejemplo, VCAM-1, E-selectina, P-selectina), queestán reguladas por el endotelio inflamado. Estas interacciones transitorias permiten leucocitos interactuar con quimiocinas unidas a la superficie y mediadores derivados de lípidos (ya sea endoteliales o estroma en origen) que activan las integrinas expresadas por los leucocitos ^{6- 11.} Esto a su vez estabiliza la adhesión y la migración de las unidades a través del endotelio y en el tejido ^{12- 15.} Dentro del tejido, reclutados leucocitos se someten a los agentes derivado del estroma que influyen en su motilidad, la función y supervivencia ^16,17. La creciente evidencia sugiere que las señales recibidas en cada etapa de las condiciones del proceso de reclutamiento de leucocitos para la próxima. Sin embargo, nuestra comprensión de reclutamiento de leucocitos sigue siendo incompleta y muy poco se sabe sobre el movimiento de leucocitos componentes conformación dentro del tejido.

En Birmingham hemos desarrollado varios modelos in vitro "vasculares" para estudiar el reclutamiento de leucocitos defluir ^9,18,19. Ahora entendemos que vascular acto CE reguladores como inmediatos de reclutamiento de leucocitos en respuesta a los cambios en su microambiente local. Específicamente, las células del estroma de tejido residente pueden regular activamente la respuesta inflamatoria, en parte por conversar con vecinos CE vascular para influir en su papel en el reclutamiento ^3. Hemos demostrado anteriormente que las diversas células del estroma modulan la capacidad de CE para apoyar la adhesión y migración de leucocitos en un tejido de manera específica, y que estos efectos se vuelven alterada en enfermedades crónicas ^13,16,20,21. Así, las células del estroma de tejido establecen 'de direcciones códigos' que definen el contexto de cada respuesta inflamatoria ^22. Más recientemente, hemos demostrado que la médula ósea derivada MSC (BMMSC) potentemente regular a la baja la respuesta de la CE a las citoquinas, lo que lleva a una reducción en el reclutamiento de neutrófilos y linfocitos ^23.

Los mecanismos govreclutamiento sejo de dilucidado in vitro han utilizado en gran medida ensayos que incorporan un solo tipo de células (por ejemplo, CE) o la proteína aislada. Sin embargo, estos estudios no tienen en cuenta los efectos del entorno local de los tejidos (es decir, la presencia de células del estroma) en el reclutamiento de leucocitos y su posterior migración en el tejido. Aquí se describen dos métodos basados ​​en el flujo en el que las células del estroma, específicamente las células madre mesenquimales (MSC), somos co-cultivadas con CE ^23. Estos modelos nos permiten examinar el efecto de las células del estroma en las respuestas endoteliales, en particular su capacidad para apoyar el reclutamiento de leucocitos de flujo.

Protocolo

1. Aislamiento y cultivo de células endoteliales primarias humanos y células madre mesenquimales

1. Celdas de aislamiento y cultivo de humanos umbilicales endoteliales de la vena (HUVEC):
   1. Ponga el cordón umbilical en una bandeja con papel de cocina y rocíe con etanol al 70%. Colocar en una campana de cultivo de tejidos. Identificar la vena y canular en ambos extremos. Coloque un cable de sujeción alrededor del extremo canulado para asegurarlo.
   2. Lavar la sangre venosa con PBS utilizando una jeringa. Llene la jeringa con aire y pasar a través de la vena de retirar y desechar el PBS residual.
   3. Descongelar 10 mg / ml de colagenasa tipo Ia y diluir 1:10 en PBS (con el calcio y cloruro de magnesio) a una concentración final de 1 mg / ml. Pase solución de colagenasa en la vena hasta que se cubran las dos cánulas. Cierre las abrazaderas en cánulas en ambos extremos.
   4. Cubra la bandeja con el tejido y rociar con etanol al 70%. Coloque el cable en una incubadora durante 20 minutos a 37 ° C y 5% de CO _2.
   5. Tome el cable de salidade la incubadora y apriete las ataduras de cables. Masajear el cordón suavemente durante 1 min. Lave la suspensión celular con 10 ml de PBS y recoger en un tubo de centrífuga de 50 ml.
   6. Llene la jeringa con aire y pasar a través de la vena para eliminar cualquier PBS residual dos veces, recogiendo el PBS en un tubo de centrífuga de 50 ml usado en la etapa 1.1.5. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a TA.
   7. Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en 1 ml de medio completo CE. Medio CE consiste en M199 suplementado con 35 g / ml de sulfato de gentamicina, 10 ng / factor de crecimiento epidérmico humano ml, 1 mg / ml de hidrocortisona, 2,5 mg / ml de anfotericina B, y 20% de suero de ternera fetal.
   8. Añadir 4 ml de medio de CE y la suspensión CE a un matraz de 25 cm ^2. Cambie el medio al día siguiente y luego cada 2 días.
   9. CE presenta una morfología de adoquines como (Figura 1Ai). Para los ensayos de adhesión, EC generalmente se sembró cuando alcanzan el 100% de confluencia (véase la Sección 1.4 ).
2. Aislamiento de células madre mesenquimales gelatina de Wharton (WJMSC) de cordones umbilicales humanos:
   1. Aislar jalea derivado de MSC de Wharton (WJMSC) a partir de cordones umbilicales frescas o de los cables que ya han sido usados ​​para aislar CE. Cortar el cordón umbilical en 5 cm piezas largas. Cortar cada pieza longitudinalmente para revelar los vasos sanguíneos (arterias 2 [blancos, rígida] y 1 vena [amarillo, distendido]).
   2. El uso de tijeras y pinzas estériles eliminar los vasos sanguíneos y descartan. Cortar todo el tejido poner el 2 - 3 mm ³ piezas. Con unas pinzas lugar 2-3 mm ³ piezas en un tubo de centrífuga de 50 ml.
   3. Descongelar 100 mg / ml de colagenasa tipo de stock II y diluir 1: 100 en 10 ml de PBS a una concentración final de 1 mg / ml. Descongelar 20000 U / ml de stock hialuronidasa y diluir 1: 400 a una concentración final de 50 U / ml en la solución de colagenasa.
   4. Añadir cóctel enzimático para el tubo de centrífuga que contiene los fragmentos de tejido. Incubar los fragmentación del tejidots de 5 horas a 37 ° C en un rotador lento.
   5. Diluir la suspensión de células 1: 5 en PBS. Colocar un filtro de 100 micras de poro en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Verter la suspensión de células en el filtro de poro 100 micras.
      NOTA: fragmentos de tejido restante será retenido en el filtro y las células se recogerá en el tubo de centrífuga de 50 ml.
   6. Deseche el filtro. Centrifugar la suspensión de células a 400 xg durante 10 min a TA. Aspirar el sobrenadante y pellet WJMSC resuspender en 12 ml de medio de cultivo WJMSC completo (DMEM bajo de glucosa, 10% de FCS y 100 U / ml de penicilina + 100 mg / ml de estreptomicina) de mezcla.
   7. Semillas todas las células en un 75 cm ² frasco de cultivo de tejidos. Cambie el medio después de 24 horas con 12 ml de medio de cultivo WJMSC completa. Reemplace medio cada 2-3 días. Las células deben llegar al 70 - 80% de confluencia dentro de 2 semanas. Pasaje cuando WJMSC alcanzar 70-80% de confluencia (ver sección 1.4).
3. La expansión de MSC derivada de la médula ósea (BMMSC):
   1. Aislar MSC derivadas de médula ósea humana (BMMSC) como se describió previamente ^24. Añadir 10 ml de medio de crecimiento MSC pre-calentado (MSCGM) en un tubo de centrífuga de 15 ml.
   2. Descongelar un vial de p2 BMMSC colocando en un 37 ° C baño de agua durante 2 min. Añadir la suspensión BMMSC al tubo de centrífuga que contiene MSCGM. Mezclar bien con la pipeta.
   3. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a TA. Aspirar el sobrenadante por completo.
   4. Resuspender las células en 1 ml MSCGM y cuentan las células utilizando un hemocitómetro o un contador celular digital, como un cellometer.
   5. Sembrar las células en frascos de cultivo de 75 cm ² a una densidad de 5000 - 6000 células por cm ² en 12 ml MSCGM. Cambie el medio después de 24 horas con 12 ml MSCGM. Células de alimentación con 12 ml MSCGM cada 2 - 3 días.
   6. Pasaje cuando BMMSC alcanzar 70-80% de confluencia (ver sección 1.4). Las células exhiben una morfología fibroblástica (Figura 1Aii).
4. Desprendimiento de la CE y MSC:
   1. Aspirar medio de 25 frascos de cultivo cm ^2. Añadir 2 ml de EDTA al 0,02% durante aproximadamente 2 min. Aspirar EDTA y añadir 2 ml de tripsina (2,5 mg / ml). Vista bajo el microscopio hasta que las células se convierten en todo el año.
   2. Toque en el frasco para desprender las células. Inactivar la tripsina mediante la adición de medio de cultivo 8 ml (dependiendo del tipo de célula; medio de la CE para HUVEC, DMEM LG para WJMSC y MSCGM para BMMSC) al matraz de cultivo y la suspensión transferencia a un tubo de centrífuga de 15 ml.
   3. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a TA. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet como se describe a continuación.
      1. Para pases de MSC, pellet se resuspende en medio de cultivo de 3 ml. Añadir 11 ml de medio de cultivo en tres matraces de cultivo de 75 cm ² separadas. Añadir 1 ml de suspensión celular a cada frasco de cultivo (1: 3 split). WJMSC Pasaje y BMMSC 3 veces (p3) antes de su uso en ensayos de co-cultivo.
      2. Para la siembra de la CE o MSC en los ensayos de adhesión - ver las secciones 2 y 3.
5. MSC congelación:
   1. En el paso 3 detach MSC como se describe en la Sección 1.4. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 3 ml CryoSFM enfriado con hielo. Pipeta alícuotas de 1 ml de suspensión de células en 1,5 ml crioviales heladas. Ponga crioviales en un recipiente de congelación.
   2. Guarde el recipiente a -80 ° CO / N. Traslado al nitrógeno líquido. Descongele vial de MSC (siga los pasos 1.3.1 - 1.3.6). Resuspender MSC en 5 ml de medio de cultivo (elegir medio apropiado para WJMSC o BMMSC) y semilla en un matraz de 25 ^cm2.

2. Establecimiento de Células Madre Co-culturas endotelial-mesenquimales en ibidi microportaobjetos

1. Tripsinizar un cm ² matraz confluente 25 de la CE (~ 1.5 x 10 ⁶ células; como la Sección 1.4). Resuspender CE en 380 l MSCGM (1 x 25 cm ² frasco sembrará dos microportaobjetos 6 canales ibidi (~ 1,25 x 10 ⁵ / canal), para los ensayos de adhesión de todo ty celularpes se cultivan en MSCGM). Añadir 30 l de suspensión CE en cada canal (esto cubrirá el área de crecimiento a través de la acción capilar). Incubar ibidi microportaobjetos a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 1 hora.
2. Añadir 140 l MSCGM a cada canal y luego aspirar apagado. Repetir dos veces para un total de 3 lavados. Añadir 140 l MSCGM y lugar en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 24 horas.
3. Para co-cultivos separar MSC (Sección 1.4). Realizar un recuento de células utilizando un hemocitómetro o un cellometer. Ajustar la concentración de MSC a 1,5 x 10 ⁵ células / ml.
4. Aspirar el exceso de medio de los canales de ibidi (dejando sólo el área de crecimiento del canal en el medio). Añadir 30μl de MSC suspensión a los canales ibidi. Aspirar el medio que fue expulsado de la zona de crecimiento del canal y añadir otros 30 l de MSC suspensión. Repetir una vez más y luego colocar el microportaobjetos ibidi en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO _{2 <}/ Sub> durante 1 hora.
5. Añadir 140 l MSCGM a cada canal y luego aspirar apagado. Repetir dos veces para un total de 3 lavados. Añadir un volumen final de 140 l MSCGM a cada canal y el lugar en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 24 horas.
6. Descongelar 1 x 10 ⁵ U / ml TNF y diluir 1: 1000 en MSCGM a una concentración final de 100 U / ml (equivalente a ~ 10 ng / ml). Realizar una dilución en serie mediante la dilución de 100 U / ml por TNFa 1:10 en MSCGM para obtener 10 U / ml. Diluir 10 U / ml por TNFa 01:10 en MSCGM para obtener 1 U / ml.
7. Tratar canales con TNFa a 37 ° C durante 4 horas antes del ensayo. Las fluctuaciones de temperatura durante el tratamiento con citocinas alterarán los patrones de reclutamiento de neutrófilos observados. Añadir MSCGM fresco a los canales no tratados.

3. Establecer endotelial-mesenquimales Células Madre Co-culturas de Filtros

1. Separe WJ o BMMSC como se describe en la Sección 1.4. Resuspender el precipitadoen 1 ml MSCGM. Realizar unas células recuento de células utilizando un hemocitómetro o un cellometer.
2. Ajuste el volumen de forma que la concentración final es de 5 x 10 ⁵ MSC en 500 l de MSCGM.
3. Usando una pinza estéril invierten 6-bien, 0.4 micras filtros PET Transwell y colocar en una caja estéril.
4. Semilla de 5 x 10 ⁵ MSC sobre la superficie exterior de los filtros. Incubar filtros a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 1 hora.
5. Recoger los medios de comunicación desde la superficie exterior del filtro. Cuente el número de no-adherente MSC en los medios de comunicación. Re-invertido filtros utilizando una pinza estéril y colocar en una placa de 6 pocillos a juego contiene 3 ml MSCGM.
6. Añadir 2 ml de MSCGM sobre la superficie interior del filtro (Figura 1B). Coloque en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 24 horas. Tripsinizar un cm ² matraz confluente 25 de la CE (Figura 1Ai; como la Sección 1.4).
7. Resuspender CE en 8 ml MSCGM (1 x 25 cm ² frasco will semilla cuatro filtros de 6 pocillos; ~ 5 x 10 ⁵ CE / filtro). Aspirar medio de la parte superior e inferior de los filtros porosos. Añadir 3 ml MSCGM fresco en la cámara inferior (debajo del filtro). Añadir 2 ml de suspensión CE a la superficie interior de cada filtro. Incubar durante 1 hora a 37 ° C y 5% de CO _2.
8. Aspirar a medio lavar CE no adherente y reemplazar con fresco MSCGM. Configurar filtros de monocultivo paralelas CE por la siembra de células en la superficie interior sin primero MSC siembra. Incubar O / N a 37 ° C y 5% de CO _2.
9. Compruebe que la monocapa CE es confluente y no contiene lagunas. Monocapas confluentes Sub-no se pueden utilizar para ensayos de adhesión (Figura 1B).
10. Tratar las cámaras superior e inferior de los filtros con 1, 10, o 100 U / ml TNF (equivalente a ~ 10 ng / ml) a 37 ° C durante 4 h antes del ensayo (descrito en la Sección 2).

4. Aislamiento de leucocitos

1. Tome venosasangre de voluntarios sanos y alícuota inmediatamente en tubos de EDTA. Tubos Invertir suavemente para mezclar.
2. Capa de 2,5 ml Histopaque 1077 Onto 2,5 ml Histopaque 1119 en unos 10 ml de fondo redondo tubo. Capa 5 ml de sangre entera en el gradiente Histopaque. Centrifugar a 800 xg durante 40 min a TA.
3. Neutrófilos periféricos Cosecha polimorfonucleares (PMN) en la interfaz de Histopaque 1077 y 1119 (por encima de la capa de eritrocitos). Colocar en un tubo redondo de 10 ml de fondo y completar hasta 10 ml con PBSA. Invertir suavemente el tubo y centrifugar a 400 xg durante 5 min a TA.
4. Diluir solución de BSA 7,5% 1:50 en 100 ml de PBS (con calcio y cloruro de magnesio) a una concentración final de 0,15% (w / v; PBSA). Aspirar el sobrenadante y resuspender en 10 ml PBSA. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a TA.
5. Volver a suspender en 1 ml PBSA. Tomar una alícuota de 20 l de la suspensión celular y añadir a 380 l PBSA (dilución 1:20). Contar las células utilizando un hemocitómetro o un cellometer. Diluir a la conce requeridontration (1 x 10 ⁶ / ml para los filtros Transwell y ibidi MicroSlide) en PBSA. Mantener la suspensión de neutrófilos a TA hasta el ensayo.

5. Montaje del sistema de flujo

1. Establecer el sistema de flujo como se muestra en la Figura 1C. Encienda el calentador y se puso a 37 ° C. Conecte una jeringa de 20 ml (quitar el émbolo) y una jeringa de 5 ml a un grifo de 3 vías. Coloque el grifo a la cámara de plexiglás utilizando cinta Micropore.
2. Mida y corte un pedazo largo de silicio 4.2 mm (grosor) de tubos que es aproximadamente la distancia entre la válvula y el 3 vías grifo. Cortar un 8-10 mm de largo pedazo de 1/3 mm tubo (fina) y se insertan en un extremo de la tubería de espesor. Coloque el lado de tubos de espesor en la de 3 vías del grifo.
3. Conecte el extremo del tubo delgado en un puerto de la 3-forma electrónica microválvula. Este es el "depósito de lavado". Corte un 6 - pedazo largo de 8 mm de tubo grueso y delgado.
4. Introduzca el tubo delgado en un extremo de la tubería de espesor. AttACH termina el tubo de espesor sobre una jeringa de 2 ml (quitar el émbolo).
5. Conectar el extremo delgado tubo de la jeringa 2 ml en un puerto en la microválvula electrónica para hacer que el "depósito de muestras". Conectar la válvula a la cámara de flujo de filtro mediante la medición y corte de una pieza larga de tubo delgado que es la distancia entre la microválvula y el centro de la platina del microscopio.
6. Para el modelo MicroSlide, adjuntar un 8 - mm de espesor trozo de tubo 10 hasta el final de la tubería delgada. Publicar un conector en forma hasta el final de la tubería de espesor L. Este se conectará a la microportaobjetos. Para el modelo de filtro, adjuntar un 8 - mm pieza de Portex Blue Line Manómetro 10 la conexión de tubos hasta el final de la tubería delgada.
7. Coloque el extremo delgado tubo sobre la microválvula. Esta es la salida común para los depósitos de lavado y de muestra. Llene los depósitos con PBSA. Primer tubo haciendo fluir a través de ellos PBSA para eliminar las burbujas de aire.
8. Conecte el tubo del manómetro a un 29 mm (50 ml) s vidrioyringe. Prepare la jeringa rellenando con 10 ml PBSA. Invertir la jeringa de modo que el extremo conectado a la tubería orientada hacia arriba y empujar hacia fuera todas las burbujas de aire. Rellene con 5 ml PBSA.
9. Para el modelo MicroSlide solamente, adjuntar un 10 - pieza de 12 mm de tubo grueso para el extremo del tubo del manómetro que conduce a la jeringa de vidrio. Publicar un conector en forma en el extremo de la tubería de espesor L. Coloque la jeringa de vidrio en una bomba de jeringa para infusión / retirada.
10. Calcular el caudal de recarga (Q) que se requieren para generar la tensión de cizallamiento deseada (τ _w en Pascal, Pa) de 0,1 (filtros Transwell) Pa o 0,05 (microportaobjetos ibidi) Pa utilizando las siguientes fórmulas:
    γ _w = (6.Q) / (wh ²⁾
    τ = n.γ
    Donde w = anchura interna y h = profundidad interna del canal de flujo. n = viscosidad de la solución que fluye; PBSA es n = 0,7 mPa.s. Para la cámara de flujo del filtro de placas paralelas, la anchura (w) es de 4 mm y la profundidad (h) es 0,133 mm. El depth de la cámara puede variar ligeramente debido a diferencias en el espesor de la junta de Parafilm utilizado. Para el MicroSlide ibidi, la anchura es de 3,8 mm y la profundidad es de 0,4 mm.
    NOTA: Debido a las diferencias en las dimensiones del canal de flujo, y la dinámica de captura se utilizan diferentes tensiones de cizallamiento para el modelo MicroSlide en comparación con el modelo de filtro ^6.

6. Instalación de la placa de la cámara de flujo paralelo incorporación de filtros

1. Cortar un trozo de Parafilm (el mismo tamaño que el cubreobjetos de vidrio) utilizando una plantilla de metal. Cortar una ranura de 20 x 4 mm en el Parafilm (para crear el canal de flujo) usando una plantilla de metal. Utilice la junta para marcar el canal de flujo en el portaobjetos de vidrio.
2. Alinear los bordes del filtro de 6 pocillos en el cubreobjetos de vidrio. Asegúrese de que el filtro abarca las marcas de canales de flujo. Extraer con cuidado el filtro con un bisturí tipo 10A.
3. Cubrir cuidadosamente el filtro con una junta de Parafilm, asegurando que el canal de flujoranura está en el medio del filtro (Figura 1D). Use un pedazo de pañuelo de papel limpio y empuje las burbujas.
4. Coloque el cubreobjetos en el rebaje de la placa inferior de la cámara de flujo Perspex. Coloque la placa de plexiglás superior sobre la parte superior de la junta y atornillar las placas juntos (Figura 1D).
5. Gire el grifo de 3 vías para permitir la solución de lavado (PBSA) fluya a través de la válvula. Conectar tubo del manómetro al puerto de entrada de la placa de Persex parte superior. Ejecutar PBSA a través del canal de flujo para permitir que las burbujas pasen a través.
6. Conectar el tubo del manómetro de la bomba de jeringa en el orificio de salida de la placa de Perspex. Ajuste la bomba de jeringa para rellenar y pulse run. Limpie cualquier PBSA que ha goteado sobre la placa superior de la cámara.
7. Coloque la cámara en el escenario de un microscopio invertido de contraste de fases. Ajuste el enfoque para visualizar la CE por encima de los filtros (Figura 1B).

7. Configuración microportaobjetos para Flujo

1. Coloque el microportaobjetos en el escenario de un microscopio de contraste de fase invertida. Conecte el conector en forma de L en el puerto de entrada de un canal. Ejecutar PBSA a través del canal de flujo.
2. Coloque el conector en forma de la bomba de jeringa en el orificio de salida del canal L. Ajuste la bomba de jeringa para rellenar y pulse run. Limpie cualquier PBSA que ha goteado sobre la microportaobjetos. Ajuste el enfoque de visualizar la monocapa CE.

8. La perfusión de células endoteliales Leucocitos Over

1. Poner 2 ml de neutrófilos purificadas en el depósito de la muestra y dejar calentar durante 2 minutos. Lave el endotelio con PBSA durante 2 min.
2. Abra la válvula para perfundir los neutrófilos sobre el endotelio. Entregar el bolo de neutrófilos durante 4 min. Desconectar la válvula y perfundir PBSA desde el depósito de lavado durante el resto del experimento.
3. Asegúrese de que el aire burbujas no pasan a través del canal de flujo en cualquier punto durante el ensayo, ya que esto interrumpir el monolay CEer y causa el desprendimiento de los neutrófilos adherentes.

9. Grabación de neutrófilos Captura y Comportamiento

1. Neutrófilos reclutamiento Record ya sea durante el flujo de neutrófilos o post-perfusión.
2. Hacer todas las grabaciones digitales de al menos de 5 - 10 campos en el centro del canal de flujo. Identificar el centro del canal moviendo el objetivo hasta el borde del canal en el puerto de entrada y la identificación de la mitad del puerto.
   1. Para la grabación durante el flujo de neutrófilos, tomar imágenes de un solo campo cada 10 seg durante 1 min. Mover a lo largo del canal y grabar otro campo durante 1 min. Repita el procedimiento para la duración del bolo.
   2. Para la grabación de post-perfusión, hacer 10 seg de grabación de 5 - 10 campos por el centro del canal de flujo para evaluar el comportamiento de leucocitos (típicamente 2 min después del final del bolo de neutrófilos). Tome imágenes cada segundo dentro del intervalo de 10 seg. Esto permite tiempo suficiente para la captura de flujo y el comportamiento de neutro adherentephils para ser analizados.
   3. Grabar un solo campo que contiene al menos 10 transmigrados neutrófilos durante 5 min, tomando imágenes cada 30 seg. Esto se puede utilizar para calcular la velocidad de células migradas (ya sea por encima o por debajo del endotelio).
   4. Registre otra serie de 10 campos seg (típicamente 9 minutos después de la perfusión). Esto permite tiempo para los neutrófilos migran a través de la monocapa endotelial.
   5. Pare la bomba de jeringa y retire el tubo. Desmontar la cámara de flujo y enjuagar el depósito de muestras y el tubo. Repita para filtros posteriores / canales MicroSlide.

10. Análisis de reclutamiento de leucocitos y Comportamiento

1. Cuente el número de neutrófilos en cada campo durante los 10 grabaciones SEC en el punto de tiempo de 2 min. Todas las células deben estar presentes en el primer segundo campo con el fin de ser contados. Las células que son parcialmente en el campo en los 2 lados (por ejemplo, superior / fronterizas mano derecha) del campo de visión se incluyen enlos recuentos, siempre y cuando se mantengan en el campo para el 10 sec completa.
2. Calcular la media del número de neutrófilos por campo adherente. Medir la longitud y la anchura del campo de grabado. Calcular el área del campo. Calcular cuántos campos hay en 1 mm ^2. Multiplicar el recuento medio de neutrófilos por el número de campos en 1 mm ^2.
3. Calcular el número total de neutrófilos perfundidos multiplicando la cantidad de neutrófilos perfundido (por ejemplo, 2 x 10 ⁶ / ml * Q [por ejemplo, 0,0999 ml / min para la cámara de flujo de placas paralelas]) por la duración del bolo (por ejemplo, 4 min ).
4. Divida el recuento de neutrófilos / mm ² por el número total de neutrófilos perfundidos para determinar el número total de células que se han adherido (adherente células / mm ^{2/10 6} perfundido).
5. Evaluar si los neutrófilos adherentes están rodando, firmemente adherente o transmigrado (Video suplementario 1 y 2).
   1. Laneutrófilos rodadura es de fase brillante y se moverá lentamente a lo largo de la monocapa endotelial (1 - 10 m / seg; vídeo complementario 1).
   2. Células firmemente adherentes son de fase brillante y unido a la superficie CE, ya sea restante estacionaria (es decir, no se mueve durante la grabación) o han sido sometidos a cambiar de forma y están migrando sobre la superficie CE (Figura 1Ei).
   3. Un neutrófilo es transmigrado fase oscura y por debajo de la capa de la CE (Figura 1Eii).
6. Calcular el porcentaje de células adherentes que están rodando, papelería y transmigrado. Alternativamente, el comportamiento de neutrófilos puede ser expresado como número total de células que muestran los diferentes comportamientos mediante la aplicación de la misma fórmula utilizada para calcular la adherencia total (como se describe en los pasos 10.6 a 10.7).
   1. Marque el borde delantero de una neutrófilos rodadura. Marcan el borde delantero de la misma célula en el extremo de la secuencia de 10 seg. Dibuja una línea de apuestaween los 2 puntos y medir la distancia que ha viajado la célula.
   2. Divida este valor por la duración de la grabación en el que la célula está rodando (es decir, 10 segundos). Trate de seleccionar los neutrófilos que están en el campo durante todo el intervalo de 10 seg.
7. Para calcular la velocidad de neutrófilos que migran sobre la superficie (en forma brillante fase cambiada) o por debajo del endotelio (oscuro fase) utilizar la grabación (Video complementaria 2) 5 min.
   1. Dibuje un esquema de células que migraron al principio de la secuencia y el seguimiento de sus movimientos a lo largo de la secuencia. Tome nota de las posiciones X e Y del centroide en cada intervalo de 1 min para cada celda. Restar valores de la posición X e Y de la primera imagen de la secuencia de los valores de la segunda imagen. Esto se basa en el teorema de Pitágoras.
   2. Resta los valores de la segunda imagen de la tercera imagen. Haga esto para todas las imágenes de la secuencia. T Plazaél valores X e Y y sumarlos.
   3. La raíz cuadrada del valor resultante. Calcular la velocidad para cada celda promediando las velocidades calculadas en cada intervalo de minutos. Track 10 emigró neutrófilos y calcular la velocidad media.

Resultados

Inicialmente, se analizó el efecto de estimular la CE con TNFa en el reclutamiento de neutrófilos de flujo utilizando el modelo microportaobjetos ibidi (Sección 7-9). En ausencia de TNF, poco o ningún neutrófilos se adhirieron a la monocapa endotelial (Figura 2A). Esto se esperaba, ya que sin tratar / descansando CE no expresan las moléculas necesarias de adhesión (selectinas) o quimiocinas para apoyar la unión ^25,26. En contraste, la estimulación por citoquinas aume...

Discusión

Aquí se describen los dos modelos "in vitro" en vasculares para estudiar el reclutamiento de neutrófilos circulantes por endotelio inflamado. Una gran ventaja de estos modelos es la capacidad de analizar cada paso en la cascada de adhesión de leucocitos en orden, como ocurriría in vivo. Hemos observado anteriormente un aumento dependiente de la dosis en la adhesión de neutrófilos y la transmigración a través de TNF estimulada CE ^9,29. También describimos cómo ambos modelo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
25 cc tissue culture flask	SLS	353109
75 cc tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
6-well, 0.4 µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at RT.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4 °C. Warm to RT before use.
10 ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4 °C.
20 ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5 ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2 ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50 ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.