Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides

Resumen

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Resumen

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

Introducción

El epitelio intestinal es uno de los tejidos corporales que proliferan más rápidamente, lo que ha causado a atraer amplio interés de la investigación sobre células cancerosas y madre. En 2009 se publicó una técnica para generar culturas de larga duración de las pequeñas criptas intestinales en matrigel, conservando una estructura dimensional 3 ^1. Estas estructuras, denominadas organoides intestinales, pueden ser cultivadas utilizando técnicas estándar, y la zona medio suplementado con un número de factores de crecimiento definidos, incluyendo la BMP-noggin inhibidor de la vía de señalización (Nog), el potenciador de la vía Wnt de señalización rspondin 1 (Rspo1) y factor de crecimiento epidérmico (EGF) encuentran todos para mejorar la proliferación intestinal ^2-4.

Organoides superan las líneas tradicionales de células de cáncer en los aspectos que son no mutado, han mantenido jerarquía de células madre, muestran la polarización celular intacta y la diferenciación de exposiciones en todos los linajes de células que se encuentran en la naciente pequeña intepitelio estinal. Puesto que pueden ser transducidas para llevar a transgenes o la interferencia de ARN construye ^5, que se utilizan para estudiar elementos genéticos específicos, que prevalezca experimentos usando ratones transgénicos en facetas de costo y la velocidad. La expresión transgénica en organoides se puede realizar utilizando cualquiera retroviral murino o vectores lentivirales ^6,7. Debido a las limitaciones de los retrovirus murinos, capaces de transducir células mitóticas exclusivamente ^8, la transducción lentiviral se utiliza con más frecuencia para las células que son difíciles de infectar, tales como organoides.

Virally transducidas y que expresan establemente organoides transgénicos pueden ser utilizados para una multitud de análisis aguas abajo, incluyendo ARN análisis cuantitativos e inmunohistoquímica. En conjunto, la cultura de organoides de células epiteliales intestinales primarias se ha convertido en una técnica rutinaria que es fácil de implementar, sin requisitos específicos de laboratorio, y se ha convertido en la novela de serie en cecultura ll en la investigación sobre el epitelio intestinal.

Técnicas de transducción viral y análisis de aguas abajo posterior en organoides son tediosos para realizar y ayudar experimentos organoides generamos este protocolo de vídeo, que muestra los métodos para la transducción lentiviral de organoides cultivadas. Tenemos, además, muestra cómo el procesamiento correcto de organoides puede aumentar el rendimiento y, por tanto, mejorar el rendimiento de análisis de aguas abajo usando técnicas de ARN o inmunohistoquímica. En el protocolo, se utilizaron exclusivamente organoides que se derivan de pequeñas criptas intestinales, aunque las técnicas descritas pueden aplicarse a organoides colon también.

Protocolo

1. Preparación de polietilenimina (PEI) como reactivo de transfección

1. Disolver aproximadamente 150 mg de PEI en 100 ml de H ₂ O.
2. Ajuste solución a pH 7,4 mediante la adición de HCl hasta que la solución se vuelva clara y revuelva hasta que se disuelva por completo. Esto puede tomar entre 10 y 60 min y añadir agua a una concentración final de 1 mg / ml.
3. Cuando clara, filtrar la solución PEI a través del filtro de 0,22 micras estéril y guárdelo en un congelador a -80ºC en alícuotas de 5 ml.

2. Producción de partículas de Lentiviral

Día 1:

1. Células HEK293T de Split a 60% -80% de confluencia en 162 cm ² matraz grande o placa de Petri en medio de cultivo línea celular (DMEM suplementado con 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina y suplemento de glutamina 2 mM).

Día 2:

2. Preparar la solución de transfección de ADN que contiene 45 g de ADN plasmídico total sumandovectores lentivirales de embalaje (7 g de pVSVg; 5 g de pRSV rev; 13 g de pMDL) y 20 g de plásmido lentiviral que codifican el gen de interés o shRNA de interés. Ajustar a un volumen de 1 ml usando DMEM.
3. Preparar la solución de transfección PEI mediante la adición de 90 l de 1 mg / ml de PEI a 930 l de DMEM y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Añadir solución de transfección de ADN a la solución de PEI. Vortex o invertir un número de veces e incubar durante 5 min a temperatura ambiente para obtener solución de transfección de ADN.
5. Gotear 2 ml de la solución de transfección de ADN en las células HEK293T y se incuba durante 4 h en una incubadora de cultivo celular humidificado en 37 ° C.
6. Después de 4 horas, refrescar el medio de cultivo para eliminar PEI. No es necesario lavar las células antes de añadir nuevo medio.
   NOTA: PEI es citotóxicos e incubación veces más que 4 horas pueden causar daño a las células HEK293T.

Día 4:

7. Reemplace supernatant con el nuevo medio de cultivo. Mantenga sobrenadante (que contiene virus); esto será usado en la etapa 2.10.
8. Ponga sobrenadante en un matraz de 15 ml. Para eliminar las células muertas, centrifugar durante 5 min a 500 x g.
9. Empuje sobrenadante a través de 0,45 micras filtro utilizando una jeringa grande 60 ml. Guarde la noche a 4 ° C.

Día 5:

10. Recoger el segundo lote de sobrenadante; centrífuga y filtro como en los pasos 2.8 a 2.9.
11. Reúnase el sobrenadantes de pasos 2.9 y 2.10 en tubos de ultracentrífuga y centrifugar a 50.000 xg en una ultracentrífuga durante 90 min.
12. Sacar cápsulas que contienen los tubos de ultracentrífuga muy cuidadosamente y poner en una campana de flujo laminar, recordando la orientación del tubo dentro de la centrífuga.
13. Abrir cápsula sosteniendo el tubo de ultracentrífuga y medio decantar cuidadosamente de tal manera que la pastilla está en el lado superior del tubo. Desde bolitas virales pueden ser difíciles de visualizar, recordar en quélado del tubo de un pellet se habrá formado. Tome una micropipeta y quitar el último bit de medio, mientras que teniendo cuidado de no agitar el sedimento marrón opaco que es visible en el lado de la parte inferior del tubo de ultracentrífuga.
14. Resuspender este precipitado en 500 l de medio de cultivo suplementado con organoide nicotinamida 10 mM, 10 mM Chir99021, 10 mM Y27632 y 8 mg / ml de polibreno. Resuspensión en este medio es importante, ya que el virus de título elevado se usa para transduct directamente organoides.
15. Opcionalmente: congelar el virus en este medio en alícuotas en dos lotes de 250 l en -80 ° C.

3. de Lentiviral Transducción de organoides

Día 0:

1. Dividir un total de 0,95 cm ² y de organoides dos días antes de transducción en un nuevo pozo, con el objetivo de obtener unos 50 pequeños organoides. Dividir organoides acuerdo con el protocolo previamente publicado ¹ (Figura 3A, B).
2. Suplemento organoid medio de cultivo con 10 mM Chir99021 y nicotinamida 10 mM para obtener criptas proliferativas hiper quística (Figura 3C).
   NOTA: criptas quísticas desarrollarán mejor cuando organoides recién divididas se cultivan en presencia de Chir99021.

Día 2:

3. Organoides Cosecha de la pipeta hacia arriba y abajo de la matrigel y medio, alterando de esta manera la mezcla con una micropipeta p1000. Colocar la mezcla en un tubo de 15 ml.
4. Interrumpir adicionalmente usando una pipeta Pasteur en el que la abertura distal se ha reducido por fusión. Organoides centrífuga para sedimentar durante 5 min a 100 x g.
   NOTA: Dependiendo del tamaño de la centrífuga, utilice una velocidad centrífuga diferente. Es necesario encontrar la velocidad exacta en la que interrumpen organoides se separan de la mezcla.
5. Eliminar el sobrenadante y añadir 500 l de tripsina 1x precalentado (similar al 0,25% de tripsina). Resuspender organoides en tripsina y se incuba3 min en un baño a 37 ° C.
6. Inactivar la tripsina mediante la adición de 3,5 ml de medio de cultivo línea celular (DMEM suplementado con 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina y glutamina). Centrifugar durante 5 min a 500 x g.
7. Eliminar el sobrenadante dejar pellet en aproximadamente 20 l de medio. La transferencia de los organoides en esta última pequeña cantidad de medio a un pozo en una placa de 48 pozos.
8. Añadir alta lentivirus título en medio de transducción tal como se describe en el paso 2.14, volver a suspender y continuar con el paso 3.10. Al encontrarse con baja eficacia de transducción, paso 3.9 se puede añadir.
   NOTA: Para la transducción eficiente, por lo general añadir una alícuota de 250 l de alta lentivirus título a un pocillo de organoides. Esto representa el 50% de todo el lentivirus cosechado de una sola producción, como se describe en el paso 2 de este protocolo.
9. Opcionalmente: para mejorar la eficacia de transducción, realice espinoculación poniendo los 48 y la placa que contiene organoides en un pre-calentado centrífuga de 326; C y giran a 600 xg durante 1 hr.
10. Ponga la mezcla organoide-virus en cultivo incubadora y se incuba durante 1 hora a 37 ° C en una incubadora de cultivo para permitir la transducción.
11. Opcionalmente: para mejorar aún más la eficacia de transducción, incubar organoides de 3 horas adicionales a 37 ° C en una incubadora de cultivo.
12. Añadir 1 ml de medio de cultivo organoide y resuspender la mezcla organoide-virus, transferir a un tubo de microcentrífuga y se centrifuga en una microcentrífuga durante 5 min a 850 xg para sedimentar organoides.
13. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 20 l de Matrigel enfriado con hielo. Dado que el material se solidifica cuando se vuelve más caliente, utilizar puntas de pipeta que se enfrían por pipeteando arriba y abajo PBS enfriado con hielo para un número de veces.
14. Ponga la gotita en el medio de un pozo en una placa de 48 pocillos e incubar en la cultura incubadora a 37 ° C durante 15 min para solidificar.
15. Después de 15 min, añadir cuidadosamente 250 l de medio de cultivo suplementado con organoideNicotinamida 10 mM, 10 mM y 10 mM Chir99021 Y27632. Fragmentos de organoides alteradas pequeñas formarán en pequeños organoides quísticas dentro de las 24 horas.

Día 5:

16. Actualizar medio y complementar con un antibiótico de selección (por puromicina, utilice 4 g / ml).

Día 7:

17. Reemplace medio de medio de cultivo organoid norma, complementado con la selección de antibióticos.
    NOTA: en ciernes será completa 2-3 semanas después de la retirada Chir99021. Después de la selección, organoides pueden ser cultivadas sin selección de antibióticos.

4. organoide Preparación de ARN para RT-PCR cuantitativa o Microarray

1. Para la preparación de ARN, utilizar un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Retire el medio de organoides y añadir 350 l de tampón RLT, complementados con β-mercaptoetanol recta en la cúpula de matrigel contiene organoides. Resuspender las material en RLT pipeteando usando micropipeta p1000.
2. Realizar más de preparación de ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante.
3. Opcionalmente: aumentar el rendimiento de ARN mediante amplificación usando el sistema Ovation Pico WTA, requiriendo de entrada inicial de 50 g de ARN total de acuerdo con el protocolo del fabricante.
4. Opcionalmente: para el control de calidad antes de RNA microarrays, las muestras se ejecutan en un Bioanalyzer 2100 utilizando un chip de ARN total de nano eucariota, con el objetivo de un número de integridad del ARN (RIN) de 8,5 o más (Figura 5) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

5. organoides de transformación de parafina y inmunohistoquímica

1. Antes de iniciar el organoid incrustar pre-calentar un bloque de aluminio con agujeros de montaje de vidrio tubos de diámetro 12 mm de incubadora a 70 ° C para mantener el líquido de parafina.
2. Tome un solo pozo con organoides completamente desarrollados y eliminar el medio, dejando los organoides incrustados intacta.
3. Añadir 1 mlde paraformaldehído al 4% en PBS directamente al pozo y fijar a 4 ° C en cualquier lugar de 1 hora a la noche.
4. Reemplazar paraformaldehído con 1 ml de PBS enfriado con hielo.
   Opcionalmente: mantener organoides fijos en PBS hasta 1 semana a 4 ° C después de este paso.
5. Resuspender organoides fijos en 1 ml de PBS y colocar en vial de vidrio.
6. Deje organoides se hunden hacia abajo durante 1 min, se decanta PBS y se reemplazan con etanol al 70% en el que un par de gotas de solución de eosina se disuelven para permitir la visualización de organoides todo el proceso de incrustación.
7. Deja organoides en etanol al 70% a temperatura ambiente. Después de 30 min, eliminar el etanol 70% en cuidadosamente decantación, ser capaz de visualizar los organoides por el ojo a causa de leve del color rosáceo eosina. Reemplace solución incrustar con etanol al 96%.
8. Repita el paso 5.7, cada vez que la sustitución de la solución de la incrustación con la siguiente. Pase organoides a través de las siguientes soluciones a continuación: etanol al 70%, etanol al 90%, etanol al 96%, 100% ethanol, etanol 100%, xileno, xileno.
9. Decantar el último lavado xileno y verter la parafina en el tubo. Poner el tubo inmediatamente en el bloque de aluminio pre calentado a 70 ° C durante 30 min y reemplazar parafina con parafina nuevo limpio.
10. Vierta de parafina apagado y pipeta organoides en el molde de bloque de parafina utilizando una pipeta precalentado Pasteur con gran abertura. Mantenga pipeta Pasteur de tibia con un mechero Bunsen. Coloque todos los organoides en el molde bloque de parafina en una pequeña capa de parafina líquida.
11. En lo posible, trate de manipular todos los organoides hacia el centro del molde bloque de parafina utilizando una aguja de disección calentado. Mantenga disección aguja caliente usando un mechero Bunsen.
12. Cuando localización de organoides en el molde es satisfactorio, coquilla ligeramente para solidificar la capa de parafina.
13. Termina el bloque mediante el vertido de más de parafina en la parte superior y añadir una cinta de incrustación histológico estándar.

Resultados

Transducción lentiviral organoid

La técnica de la transducción organoid utilizando lentiviral partículas depende de la correcta manipulación de los organoides antes y durante la transducción. Organoides (Figura 3A) se cultivaron y se fueron interrumpidas en criptas individuales (Figura 3B). Como se informó anteriormente, estas criptas individuales, cuando se cultivan en presencia del inhibidor de GSK3 Chir99021 se convirtieron en criptas quí...

Discusión

El protocolo de vídeo actual describe la transducción lentiviral de organoides de epitelio intestinal primaria y análisis de aguas abajo de estos organoides utilizando técnicas de ARN cuantitativos e inmunohistoquímica.

Transducción lentiviral se realiza a menudo en las células adherentes o flotantes en placas de cultivo. Dado que la estructura tridimensional de organoides los hace difíciles de penetrar por las partículas virales, se utiliza un número de métodos para aumentar la e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene imine	Polysciences	23966-2
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
Fetal calf serum	Lonza	DE14-801F
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetyl cysteine	Sigma	A9165-1G
mouse Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
polybrene	Sigma	107689
nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsin	Lonza	BE02-007E
puromycin	Sigma	P 7255
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
β-mercaptoethanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA system	NuGen	3300-12
paraformaldehyde	Sigma	252549-1L
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml	VWR	LSUKM12
Eosin Yellowish	VWR	1,159,350,025