Contraste mejorado las imágenes por ultrasonido para la Evaluación de la Médula Espinal flujo sanguíneo en Experimental Spinal Cord Injury

Resumen

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Resumen

Flujo reducido de sangre de la médula espinal (SCPF) (es decir, isquemia) desempeña un papel clave en la lesión medular traumática (SCI) fisiopatología y en consecuencia es un objetivo importante para las terapias neuroprotectoras. Aunque varias técnicas se han descrito para evaluar SCPF, todos ellos tienen limitaciones significativas. Para superar este último, se propone la utilización de imágenes de contraste mejorado de ultrasonido en tiempo real (CEU). Aquí se describe la aplicación de esta técnica en un modelo de rata de la contusión SCI. Un catéter yugular se implanta primero para la inyección repetida de agente de contraste, una solución de cloruro de sodio de hexafluoruro de azufre microburbujas encapsuladas. La columna vertebral se estabiliza luego con un 3D-marco a medida y la médula espinal duramadre está expuesto por una laminectomía en Thix-ThXII. La sonda de ultrasonido se coloca entonces en el aspecto posterior de la duramadre (recubierta con gel de ultrasonido). Para evaluar SCPF línea de base, una sola inyección intravenosa (400 l) de contraagente st se aplica para registrar su paso a través de la microvasculatura de la médula espinal intacta. Un dispositivo de peso soltar se utiliza posteriormente para generar un modelo experimental reproducible contusión de SCI. Agente de contraste se re-inyecta 15 min después de la lesión para evaluar los cambios post-SCI SCPF. CEU permite en tiempo real e in-vivo evaluación de los cambios SCPF siguiente SCI. En el animal está sano, la ecografía mostró flujo sanguíneo irregular a lo largo de la médula espinal intacta. Además, 15 min después de la SCI, hubo isquemia crítica en el nivel del epicentro SCPF mientras permaneció conserva en las zonas más remotas intacto. En las regiones adyacentes al epicentro (tanto rostral y caudal), SCPF se redujo significativamente. Esto corresponde a la descrita previamente "zona de penumbra isquémica". Esta herramienta es de gran interés para la evaluación de los efectos de las terapias destinadas a limitar la isquemia y la necrosis tisular resultante después de la SCI.

Introducción

Lesión medular traumática (SCI) es una enfermedad devastadora que conduce a un deterioro significativo de motor, sensorial y funciones autónomas. Hasta la fecha, ninguna terapia ha demostrado su eficacia en los pacientes. Por tal razón, es importante identificar las nuevas técnicas que mejoren la evaluación de los posibles tratamientos y puede aclarar aún más pathiophysiology lesiones ^1.

SCI se divide en dos fases secuenciales, que se refiere a las lesiones como primarios y secundarios. La lesión primaria corresponde al insulto mecánica inicial. Considerando que los grupos de lesiones secundarias una cascada de varios eventos biológicos (tales como la inflamación, el estrés oxidativo y la hipoxia) que contribuyen más a la expansión progresiva de la lesión inicial, daños en los tejidos y, por tanto, ^2,3 déficit neurológico.

En la fase aguda de la lesión medular, terapias neuroprotectoras están dirigidas a reducir la patología lesión secundaria y shen consecuencia ould mejorar los resultados neurológicos. Entre los muchos eventos de lesiones secundarias, isquemia desempeña un papel ^4,5 crucial. En el nivel del epicentro SCI, los microvasos del parénquima dañados impiden el flujo de sangre de la médula espinal efectiva (SCPF). Por otra parte, SCPF también se reduce significativamente en la región que rodea el epicentro lesión, un área específicamente conocida como la "zona de penumbra isquémica". Si SCPF no se puede restaurar rápidamente dentro de estas regiones, la isquemia puede conducir a la necrosis del parénquima suplementario y daños en los tejidos más nervioso. Como incluso la preservación de tejido más ligero puede tener efectos sustanciales de la función, es de gran interés para el desarrollo de fármacos y terapias que pueden reducir la isquemia post-SCI. Para poner de relieve este fenómeno, el trabajo previo ha demostrado que la preservación de sólo el 10% de los axones mielinizados fue suficiente para permitir caminar en los gatos después de la SCI ^6.

Aunque varias técnicas se han descrito para evaluar SCPF, lay todos tienen limitaciones significativas. Por ejemplo, el uso de microesferas radioactivas ^7,8 y C14-iodopyrine autorradiografía ⁹ requiere el sacrificio de animales posterior y no puede repetirse a posteriores puntos de tiempo. La técnica de limpieza de hidrógeno al ¹⁰ depende de la inserción de electrodos intraespinales, que pueden dañar aún más la médula espinal. Mientras Doppler láser, fotopletismografía ^14,15 e in vivo microscopía de luz ¹⁶ tiene una profundidad muy limitada / zona de medida ^11-13.

Nuestro equipo ha demostrado previamente que un mayor contraste de ultrasonidos de formación de imágenes (CEU) se puede utilizar para evaluar en tiempo real e in vivo los cambios SCPF en el parénquima de la médula espinal de rata ^17. Es importante señalar que una técnica similar se aplicó por Huang et al., En un modelo porcino de SCI ^18. CEU se aplica un modo específico de imágenes de ultrasonido que permite asociar im morfológica de escala de grisesedades (obtenidos por el modo B convencional) con la distribución espacial del flujo de sangre ^19. La imagen SCPF y cuantificación se basa en la inyección intravascular de agentes de eco-contraste. El agente de contraste está compuesto de microburbujas de hexafluoruro de azufre (diámetro de significar sobre 2,5 micras y 90% tienen un diámetro inferior a 6 micras) estabilizada por fosfolípidos. Las microburbujas reflejan el haz de ultrasonido emitido por la sonda mejorando así la ecogenicidad de la sangre y el aumento de contraste de los tejidos en función de su flujo sanguíneo. Por tanto, es posible evaluar el flujo sanguíneo en una región determinada de interés según la intensidad de la señal reflejada. Las microburbujas también son seguros y que se han aplicado clínicamente en seres humanos. El hexafluoruro de azufre se elimina rápidamente (media vida media terminal es de 12 min) y más de 80% de la hexafluoruro de azufre administrada se recuperó en el aire exhalado dentro de 2 min después de la inyección. Este protocolo proporciona una forma sencilla de utilizar CEU imenvejecimiento para evaluar los cambios en SCPF rata.

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Protocolo

NOTA: Los procedimientos descritos en este manuscrito fueron aprobados por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina de Lariboisière, París, Francia (CEEALV / 2011-08-01).

1. Preparación de instrumentos

1. Preparar y limpiar los siguientes instrumentos para la inserción del catéter: micro-micro-pinzas, tijeras, pinza microvascular, grandes tijeras, hilo quirúrgico (seda trenzada Negro 4-0) y un catéter 14 G. Heparinizar el catéter con una solución de heparina (5.000 U / ml).
2. Preparar y limpiar los siguientes instrumentos para la laminectomía: grandes tijeras, bisturí y un cortador de hueso. Realizar laminectomía con un cortador de hueso a medida diseñado para reducir el riesgo de dañar la médula espinal durante la laminectomía (Figura 1).
3. Puesta en marcha del marco 3D utilizado para el posicionamiento y la estabilización del animal. El marco de encargo se construye con los elementos de un fijador externo Hoffman 3 en asociación con fórceps, which han sido curvados con el fin de adaptarse a la columna lumbar del animal.
4. Prepare el dispositivo de peso-drop (impactador) utilizado para la lesión de la médula espinal biomecánico.
   NOTA: El dispositivo de impactación medida fue diseñado con un software 3D e impreso en 3D.
5. Encienda la máquina de ultrasonido.
6. Preparar el kit para la reconstitución del agente de contraste.
   NOTA: El kit incluye 1 vial que contiene 25 mg de polvo liofilizado, 1 jeringa precargada que contiene 5 ml de cloruro de sodio y un sistema de transferencia mini-pico (Figura 2). Los pasos para la reconstitución del agente de contraste se detallan a continuación (en la sección 5).

2. vena yugular cateterismo (Figura 3)

1. Anestesiar al animal con 4% de isoflurano. Colocar el animal en posición supina. Confirmar anestesia adecuada, garantizando que el animal no responde cuando las patas queden atrapados con una pinza. Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras undanestesia er.
2. Afeitarse el cuello y limpiar la piel. Hacer una incisión en la línea media del cuello. Retraer el músculo sternocleidomastoidian para encontrar la vena yugular interna. Apretar una ligadura en la parte rostral de la vena.
3. Aplicar una pinza microvascular en la vena, 1 cm por debajo de la ligadura. Pasar otro hilo alrededor de la vena, justo debajo de la abrazadera con el nudo listo para ser apriete cuando se suelta la abrazadera.
4. Abra la pared de la vena (venotomía) entre la abrazadera y la ligadura rostral. Introducir un G catéter 14 en el lumen de la vena y empujarlo hacia el corazón.
5. Cuando se trata en contra de la abrazadera, suelte el último y empujar el catéter más. Asegurar el catéter en la vena, por apretar firmemente el nudo en la vena con el catéter dentro.
6. Evaluar la permeabilidad del catéter mediante la retirada de una pequeña cantidad de sangre venosa en el catéter y, posteriormente, a continuación, lavado con solución salina heparinizada. Esto evita la obstrucción de la catheter por un potencial coágulo de sangre.
7. Conectar un tubo flexible al catéter para su posterior inyección de agente de contraste (microburbujas). Manténgalo cerrado (cerrado) hasta que esté listo para su uso.

3. Acceso a la columna vertebral, laminectomía y la rata de posicionamiento (en el marco 3D)

1. Colocar el animal en una posición horizontal propensos plana. Afeitado y limpiar la parte posterior (región torácica) del animal.
2. Identificar la última costilla (el XIII en la rata) por palpación (Figura 4). Esto permite estimar la ubicación de la vértebra torácica XIII (ThXIII).
3. Hacer una incisión en la piel 4 cm en la línea media, centrada en ThXIII. Abra la incisión de la piel, así como la bursa subyacente. Observar la aponeurosis de los músculos de espalda, así como las puntas de los procesos de la columna vertebral.
4. Localizar con cuidado el proceso de la columna vertebral de ThXIII palpando las costillas XIII.
   NOTA: La costilla XIII está conectado a ThXIII y por lo tanto representa un fácil locahito anatómico te para la identificación de ThXIII. Este paso permite la localización de la ThXII a thix apófisis espinosa, así como L1 y L2 (primera y segunda vértebras lumbares).
5. Cortar la aponeurosis muscular y separar los músculos a cada lado para exponer las apófisis espinosas, las láminas y las articulaciones facetarias desde thix a L2. Exponer los aspectos laterales de L1 y L2 separando los músculos de las apófisis transversas.
6. Enganche incisivos dientes del animal en el marco 3D para asegurar la posición (Figura 5). Sujete las vértebras L1 y L2 con el fórceps modificados. Conectar los fórceps modificado al bastidor 3D con el fin de estabilizar el animal.
7. Tire suavemente caudalmente las pinzas que sujetan la columna lumbar con el fin de apretar toda la columna vertebral y de elevar el tórax desde el banquillo.
   NOTA: Con la disposición descrita el animal debe ser capaz de respirar. Además, a pesar de los movimientos respiratorios de la caja torácica, la columna vertebral y la médulaespinal también debe permanecer inmóvil.
8. Retire el PROCESOS espinosa de Thix a ThXII. Introduzca suavemente la hoja inferior de la cuchilla de hueso debajo de la lámina izquierda del ThXII y cierre el cortador de hueso con el fin de cortar la lámina (Figura 6).
9. Repita la misma maniobra de la lámina derecha y eliminar sucesivamente el arco posterior. Repetir los pasos anteriores para el ThXI vértebras a thix a fin de lograr una laminectomía de cuatro niveles. Retire las dos carillas articulares de cada vértebra.
   NOTA: Durante todo el procedimiento, limpiar el campo quirúrgico de una hemorragia local. Para ello, utilizar hisopos de algodón y la irrigación con solución salina tibia. La hemostasia se produce sistemáticamente en cuestión de minutos.

4. CEU Sonda Posicionamiento

1. Cubra la duramadre con gel de ultrasonido. Esto permite la transmisión efectiva de las ondas de ultrasonido entre la sonda y la médula espinal (Figura 7).
2. Estabilizar el ingenio sonda de ultrasonidopinza ha que se puede conectar posteriormente a la 3D-frame por un brazo articulado. Posicionar manualmente la sonda. Asegúrese de que la sonda está orientada a obtener una rebanada sagital longitudinal oblicua. En una posición correcta, la médula espinal es estrictamente horizontal en la imagen y el canal central de la médula espinal es visible a lo largo del segmento completo de la médula espinal.
   NOTA: Posicionamiento debe estar guiada por la imagen en modo B en tiempo real que se muestra en la pantalla de la máquina de ultrasonido. La distancia focal de la sonda de ultrasonido debe estar alineado con el canal central de la médula espinal. En este momento, la cara posterior de la médula espinal es accesible que en última instancia permitir el posicionamiento del impactador.
3. Cuando óptima, bloquee el brazo articulado para estabilizar la posición.

5. Preparación del agente de contraste - microburbujas Reconstitución

1. Usando el contenido de un kit comercial de la reconstitución y conectar el vástago de émbolo por su fijación tightly en la jeringa (en sentido horario). Abra la ampolla sistema de transferencia y retire la tapa de la punta de la jeringa. Abra la tapa del sistema de transferencia y conectar la jeringa al sistema de transferencia (sujetar firmemente).
2. Retire el disco protector del vial. Deslice el vial en la manga transparente del
3. sistema de transferencia y presione firmemente para bloquear el vial en el lugar.
4. Vaciar el contenido de la jeringa en el vial presionando sobre el vástago de émbolo. Agitar vigorosamente durante 20 segundos para mezclar todos los contenidos en el vial para obtener un líquido homogéneo de color blanco lechoso.
5. Invertir el sistema y retirar cuidadosamente el agente de contraste en la jeringa. Desenroscar la jeringa del sistema de transferencia. Después de la reconstitución (como se indica), 1 ml de la dispersión resultante contiene 8 l hexafluoruro de azufre en las microburbujas. Dibujar la suspensión de microburbujas en una jeringa de 100 ml. Inserte la jeringa 100 ml dentro de la bomba eléctrica. Cierre la tapa.
6. Iniciar agitación constante de la remicroburbujas constituidas. Agitación constante obtenida por rotación lenta de la jeringa, que mantiene la suspensión de microburbujas. Conectar la bomba al catéter yugular a través del tubo flexible. Ajuste la máquina de ultrasonido para "Modo Armónico".
   NOTA: Este último corresponde al modo en el que las microburbujas pueden detectarse específicamente y se visualizaron. Este modo tiene un índice mecánico bajo, que no destruye las microburbujas en comparación con el modo B.
7. Purgar el catéter mediante la infusión de una primera dosis (400 l) de agente de contraste. Durante esta primera infusión, compruebe que las microburbujas aparecen en la pantalla del ultrasonido. Esto confirma que todo el circuito (de la jeringa al torrente sanguíneo de la rata) está intacto y abierto.
8. Ajuste la máquina de ultrasonido a "B-mode" para visualizar el parénquima de la médula espinal y la destrucción de las pocas microburbujas restantes en el torrente sanguíneo. La alta frecuencia de la "B-Mode" tranalta energía smits a las microburbujas, lo que les permite a la ruptura.
9. Deje que el animal se quedó inmóvil durante aproximadamente 30 min. Este periodo permite la estabilización de los parámetros hemodinámicos.

6. Evaluación de SCPF en la médula espinal intacta

1. Ajuste la máquina de ultrasonido para el "Modo de armónicos". Iniciar simultáneamente (1) de infusión de agente de contraste (400 l) y (2) el cronómetro.
   NOTA: Durante la infusión, la concentración de microburbujas en el torrente sanguíneo debe aumentar, lo que permite la imaginación contraste de la médula espinal (Figura 8). Dado que las microburbujas se destruyen rápidamente, la concentración en sangre de microburbujas comienza a disminuir una vez que se ha completado la inyección que genera una disminución progresiva en contraste visualización de la médula espinal.
2. Después de que el botón de "Clip Store" en la máquina de ultrasonido 1 min, seleccione (pulse). Esto permitirá a uno para salvar a 1 min de la raw datos de la ecografía y la grabación de vídeo de imagen (que se mostró previamente en la pantalla de ultrasonido).
3. Ajuste la máquina de ultrasonido a "B-Mode". Esto eliminará las microburbujas restantes.

7. Experimental SCI

1. Utilizando el micromanipulador conectado al bastidor 3D, posicionar el dispositivo de impactación peso soltar de manera que la punta del impactador entra en contacto con la duramadre (en la línea media de la médula espinal), en la unión entre THX y ThXI (Figura 9) .
   NOTA: Este nivel debe corresponder a la mitad del segmento de la médula espinal observado con el dispositivo de ultrasonido. El delantero y el cuerpo del impactador son 8 mm de diámetro. La punta del impactador, que generará la lesión, es de 3 mm de diámetro.
2. Coloque el delantero del dispositivo de retención en una posición 10 cm de alto. Inducir el SCI experimental soltando el delantero del dispositivo de retención. El delantero cae y libera the impactador, hiriendo a la médula espinal. La impactación por encargo ofrece un impacto equivalente a un 10 g de peso cayó desde una altura de 10 cm.

8. Evaluación de SCPF 5 min post-SCI

1. Repita los pasos descritos en la sección 6 (Evaluación de SCPF). Las microburbujas serán incapaces de pasar a través de la microvasculatura dañado y el epicentro lesión permanecerá oscuro (Figura 10).

9. El sacrificio de animales

1. La eutanasia a los animales con una inyección letal intra-peritoneal de pentobarbital (100 mg).

10. La cuantificación de SCPF por Análisis Desconectado

1. Inicie el software de Ultra-Extender utilizado para la cuantificación (en la máquina de ultrasonido). Seleccione "Archivo" y luego seleccionar los datos en bruto previamente guardados y abrir los archivos asociados. Active el "modo de cuantificación" pulsando el botón "Chi Q" (selección). Select (botón) y elija la forma circular "Set ROI".
2. Seleccione "Dibuja ROI" (botón) y dibuje siete regiones circulares adyacentes de interés (ROI) en la médula espinal (Figura 11). Abra el menú "montaje" y seleccione la función "valor Curve". Observe el software se presentan varias curvas, cada uno correspondiente a los cambios de la concentración de microburbujas dentro de una ROI.
   NOTA: Cada curva tiene un perfil "perfusión deperfusion". La primera fase de la curva es plana y se corresponde con el período anterior a la llegada de microburbujas. En la segunda fase, la concentración de microburbujas aumenta rápidamente como resultado de la infusión. En la tercera fase, que comienza cuando la infusión se ha completado, la concentración de microburbujas disminuye progresivamente a medida que disintegratse en el torrente sanguíneo.
3. Coloque la primera línea vertical al comienzo de la segunda fase de la cUrve y seleccione "SET". Esto informa al software dónde empezar análisis.
4. Coloque la segunda línea vertical al final de la grabación y una vez más, seleccione "SET". Esto informa al software donde parar análisis.
5. Mira el menú "Cv" y registre el valor "AUC", que corresponde a la "área bajo la curva" analizada. Este valor es proporcional a la SCPF dentro de la ROI correspondiente.

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Resultados

Con el protocolo descrito anteriormente, es posible mapear la SCPF a lo largo de un segmento de médula espinal sagital longitudinal.

En la médula espinal intacta, no parece haber irregularidades SCPF dentro del parénquima (Figura 12). Esto se puede explicar por la distribución variable de las arterias-radiculo medular (RMA) de un animal a otro. RMA se refiere a segmentaria arterias que llegan a la arteria espinal anterior (ASA) y por lo tanto proporcionan el suministro d...

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Discusión

Aunque hemos descrito cómo utilizar CEU en un modelo de rata contusión SCI, este protocolo puede ser modificado para adaptarse a otros objetivos experimentales o modelos SCI. Hemos elegido para medir SCPF a sólo dos puntos de tiempo (antes de la lesión y 15 minutos después de la SCI), sin embargo el número de puntos de tiempo y el retraso entre las medidas SCPF se pueden adaptar para satisfacer las necesidades de los otros estudios. Por ejemplo, en nuestro trabajo anterior ^17, hemos medido SCPF en cinco...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Fixator Hoffman 3	Stryker, Kalamazoo, USA		Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe
Toshiba Applio	Toshiba, Tokyo, Japan		Ultrasound machine
Sonovue	Bracco, Milan, Italy		Contrast agent : microbubbles
Vueject pump	Bracco, Milan, Italy		Electric pump for infusion of microbubbles bolus
Aquasonic Ultrasound Gel	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA		Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Isovet	Piramal Healthcare, Mumbai, India		Isoflurane used for anesthesia
Ultra Extend	Toshiba, Tokyo, Japan		Software used for quantification of spinal cord blood flow
Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6	Canadian Tire, Toronto, Canada		Set of pliers for Do-it-yourself job