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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Resumen

Inflamación del hígado como respuesta a una lesión es un proceso altamente dinámico que implica la infiltración de distintos subtipos de leucocitos incluyendo monocitos, neutrófilos, subconjuntos de células T, células B, células asesinas naturales (NK) y las células NKT. Microscopía intravital del hígado para el seguimiento de la migración de células inmunes es particularmente difícil debido a los altos requisitos relativos a la preparación de muestras y fijación, la resolución óptica y la supervivencia de los animales a largo plazo. Sin embargo, la dinámica de los procesos inflamatorios, así como estudios de interacción celulares podrían proporcionar información crítica para comprender mejor la iniciación, progresión y regresión de la enfermedad inflamatoria del hígado. Por lo tanto, se estableció un método altamente sensible y fiable para estudiar la migración y célula-célula-interacciones de las diferentes células inmunes en el hígado del ratón durante períodos largos (alrededor de 6 hr) por intravital de dos fotones microscopía de escaneo láser (TPLSM) en combinación con cuidados intensivos monitoreo. ent "> El método proporcionado incluye una preparación suave y una fijación estable del hígado con perturbación mínima del órgano; intravital de imágenes a largo plazo usando microscopía multifotónica multicolor con prácticamente ninguna photobleaching o efectos fototóxicos durante un período de tiempo de hasta 6 horas, lo que permite el seguimiento de subconjuntos de leucocitos específicos, y las condiciones de imagen estable debido a un seguimiento exhaustivo de los parámetros vitales del ratón y la estabilización de la circulación, la temperatura y el intercambio de gases.

Para investigar la migración de linfocitos en la inflamación del hígado CXCR6.gfp ronda en ratones fueron sometidos a formación de imágenes del hígado intravital en condiciones basales y después de daño hepático agudo y crónico inducida por la inyección intraperitoneal (s) de tetracloruro de carbono (CCl 4).

CXCR6 es un receptor de quimioquinas expresado en los linfocitos, principalmente en células T asesinas naturales (NKT) -, asesinas naturales (NK) - y subconjuntos de linfocitos T, como las células T CD4, sino también associ mucosasATED invariante células (MAIT) T 1. Siguiendo el patrón migratorio y el posicionamiento de las células inmunes CXCR6.gfp + permitido una visión detallada de su comportamiento alterado en la lesión hepática y por lo tanto su potencial implicación en la progresión de la enfermedad.

Introducción

La visualización de las células y las funciones celulares en órganos enteros o incluso organismos enteros ha sido de gran interés durante más de 50 años, incluyendo prácticamente todas las partes del cuerpo 2. Por lo tanto, algunos de los primeros estudios que ya emplean intravital de imágenes del hígado 3,4. Sin embargo, existen varias limitaciones al día en cuanto a imágenes de alta resolución estable a largo plazo del tejido hepático.

Debido a la posición anatómica del hígado en estrecho contacto con el diafragma y el tracto gastrointestinal 5, el problema más común para formación de imágenes intravital microscópico es el movimiento debido a la respiración y, en menor medida, peristáltica del tracto intestinal 6. En comparación con otros órganos sólidos, la cirugía del hígado es particularmente difícil. Debido a la estructura microvascular densa, la manipulación quirúrgica puede conducir a lesiones hemorrágicas masivas, alteración de la microcirculación 7 y también la activación de residente immune células tales como las células de Kupffer 8. Por lo tanto, la fijación mecánica del tejido que se publica en otra parte 6,9 es probable que interfiera con la formación de imágenes de microscopía intravital.

En un hígado sano, el 10-15% del volumen total de sangre reside dentro de la vasculatura del hígado, y el órgano recibe alrededor de 25% del gasto cardíaco en general 10, haciendo que el órgano altamente susceptibles a cambios en la circulación (por ejemplo, fluctuaciones de la presión arterial ). Por lo tanto, las interrupciones en el flujo sanguíneo hepático debido a, por ejemplo, la tensión de cizallamiento, el desplazamiento, la lesión por la manipulación excesiva de los tejidos o la circulación centralizada dará lugar a alteraciones artificiales en el comportamiento migratorio de leucocitos, alteración de la oxigenación del hígado y, por tanto, un mayor daño del hígado, que afecta a la respuesta inmune del hígado, así como la preservación de órganos y el tiempo de vida general del animal.

Los primeros estudios microscópicos se basaron en mi epifluorescencia intravitalesmicroscopia, pero varias limitaciones técnicas tales como blanqueo foto y poca profundidad de penetración limitan el uso de esta técnica para obtener imágenes del hígado a largo plazo 4,11,12. Con el desarrollo de la microscopía multifotónica en la década de 1990, las limitaciones de blanqueo foto o profundidad de penetración se resolvieron principalmente, ya que este nuevo método es técnicamente capaz de realizar estudios de imagen en prácticamente todos los órganos en virtud de situaciones de la vida real 13-15. Sin embargo, los principales desafíos pendientes con respecto a las imágenes del hígado fueron: los movimientos de la respiración, la autofluorescencia del tejido hepático, que aseguran el flujo de sangre sin alteraciones en los sinusoides hepáticos, y proyección de imagen especialmente estables durante periodos de varias horas 16 más.

Aunque varios estudios abordaron la función y la migración de diversos leucocitos en el hígado 17, por ejemplo, la NKT-18-20 células, células T 21,22, los macrófagos del hígado 23,24 o neutrófilos 25, a largo plazo multifotónica mimágenes icroscopy aún no se había establecido con éxito, una tarea aún más difícil en los animales con enfermedad hepática aguda o crónica debido a los daños existentes y, por tanto, una mayor susceptibilidad a daños mayores 26. Sin embargo, el monitoreo del comportamiento migratorio y la función celular de los leucocitos en el hígado en tiempo real permite a los nuevos conocimientos en su papel particular en la homeostasis del hígado y la enfermedad 27.

El CXCR6 receptor de quimioquinas se expresa en varios subgrupos de linfocitos, incluyendo las células asesinas naturales (NK), las células NKT y algunas poblaciones de células T 18,28. Estudios previos en ratones han indicado que CXCR6 y su CXCL16 ligando afín pueden controlar el patrullaje de las células NKT en sinusoides hepáticos durante la homeostasis. En consecuencia, el uso de ratones CXCR6.gfp (que lleva un knock-in de la proteína fluorescente verde [GFP] en el locus CXCR6) se ha descrito para investigar la migración de linfocitos en diversos órganos tales como el cerebro 29y también el hígado 18,20, mostrando aumento de la infiltración de células CXCR6.gfp sobre la inflamación.

Con el método proporcionado en este estudio era posible seguir estos procesos durante un largo período de tiempo en condiciones estabilizadas. El procedimiento basado multifotónica intravital permitió imagen que era altamente reproducible con perturbación mínima del animal y el órgano; optimizado para la supervivencia de los animales a largo plazo por una extensa evaluación que sigue un estricto control de la respiración y la circulación; y altamente flexible y fácil de adoptar también a otros órganos parenquimatosos como el riñón o el bazo.

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Protocolo

NOTA: Los experimentos se realizaron de acuerdo con la legislación alemana sobre los estudios en animales después de la 'Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio "(publicación del NIH, 8ª edición, 2011) y la Directiva 2010/63 / UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos (Diario Oficial de la Unión Europea, 2010). Permiso oficial fue concedida desde el cuidado de los animales y la oficina gubernamental (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Alemania).

NOTA: Los pasos que pueden ser omitidos para la imagen a corto plazo (por ejemplo, tiros rápidos, pilas 3-D o también corta duración time-lapse microscopía) están marcados con asteriscos (*) para reducir el tiempo de preparación y simplificar el protocolo quirúrgico. Imaging también se puede realizar sin un amplio control de supervisión y la circulación si es necesario, sin embargo, el tiempo de supervivencia se redujo notablemente.

1. Configuración Microscopio y Pre-cirugía Preparación (5.10 millasn)

  1. Sistema Encienda (microscopio, Laboratorio de poder, láser, almohadilla eléctrica, cámara climática, web cam, dispositivo de bomba de jeringa, respirador).
  2. Conecte oferta de O 2 a isoflurano Vapor y establecer el nivel de isoflurano al 1,5% en volumen (v / v), se conecta a un respirador de pequeños animales.
    1. Para imágenes corto plazo, mantener la anestesia utilizando isoflurano sólo después de la inducción de la anestesia inicial ip (véase el paso 2.2). A continuación, utilice 2 Vol% (v / v) isoflurano, y mantener el tiempo de formación de imágenes por debajo de 2 horas para garantizar la microcirculación hepática estable.
  3. Establecer la respiración a 120-140 ciclos respiratorios / min con un volumen de 150-200 l.
  4. Configure etapa agarosa ratón. Preparar 100 ml de 3% (w / v) de agarosa, vertiéndola en un plato (aproximadamente 10 cm x 15 cm base) en un ángulo de 40 °.
  5. Establecer área de trabajo quirúrgico recoger la instrumentación requerida. Para prevenir la infección microbiana, desinfectar instrumentos utilizando una solución al 1% de Sekusept Forte S (9,9% w / v), Glutaral 9,8% w / v, formaldehído durante 5 min antes del experimento (Figura 1A).
  6. Obtener restantes componentes: desinfectante de la piel (por ejemplo, solución de povidona yodada al 10%), la etapa hepática (pilas y puente), solución de agarosa (3% (w / v) en PBS), bomba de jeringa con 5% (w / v) de solución de glucosa (G-5), la bomba de jeringa con solución anestésica I (ketamina 0,1 mg / ml, xilazina 0,5 mg / ml, Fentanilo 5 g / ml), hisopos de algodón, n-butil-2-Cyanoacrylat, y 1x PBS. Ponga plato etapa de agarosa en la cámara de incubación para el precalentamiento.

2. La traqueotomía (10-15 min)

  1. Utilice C57BL / 6 ratones de la casa en reproductoras de 25-28 g. La Casa de los ratones bajo condiciones específicas libres de patógenos, de conformidad con las directrices de FELASA, en un ambiente de temperatura y humedad controladas con 12 horas de luz / 12 h oscuridad ciclo. Permitir animales libre acceso a la dieta estándar de ratones (Sniff Dieta de roedores estándar) y agua ad libitum.
  2. Anestesiar el ratón por initial intraperitoneal (ip) la inyección de 250 l de solución de anestésico ketamina II (0,1 mg / ml, xilazina 1 mg / ml, buprenorfina 10 g / ml).
    1. * Para el mantenimiento durante intravital de imágenes, administrar continuamente solución anestésica I por inyección ip continua (ketamina 0,1 mg / ml, xilazina 0,5 mg / ml, Fentanilo 5 g / ml) utilizando un dispositivo de bomba de jeringa con un caudal de 0,2 ml / hr en combinación con inhalación de isoflurano 0,5 Vol% (v / v).
    2. Compruebe reflejos después de 5 minutos (por ejemplo, pata pellizco con fórceps), desinfectar la piel para traqueotomía, iniciar la preparación en caso ratón está en estado de anestesia quirúrgica tolerante.
    3. Aplicar crema de protección para los ojos (por ejemplo, Dexpantenol 50 mg / g) para evitar que la córnea se seque (Figura 1B).
  3. Fijar ratón en la mesa de preparación exponer parte ventral con cinta adhesiva para las extremidades; estirar demasiado suavemente cuello, fijar en esta posición, por ejemplo., mediante el uso de una banda de goma enganchado to los incisivos.
    1. Desinfectar la piel y de la piel usando una solución de yodo povidona, mediante la aplicación de desinfectante con un hisopo de algodón.
  4. Realizar corte inicial en la piel (0,5-1 cm de longitud) directamente debajo de la barbilla (Figura 1C)
    1. Diseccionar cuidadosamente tejido conectivo entre las glándulas salivales (Figura 1D).
    2. Corte con cuidado abierto musculoso tubo que rodea la tráquea (Figura 1 E, F).
  5. Coloque hilo quirúrgico debajo de la tráquea para más tarde fijación tubo de ventilación (Figura 1G).
    1. Tráquea abierta con micro-tijeras entre anillos cartilaginosos que realizan una incisión en forma de T (Figura 1H)
  6. Coloque el tubo de ventilación en la tráquea a través de la incisión (~ 0,5 cm). Para empujar el tubo hacia adelante, agarrar extremo caudal con pequeñas pinzas anatómicas y suavemente avanzar el tubo en la tráquea (Figura 1I)
  7. Fijar tubo con hilo quirúrgico (por ejemplo, , 5-0) con hilo colocado en el paso 2.5 atar un nudo alrededor del tubo dentro de la tráquea; realizar segunda fijación craneal del tubo en la piel para evitar y retiro accidental (Figura 1J, K).
  8. Seal corte con pegamento de tejido (por ejemplo, n-butil-2-Cyanoacrylat) (Figura 1L).
  9. Fijar el tubo en la cabeza con cinta adhesiva.

3. laparotomía (15-20 min)

  1. Coloque el ratón en el cojín de calefacción para evitar la hipotermia. Afeitado abdomen, retire con cuidado el pelo de la piel. Desinfectar la piel afeitada y piel mediante el uso de una solución de yodo povidona.
  2. Realizar una pequeña piel cortada debajo del esternón utilizando tijeras quirúrgicas (Figura 2A). Extienda el corte lateralmente debajo de las costillas a ambos lados, la cauterización de todos los vasos sanguíneos visibles para prevenir el sangrado.
  3. Realizar con cuidado un pequeño corte en la línea alba debajo del esternón, abre el peritoneo (Figura 2B). Extienda el corte a ambos lados con cauterización para prevenir el sangrado (Figura 2 C, D).
  4. Coloque el ratón en el plato etapa de agarosa (Figura 2E). Coloque pilas de altura adecuada en ambos lados del ratón (generalmente 12-14 cubreobjetos) (Figura 2F).
  5. Coloque sensor de disparo respiratoria debajo espalda superior para sincronizar el microscopio con la respiración. Activar unidad de disparo (Figura 2G).
  6. Coloque hilo quirúrgico (5-0) a través del esternón para retraer costillas (Figura 2I).
  7. Cortar cuidadosamente ligamento que conecta el hígado y el diafragma (ligamento falciforme), así como el tracto gastrointestinal y el hígado utilizando tijeras quirúrgicas curvas. Cortar el ligamento falciforme hasta la aorta (Figura 2J).

4. Configuración de la muestra (10-15 min)

  1. Coloque ratón en el lado derecho con un ángulo de 45 ° para facilitar el acceso a lóbulo hepático grande.
  2. Añadir puente puesta en escena debajo de las costillas, que cubre el abdomencavidad. Fabricación de un puente mediante el uso de una hoja de cubierta estándar con recubrimiento de cinta adhesiva para cubrir los bordes afilados (Figura 2K).
  3. Coloque lóbulo hepático grande en el escenario. Deslizar con cuidado la sonda lápiz doble bola o una espátula acolchado debajo del hígado y mantenga la parte superior del órgano con un bastoncillo de algodón húmedo o toallitas húmedas. Levante lóbulo sobre el portaobjetos y aplique fricción suave. Lóbulo se puede doblar o plegar. Proporcionar un cuidado especial para sólo una manipulación suave del hígado (Figura 2 l).
  4. Coloca estacas lateral de apoyo, por ejemplo, pilas de pequeñas cubreobjetos (20 mm x 20 mm), de aproximadamente la misma altura del lóbulo hepático junto a él para apoyar la hoja de la cubierta.
  5. Coloque gran hoja de la cubierta (24 mm x 50 mm) en el lóbulo hepático. Asegúrese de que cubreobjetos se orienta más horizontal posible (Figura 2 M).
    NOTA: La hoja de la cubierta debe estar en contacto con el tejido sin apretar. Compruebe si hay signos visibles de deterioro del flujo sanguíneo (tejido blanco). Si microcirculación se interrumpe, agregar más el apoyo a las estacas.
  6. * Coloque dos catéteres intraperitoneal independientes (Figura 2N) para la anestesia de largo plazo y el G-5 aplicación. Instale catéteres lateralmente en la parte inferior del abdomen junto a las patas traseras.
    NOTA: Los catéteres intraperitoneal puede ser hecho a sí mismo mediante la conexión de 27 agujas G con tubo de silicona flexible (Figura 3).
  7. * Aguja Fixate con un bucle de hilo quirúrgico 5-0 a la piel para evitar el desplazamiento accidental.
  8. * Adjuntar bomba de jeringa con solución anestesia I catéter 1, ajuste el caudal de 0,2 ml / h; adjuntar bomba de jeringa con G-5 a 2 de catéter, la tasa de flujo se establece en 0,1 ml / hr.

5. Monitoreo Ratón

  1. * Electrodos de ECG Place en la parte delantera y las extremidades traseras (Figura 4A).
  2. * Fije el tubo de caducidad a CO 2 sensor de nivel.
  3. Añadir sensor de temperatura externo conectado a la almohadilla de calor (Figura 4C).

6. Inclusión y fijación tisular (5-10 min)

  1. Preparar 100 ml de 3% (w / v) de agarosa en 1X PBS. Incrustar hígado cuando la temperatura es a 41 ° C usando una jeringa de 5 ml y una aguja de 18 G (Figura 5A).
  2. Verter restante de agarosa en cubreobjetos y alrededor del ratón (Figura 5B, C). Espere hasta agarosa está totalmente gelatinizado.
  3. Retire el exceso de agarosa utilizando la espátula Heidemann, preparar una lo suficientemente grande viewfield para escanear el lóbulo hepático preparado (Figura 5D, E).

7. Imaging

  1. Transferir el ratón en cámara climática microscopio.
  2. Añadir 50-100 ml de PBS 1x (precalentado en 37 ° C).
  3. Cubrir el plato de la muestra para evitar la evaporación (Figura 5F).
  4. * Disminuir isoflurano por inhalación a 0,5 Vol% (v / v).
  5. * Iniciar el software de control, registro ECG, frecuencia cardiaca y CO 2 espiratorio.
  6. Comience imagen: abrir lapersianas SER, identificar campos de vista de su interés, definir límites superior e inferior para Z-pilas y comenzar la grabación de lapso de tiempo. Reajuste Z-pilas si es necesario para corregir la deriva de Z (por ejemplo., Debido a cambios en la presión arterial o fluctuación de la temperatura, la Figura (5G).
    NOTA: Después de la terminación del período de formación de imágenes o si la circulación o anestesia de los animales se vuelve inestable, sacrificar los ratones por dislocación cervical (sin el despertar de la anestesia).

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Resultados

Para validar nuestro enfoque TPLSM intravital, sometimos GFP / + ratones CXCR6 a imágenes TPLSM intravital. Los ratones se dejaron sin tratar como controles de línea de base o sometidos a una única inyección intraperitoneal de tetracloruro de carbono (CCl 4) para inducir daño hepático agudo 20.

Las secuencias de vídeo fueron tomadas durante un período de tiempo de 2-5 horas, y las células fueron rastreadas con el tiempo debido a su fluorescencia verd...

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Discusión

El objetivo de nuestro estudio fue desarrollar un método altamente estandarizada, estable y reproducible para la imagen TPLSM intravital del hígado. Intravital de imágenes en general ha dado información valiosa sobre el comportamiento celular en condiciones reales siguientes vivienda y la interacción de las diferentes poblaciones de leucocitos en el desarrollo, la homeostasis y la enfermedad. Sin embargo, la posición anatómica algo difícil del hígado, debido a que las vías respiratorias y el movimiento intesti...

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Divulgaciones

The authors disclose no conflict of interests.

Agradecimientos

The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthetics
BuprenorphineEssex Pharma997.00.00Analgeticum, 0.1 mg/kg
FentanylRotex Medicacharge: 30819
Fluovac anesthesia systemHarvard Apparatus34-1030
Glucose 5%Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiserEickemeyer4802885
IsofluraneForene AbbottB 506
Isotonic (0.9%) NaCl solutionDeltaSelect GmbHPZN 00765145
Ketamin 10%cevaCharge: 36217/09
Xylazin 2%medistarCharge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml SyringeBD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flaskSchott Duran21 226 36
25 ml Beaker 2xSchott Duran50-1150
2 ml syringeBD Plastipak
4-0 Vicryl sutureEthiconV7980
Agarosecommercially available
Bepanthen Eye and Nose ointmentBayer Vital GmbH6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery KitFine Science Tools Inc.18010-00
Cotton Gauze swabsFuhrmann GmbH32014
Cover Slip 24x50 mmROTH1871
Durapore silk tape3M1538-1
Feather disposable scalpelFeather02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm IDSmiths medical800/100/200
HistoacrylBraun10500525x 0.5 ml
LeukoplastBSN Medical Inc.
Microscope SlidesROTH1879
Poly-Alcohol Haut…farblos AntisepticumAntiseptica GmbH72PAH200
Sterican needle 18 G x 1B. Braun304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1B. Braun4657705
Tissue papercommercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PLGatz0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2Storz&KleinS-01134
Dumont No.7 forcepsFine Science Tools Inc.91197-00
Graefe forceps curved x1Fine Science Tools Inc.11151-10
Graefe forceps straight x2Fine Science Tools Inc.11050-10
Heidemann spatula HD2Stoma2030.00
Needle holder MathieuFine Science Tools Inc.12010-14
ScissorFine Science Tools Inc.14074-11
Semken forcepsFine Science Tools Inc.11008-13
Small surgical scissors curvedFine Science Tools Inc.14029-10
Small surgical scissors straightFine Science Tools Inc.14028-10
Standard pattern forcepsFine Science Tools Inc.11000-12
Vannas spring scissorsFine Science Tools Inc.15000-08
Equipment
ECG Trigger UnitRapid Biomedical3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide AnalyzerAD Instruments
Minivent Typ 845Harvard Apparatus73-0043
Multiphoton microscope Trimscope ILaVision
Perfusor CompactB. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorderAD InstrumentsPL3508
Temperature controlled heating padSygonix26857617
Temperature sensorcomercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&BoxLife Imaging Services

Referencias

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