Electrospun nanofibras andamios con gradaciones en Organización de fibra

Resumen

A continuación, presentamos un protocolo para fabricar nanofibras andamios electrospun con organización gradated de fibras y explorar sus aplicaciones en la regulación de la morfología celular / orientación. Gradientes con respecto a las propiedades físicas y químicas de las nanofibras andamios ofrecen una amplia variedad de aplicaciones en el campo biomédico.

Resumen

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Introducción

Las nanofibras son una utilidad popular para la ingeniería de tejidos debido a su capacidad para imitar la matriz extracelular en su estructura y tamaño relativo ^1. Sin embargo, algunas interfaces de tejidos nativos, tales como el sitio de inserción del tendón en el hueso, contienen fibras de colágeno, que exhiben una estructura organizativa variable que aumenta en alineación hacia el tendón y disminuye en el sitio de hueso ^2-5. Por lo tanto, para la regeneración de tejidos eficaz hay una necesidad de fabricar un andamio que podrían imitar eficazmente este gradiente estructural.

Anteriormente, ha habido una investigación llevada a cabo sobre los cambios graduales en la composición de la fibra, concretamente, el contenido mineral ^6. Sin embargo, volver a crear el componente estructural de los tejidos conectivos sigue siendo en gran parte inexplorado. Un estudio anterior examinó gradientes morfológicos mediante el estudio del efecto de la densidad de las partículas de sílice superficie sobre la proliferación de los osteoblastos de calota de rata y se encontró un Inverrelación entre la densidad se partícula de sílice y la proliferación celular ^7. Pero los cambios morfológicos que mediaron la proliferación celular en trabajos anteriores fueron en su mayoría relacionados con la rugosidad superficial que carecen de la capacidad en la imitación de los cambios organizativos de fibra de ^7,8. Un estudio reciente intentó fabricar un andamio que imitaba las orientaciones únicas fibras de colágeno mediante el uso de una novela colector para electrospinning ^9. Si bien este estudio logró producir un andamio con fibras tanto alineados y aleatorios, no logró imitar los cambios graduales que se exhiben en los tejidos nativos. También, en la producción de componentes separados, con un cambio inmediato de alineado con orientación aleatoria, las propiedades biomecánicas de este andamio disminuyeron significativamente. Sin el trabajo previo ha sido capaz de producir nanofibras andamios aplicables con gradaciones continuas en orientaciones de las fibras de alineado y al azar. Nuestro estudio reciente ha demostrado la recreación exitosa de nanofibras andamioscon gradaciones en la organización de fibra que potencialmente pueden imitar la organización de colágeno nativo en la inserción del tendón al hueso ^10. Este trabajo tiene como objetivo presentar los protocolos utilizados para la producción de nanofibras andamios con una estructura que se asemeja mucho a la de organización de las fibras en la interfaz nativa del tejido del tendón al hueso.

Estructuras de nanofibras Gradient han potencialmente aplicaciones en una variedad de campos de gran alcance. Nos centramos en las aplicaciones a la ingeniería de tejidos de la zona de inserción del tendón al hueso mediante la combinación de nuestros andamios con células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) que ya se utilizan para la regeneración de tejidos en varios sustratos ^11-14. Además, ADSC son de naturaleza muy similar a las células madre de médula ósea en términos de multipotencia y su recurso es abundante que puede ser cosechada usando un simple ^15,16 procedimiento de liposucción. Siembra de estas células a los andamios nanofibras graduadas mejora aún más su tisdemandar aplicaciones de ingeniería al permitir la distribución controlada de las células que potencialmente pueden diferenciarse en diversos tejidos. Además de la siembra de células madre, las nanofibras se pueden encapsular con moléculas de señalización para la regulación de la respuesta celular. El acoplamiento de nanoencapsulación con el gradiente de la organización de estos andamios permite el estudio del comportamiento celular o posibles diseños de implantes y recubrimientos. La encapsulación de moléculas funcionales como la proteína morfogenética ósea 2 (BMP2), que se ha demostrado que induce la diferenciación de osteoblastos ^15,16, podría mejorar aún más las aplicaciones de ingeniería de tejidos de estos andamios ^10.

Protocolo

1. Preparación de la Solución

1. Preparar una solución de poli (ε-caprolactona) (PCL) (M _w = 80.000 g / mol) a una concentración aproximada de 100 mg / ml. Disolver PCL en una mezcla de diclorometano (DCM) y N, N-dimethlyformamide (DMF) en una proporción de 4: 1 (v / v) con una concentración de 10% (w / v).
2. Colocar la solución en un tubo de vidrio de 20 ml para la mezcla. Coloque el tubo de vidrio en limpiador ultrasónico durante 30 minutos, o hasta que la solución es transparente.

2. Aparato Preparación

1. Añadir la solución de PCL preparado en una jeringa de 5 ml con una aguja roma de calibre 21 adjunta.
2. Coloque bomba de jeringa en una posición electrospinning vertical, según la figura 1.
3. Utilice un colector de acero inoxidable hueco con un espacio abierto de 2 cm x 5 cm para el sustrato de fibra alineados. Coloque el colector de 12 cm desde la punta de la aguja.
4. Conecte la fuente de la corriente continua (DC) de suministro de alta tensión a laaguja y tierra el colector. Asegúrese de que el colector está conectado a tierra de forma individual, sin contacto con el otro equipo de laboratorio.

3. electrospinning

1. Conjunto bomba de jeringa a 1,50 ml / hora, hasta que las gotas que forman en la punta de la aguja se reemplazan inmediatamente cuando se retiran. A continuación, establezca el caudal de 0,50 ml / hr.
2. Gire el operador de tensión a 12 kV.
3. Electrospin hasta que las fibras uniaxialmente alineadas cubrir completamente la brecha en el colector.
4. Aplique el pegamento a los bordes de una placa de vidrio pequeño y transferir las fibras desde el colector de vacío a la placa de vidrio. Coloque la placa de vidrio en la parte superior de una pieza de papel de aluminio que tiene el mismo tamaño que la placa de vidrio y se pone a tierra.
5. Coloque el segundo colector de jeringa de acuerdo con la Figura 3.
6. Coloque la máscara de plástico a la segunda bomba de jeringa y colocarla 2 mm por encima del colector.
7. Añadir cumarina 6 al 1% (w / w) a la solución de PCL-nan sioencapsulation es desear, y mezclar hasta que la solución esté transparente.
8. Cargue el PCL o PCL / cumarina solución 6 en una aguja de 5 ml con una aguja roma de calibre 21. Establecer bomba vertical a 0,50 ml / hr y horizontal para tirar a las 9 ml / ho a una velocidad aproximada de 1 mm / min.
9. Electrospin hasta que la máscara se ha movido casi completamente fuera del colector, pero con la zona de borde todavía bajo la máscara.

4. Caracterización de fibra

1. Colocar las muestras de cinta conductora de doble cara para el perno metálico y la capa de platino durante 40 segundos usando un revestidor por bombardeo iónico a 40 mA.
   1. Examinar fibras a través de microscopio electrónico de barrido (SEM) de acuerdo con nuestros estudios anteriores ^17,18.
   2. Recoger imágenes a un voltaje de aceleración de 15 kV.
2. Realizar un análisis rápido transformada de Fourier (FFT) en una muestra de fibra separada para medir la alineación de la fibra. La información detallada sobre la medición de alineación de la fibra por FFT puede referirse to estudios previos ^19,20.

5. Las células madre de la siembra.

1. Esterilizar las muestras de fibras por inmersión en una solución de etanol al 70% durante 2 horas. A continuación, lavar las fibras con agua destilada para eliminar cualquier contaminante.
2. Obtener ADSC humanos y células de cultivo en un matraz de 25 ^cm2 a 37 ° C en una atmósfera de 95% de aire / 5% de CO _2. Cambiar el medio de cultivo celular cada otro día ^10.
3. Tripsinizar las células y contar el número de células. Específicamente, eliminar todo el medio de cultivo del matraz de cultivo celular y se lavan las células con tampón fosfato salino (PBS) dos veces. A continuación, añadir 1 m ^l de una solución 0,25% de tripsina-EDTA (pre-calentamiento en baño de agua a 37 ° C) para cubrir la monocapa de células y se incuba el matraz en la incubadora de cultivo celular durante 2-3 minutos. Añadir 4 ml de medio de cultivo y lavar todas las células de la superficie pipeteando el medio en toda la superficie. º Centrifugar la suspensión de células y re-dispersasedimento celular e en el medio de cultivo. Contar las células a través de hemocitómetro. Semilla de alrededor de 1 × 10 ⁴ células a la estructura de nanofibras se coloca en un plato -cultura 35 mm e incubar durante 3 y 7 días.
4. Células manchas usando diacetato de fluoresceína (5 mg / ml en acetona) (FDA), entonces la imagen de las muestras usando un microscopio de fluorescencia. Específicamente, añadir 100 l de solución de la FDA para la placa de cultivo y se incuba durante 30 min. Lavar las células con PBS tres veces antes de imágenes fluorescentes. Analizar la orientación celular mediante un programa mat-laboratorio personalizado basado en nuestros estudios previos ^10.

Resultados

Usando este protocolo, se formó una estera de fibra con un gradiente de organización. La Figura 3 muestra las imágenes SEM tomadas en varios lugares de la estructura de nanofibras. Cualitativamente, se puede determinar que hay una progresión de las fibras uniaxialmente alineadas en 0 mm (Figura 3A) para una variedad de fibra al azar en 6 mm (Figura 3D). La FFT da un valor cuantitativo a la alineación de la fibra, detalles sobre los procesos cuantitativos se detalla...

Discusión

The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.

Fu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2