Análisis Electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas

Resumen

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Resumen

El electrorretinograma (ERG) es un método electrofisiológico no invasivo para determinar la función de la retina. A través de la colocación de un electrodo en la superficie de la córnea, la actividad eléctrica generada en respuesta a la luz puede ser medido y utilizado para evaluar la actividad de las células de la retina in vivo. Este manuscrito describe el uso de la ERG para medir la función visual en el pez cebra. El pez cebra se han utilizado mucho como modelo para el desarrollo de vertebrados debido a la facilidad de la supresión de genes por los oligonucleótidos de morfolino y la manipulación farmacológica. En 5-10 dpf, sólo los conos son funcionales en la retina larval. Por lo tanto, el pez cebra, a diferencia de otros animales, es un poderoso sistema modelo para el estudio de la función visual cono in vivo. Este protocolo utiliza anestesia estándar, micromanipulación y protocolos estereomicroscopía que son comunes en los laboratorios que realizan investigación de pez cebra. Los métodos descritos hacen uso de la ecuación de electrofisiología estándarCONEXIONES y una cámara de poca luz para guiar la colocación de la grabación de microelectrodos sobre la córnea larval. Por último, demostrar cómo un comercialmente disponible ERG estimulador / grabador diseñado originalmente para su uso con ratones se puede adaptar fácilmente para su uso con el pez cebra. ERG de larvas de pez cebra ofrece un excelente método de ensayo de la función visual de cono en los animales que han sido modificados por la inyección de oligonucleótido morfolino, así como las técnicas de ingeniería del genoma más recientes, como los dedos de zinc nucleasas (ZFNs), Transcripción Activador-Como Efector Nucleasas (Talens), y agrupados Regularmente Interspaced cortos Palindromic Repeticiones (CRISPR) / Cas9, todos los cuales han aumentado en gran medida la eficiencia y la eficacia de la orientación de genes en el pez cebra. Además, aprovechamos la capacidad de los agentes farmacológicos para penetrar en larvas de pez cebra para evaluar los componentes moleculares que contribuyen a la fotorrespuesta. Este protocolo describe una configuración que puede ser modificado y utilizado por los investigadorescon varios objetivos experimentales.

Introducción

El electrorretinograma (ERG) es un método electrofisiológico no invasiva que se ha utilizado ampliamente en la clínica para determinar la función de la retina en los seres humanos. La actividad eléctrica en respuesta a un estímulo de luz se mide mediante la colocación de electrodos de registro en la superficie externa de la córnea. Las características del paradigma estímulo y la respuesta de la forma de onda definen las neuronas de la retina que contribuyen a la respuesta. Este método ha sido adaptado para su uso con un número de modelos animales, incluyendo ratones y pez cebra. La respuesta típica de vertebrados ERG tiene cuatro componentes principales: la onda a, que es un potencial córnea negativa derivada de la actividad de las células fotorreceptoras; la onda b, un potencial córnea positivo derivado de la EN células bipolares; la onda d, un potencial de córnea positiva interpretarse como la actividad de las células bipolares OFF; y la onda c, que se produce varios segundos después de la onda b y refleja la actividad en las células de Müller y la retinal epitelio pigmentario de ^1-4. Referencias adicionales para la comprensión de la historia y los principios de análisis de ERG en humanos y modelos animales son el libro de texto en línea, Webvision, de la Universidad de Utah y textos tales como los Principios y Práctica de Electrofisiología Clínica de la Visión ^{4, 5.}

Danio rerio (pez cebra) ha sido favorecido como un modelo para el desarrollo de vertebrados, debido a su rápida maduración y la transparencia, que permite el análisis morfológico no invasiva de órganos y sistemas, ensayos de comportamiento y de ambos adelante y atrás pantallas genéticos (para una revisión, ver Fadool y Dowling ^6). Larvas de pez cebra son altamente susceptibles de manipulación genética y farmacológica, que, cuando junto con su alta fecundidad, los hacen un excelente modelo animal para los análisis biológicos de alto rendimiento. La mayor proporción de conos para varillas en larvas de pez cebra - aproximadamente 1: 1 en comparación con ratones (~ 3% de conos) - hacen particularmente útiles para el estudio de la función de cono ^7-9.

En la retina de los vertebrados, los conos se desarrollan antes de varillas ^10. Curiosamente, los conos de pez cebra son operativos ya en 4 dpf, permitiendo selectiva análisis electrofisiológico de conos en esa etapa ^{6, 11,12.} En contraste, las respuestas de ERG en barras aparecen entre 11 y 21 dpf ^13. Por lo tanto, las larvas de pez cebra a 4-7 servir dpf funcionalmente como una retina todo-cono. Sin embargo, la respuesta fotópica nativo ERG de 4-7 larvas dpf está dominada por la onda b. La aplicación de agentes farmacológicos, tales como L - (+) - 2-amino-4-fosfono-butírico (L-AP4), un agonista para el glutamato metabotrópicos (mGluR6) receptor expresado por la sobre las células bipolares, bloquea eficazmente la generación de la onda b y revela el potencial de masa aislado cono receptor, (la "onda a") ^14-17.

Aquí se describe un simple y reliablmétodo para el análisis e ERG usando equipo ERG comercial, diseñado para su uso con ratones que han sido adaptados para su uso con las larvas de pez cebra. Este sistema puede ser utilizado en larvas de pez cebra de diferentes antecedentes genéticos, así como los tratados con agentes farmacológicos, para ayudar a los investigadores en la identificación de las vías de señalización que contribuyen a la sensibilidad visual y adaptación a la luz ^16. Los procedimientos experimentales descritos en este protocolo guiarán los investigadores en el uso del análisis de ERG para responder a una variedad de cuestiones biológicas relativas a la visión, y demostrar la construcción de una configuración flexible de ERG.

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Protocolo

El mantenimiento de los animales y los protocolos experimentales fueron aprobados por los comités de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, y cumplen con todos los requisitos de la Oficina de NIH de Laboratorio Bienestar Animal y la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International.
Se emplearon Para obtener larvas para el análisis ERG, publicado protocolos para la cría de peces cebra estándar y mantenimiento ^18: NOTA. Las larvas se obtiene a través de la reproducción natural y alojado bajo un 14 h luz / 10 h oscuridad ciclo. Este protocolo ha sido optimizado para las larvas a los 5-7 días después de la fertilización (DPF), pero lo ideal podría ser realizado en peces de más edad con pequeñas modificaciones en el procedimiento. En este caso, utilice la cepa TL de larvas de pez cebra de tipo salvaje a 5 dpf.

1. Micropipetas Producción

1. Tire varias micropipetas utilizando 1,5 x 0,86 mm (diámetro exterior de diámetro interior) capilares de vidrio de borosilicato pulidas al fuego confilamento (temperatura de fusión, 821 ° C) y un P-97 Flaming / Castaño Micropipeta Puller equipado con filamento de calor caja. Utilice el programa para la configuración de micropipetas descritos en la Tabla 1.
2. Compruebe cada micropipeta con un microscopio con un gobernante retícula apropiada para asegurar que los consejos están a 10-15 m de diámetro y tiene una abertura de la punta suave (es decir, sin bordes dentados).
3. Guarde cuidadosamente micropipetas para prevenir el daño de la punta y la exposición al polvo. Las opciones de almacenamiento incluyen placas de Petri con cinta laboratorio, cajas de espuma forrada, o contenedores de almacenamiento micropipeta disponibles en el mercado.
   Nota: Otros extractores de micropipeta de vidrio y los capilares se pueden utilizar siempre y cuando el diámetro correcto de la micropipeta y se consigue una punta de alta calidad.

Presión	Calor	Halar	Velocidad	Tiempo
500	560	-	30	200
500	450	-	30	200
500	410	55	40	200

Tabla 1: Programa para la producción de micropipetas utilizando un / marrón micropipeta Puller P-97 Flaming equipado con un filamento de calor cuadro Micropipetas se hacen usando 1,5 x 1,0 mm ² (diámetro externo por el diámetro interior) capilares de vidrio de borosilicato pulidas al fuego con filamento. (temperatura de fusión, 821 ° C).

2. Preparación Buffer

1. Use filtrada, tampón de Ringer oxigenada goldfish ¹⁹ en el capilar microelectrodo y para saturar la esponja de alcohol de polivinilo (PVA) sobre el que las larvas se colocan para los experimentos. Como alternativa, utilice el E3 medios embrión o solución salina equilibrada de Hank.
2. Prepare la solución 10x goldfish de Ringer como se describe en la Tabla 2. Ajustar a pH 7,8, y esterilizar usando un filtro de 0,22 micras y almacenar la 10x a 4 ° C.
3. Crear una solución de trabajo en el día del experimento diluyendo solución del 10x de Ringer a 1x con agua destilada desionizada. Filtra el uso de un sistema de filtro de 0,22 micras. De compuestos oxigenados por burbujeo con 95% de _O2 / 5% de CO ₂ de gas durante 10 minutos. Cap herméticamente después para asegurar que la solución permanece oxigenada.

NaCl	1,25 M
KCl	26 mM
CaCl 2	25 mM
MgCl 2	10 mM
glucosa	100 mM
HEPES	100 mM

jove_content "> Cuadro 2: Preparación de la solución 10x goldfish de Ringer.

3. Plataforma Electrorretinograma

1. Realizar experimentos ERG en una mesa de anti-vibración dentro de una jaula de Faraday para mejorar la relación señal a ruido. Adjunte una plataforma de acero de encargo a la mesa antivibraciones usando tuercas hexagonales. Coloque una plataforma de plástico movible con un polímero de uretano inferior amortiguador viscoelástico sobre la mesa bajo la fuente de luz.
2. Coloque la cámara con un soporte imantado, dirigido hacia abajo en la plataforma móvil de plástico. Coloque el micromanipulador (que celebrará el microelectrodo grabación) con un segundo soporte imantado a la derecha de la plataforma de plástico movible. Asegúrese de que la cámara y el micromanipulador no se verá afectado por el movimiento de otros equipos y que no bloqueen la iluminación de la fuente de luz.
3. Conecte la cámara a un monitor de vídeo y posicionarlo para ver el ojo de lalarva para colocar el electrodo en la posición correcta.
4. Asegúrese de que la configuración correcta conexión a tierra con cable de cobre. Para comprobar el ruido, colocar el electrodo de referencia y la punta de la microelectrodo grabación en una placa de Petri de 35 mm llena con solución de Ringer. Compruebe los niveles de ruido eléctrico de la instalación con un osciloscopio o una característica incorporada del aparato ERG. Los niveles de ruido deben ser no más de ± 10 mV del valor inicial.

4. Preparación de la esponja

1. Corte un pequeño rectángulo de esponja PVA seco que se ajuste perfectamente en un plato de Petri de 35 mm. El espesor de la esponja no debe ser mayor que la profundidad del plato. Use un cuchillo con una hoja de afeitar limpia para cortar.
2. Hacer un recorte adicional en la esponja para acomodar el electrodo de referencia (ya sea un corte superficial a lo largo en la parte inferior de la esponja o una mariposa cortado verticalmente a través de uno de los extremos más pequeños).
3. Use un marcador resistente químicamentepara marcar un pequeño punto en la esponja (donde se colocará la larva) que puede ser utilizado para el posicionamiento de la cámara.
4. Sumerja la esponja PVA en solución de Ringer hasta saturación. Retire y seque rápidamente sobre una toalla de papel 2-3 veces. Coloque la esponja en un recipiente limpio 35 mm placa de Petri.
5. Coloque la placa de Petri que contiene la esponja en la plataforma de plástico tal que la marca puede ser visualizada por la cámara.

5. Preparación del electrodo

NOTA: La configuración de pez cebra se compone de un electrodo de referencia en contacto con una solución saturada de esponja de PVA de Ringer y un electrodo de registro en contacto con la córnea. El electrodo de referencia se compone de un pellet de Ag / AgCl. El electrodo de registro es una micropipeta de vidrio tirado lleno de solución de Ringer y sostenido por un soporte de microelectrodos que contiene un alambre de Ag.

1. Cloruro de los electrodos sumergiéndolos en 9.6% de hipoclorito de sodio (lejía) durante 5 minutos (el micr grabaciónalambre oelectrode) o 15 min (el electrodo de referencia). Deje secar al aire en un Kimwipe durante 5 min.
   1. Dependiendo del estilo de corte hecho en el paso 4.2, colocar la pastilla de Ag / AgCl del electrodo de referencia en (para el corte de mariposa vertical) o bajo (para el corte superficial longitudinal en la parte inferior) de la esponja. Conecte el cable del electrodo de referencia al sistema de grabación.
   2. Alternativamente, si la configuración de ERG tiene limitaciones de espacio o no son particularmente fuertes artefactos fotovoltaicas desde el electrodo de Ag / AgCl, conectar el electrodo de referencia a la esponja a través de un puente salino de agar para mover el electrodo fuera de la trayectoria de la luz.
2. Adjuntar ~ 40 cm de tubo de tamaño apropiado a un 5 ml no Luer de la jeringa de bloqueo. Llene la jeringa con solución de Ringer. Titulares de microelectrodos que poseen puertos de presión envían típicamente con adaptadores para acomodar tubos con diámetros interiores de 1/16 ", 3/32", 1/8 "o 5/32".
3. Llene un 1 ml Luer no jeringa con bloqueoSolución de Ringer y, con un Micro-fil, llenar cuidadosamente el titular de microelectrodos. Evitar la formación de burbujas.
4. Coloque la jeringa de 5 ml al puerto de presión del titular de microelectrodos con tubo y lo utilizan para garantizar que el titular de microelectrodos está lleno de solución de Ringer. Uso de la Micro-fil y 1 ml jeringa llena con solución de Ringer, llenar el vaso micropipeta de la punta y asegúrese de que no hay burbujas.
5. Coloque la micropipeta de vidrio al titular de microelectrodos, teniendo cuidado de mantener la recta de alambre electrodo. Una vez asegurado, utilice la jeringa de 5 ml para forzar cuidadosamente la solución de Ringer a través del microelectrodo hasta que una pequeña cantidad de solución es visible en la punta. Aplicación ocasional de la presión a la jeringa (cuando no se aplica a la córnea) evitará la formación de burbujas de aire, así como oclusiones debidas a la acumulación de polvo o sal, en la punta de la micropipeta.
   1. Si la solución sale como una corriente, sustituya el gmicropipeta muchacha, como la abertura de la punta es demasiado grande o está dañado.
6. Con cuidado, coloque el microelectrodo de grabación en el micromanipulador y conecte el cable al sistema de grabación.

6. Análisis Electrorretinograma

NOTA: Debido al predominio de cono de la retina de larvas, resultados ERG de alta calidad se pueden obtener cuando los preparativos para la grabación se realizan bajo los bajos niveles de luz blanca indirecta (<1 lux) o con períodos cortos (<1 min) de mayor intensidad ( ≤250 lux) Luz de trabajo. Un breve período de adaptación a la oscuridad todavía se requiere antes de la grabación (consulte el paso 6.7). Sin embargo, los experimentos pueden llevarse a cabo bajo la luz roja o infrarroja tenue con una cámara sensible al infrarrojo. Todos los experimentos se realizaron en esterilizada por filtración (0,22 micras) del agua del sistema de la Línea de UNC pez cebra acuicultura pero los medios de embrión de alternativas pueden ser utilizados.

1. Cuadrados de toallas de papel cortadas que miden aproximadamente 1² cm.
2. Si la medición aislada potencial receptor masa cono, incubar 3-5 larvas en el agua del sistema con 500 mM (±) -2-4-fosfonobutírico Amino ácido (APB) durante 5 min.
   NOTA: Mientras APB es una mezcla racémica de la activa (L) y (R) formas inactivas de AP4, es tan eficaz como la L-AP4 y es menos costoso.
3. Anestesie 3-5 larvas en agua del sistema con 0,02% (w / v) tricaína hasta que no responde, aproximadamente 1-2 min.
4. Utilice una pipeta y una pipeta Pasteur bomba para transferir cuidadosamente larvas individuales en las casillas de toallas de papel en un estereoscopio de disección utilizando iluminación mínima (≤250 lux para <1 min). Compruebe la posición de cada larva y elegir un candidato que es dorsal hacia arriba con un ojo no ocluida.
   1. Para grabaciones prolongadas (> 30 min), mantener la larva húmeda acristalamiento cuerpo hasta, pero sin incluir la cabeza con 3% de metilcelulosa usando un cepillo de pelo de camello bien.
5. Con unas pinzas, transfiera el squar toalla de papele con la larva de la esponja PVA húmedo.
   1. Para grabaciones prolongados (> 30 min), aplicar una corriente continua de agua saturada de 100% de O ₂ de gas sobre la larva por burbujeo del gas a través de una piedra de aire en un matraz de brazo lateral que contiene agua destilada. Coloque el tubo que sale de la boca lateral frasco que transporta el oxígeno humidificado cerca de la cabeza de la larva.
      NOTA: El paso 6.4.1 y 6.5.1 paso para prolongar la vida de los peces ^16.
6. Bajo iluminación mínima, utilice el micromanipulador y cámara para posicionar la punta de microelectrodos en el punto medio entre la nasal y extremos caudales de los ojos y presione suavemente sobre el límite dorsal de la córnea.
   NOTA: El mal posicionamiento de la punta del electrodo a las áreas distales de la medida de la córnea puede dar lugar a formas de onda ERG de polaridad invertida.
7. Permita larva a oscuro-adaptarse durante 5-10 minutos.
8. Respuestas de flash protocolo de ensayo a la luz proporcionada por una fuente de luz LED o estimulador óptica utilizando el avaiequipos de estimulación y registro lable. Ajustar parámetros de protocolo, como la intensidad del flash, flash de longitud, color flash, intensidad de fondo y ajustes de color y filtros para adaptarse a la experiencia.
9. Cuando haya terminado con el experimento, la eutanasia larvas según las directrices de la AVMA / IACUC.

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Resultados

Típicamente, los ERG se registran a partir de larvas de pez cebra a 5 dpf, ya que un número de estudios han publicado grabaciones ERG en esta etapa ^{9, 16,20.} Respuestas de larvas se midieron en condiciones adaptadas a la oscuridad sin iluminación de fondo utilizando un 20 mseg estímulo de la luz LED blanco. Hemos utilizado un sistema ERG disponible comercialmente que consiste en un estimulador Ganzfeld luz y equipo de controlador / grabadora. El estimulador utiliza una modulación de ancho de sistema para...

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Discusión

En este protocolo se detalla un procedimiento sencillo para grabaciones ERG de larvas de pez cebra. Este procedimiento permite un ensayo rápido y completo de function.There visual son varios pasos críticos de todo el procedimiento que se debe tener en cuenta. Las larvas de pez cebra debe estar sano antes del experimento para prevenir la muerte durante los tratamientos farmacológicos potenciales y asegurar medios de vida prolongada durante las grabaciones ERG. Además, es importante que las larvas utilizado en los exp...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Faraday cage	80/20 Inc	custom	Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge	Amazon	B000ZOWG1C	Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems	Corning	431154	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2	Diagnosys, LLC	contact	Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome	Diagnosys, LLC	contact	Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator	Drummond	3-000-024-R	Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand	Drummond	3-000-025-MB	Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions	Grass Technologies	F-LX	Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor	Grass Technologies	DF-215/10	Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline	Lowes or Home Depot	various	For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters	Millipore	SCGP00525	Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor	Monoprice	4127	Connecting camera to BNC cable
BNC cable	Monoprice	626	Connecting camera to video adaptor
Camera lens	Navitar	1582232	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler	Navitar	1501149	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter	Sewell	SW-29297-PRO	BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB	Sigma	A1910	mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass	Sutter	BF-150-86-10	Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)
P97 Flaming/Brown puller	Sutter	P97	For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet	Thorlabs	SB12A	Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard	Thorlabs	B2436F	Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts	Thorlabs	PWA074	Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh	TWP	022X022C0150W36T	To line Faraday Cage
Pipette pump	VWR	53502-233	Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes	VWR	14672-608	Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera	Watec	WAT-902B	Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222)	Western Chemical	Tricaine-S	Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil	WPI	MF28G-5	Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder	WPI	MEH2SW15	Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode	WPI	DRIREF-5SH	Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative)	WPI	EP1	Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder	WPI	13620	Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard