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Resumen

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Resumen

Modelos animales experimentales de ictus son herramientas muy valiosas para la comprensión de la patología de carrera y el desarrollo de estrategias de tratamiento más eficaces. Un protocolo de 2 semanas para precondicionamiento hipóxico repetitivo (RHP) induce una protección a largo plazo contra las lesiones del sistema nervioso central (SNC) en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular isquémico focal. RHP consta de 9 exposiciones estocásticos a la hipoxia que varían tanto en duración (2 o 4 hr) y la intensidad (8% y 11% O 2). RHP reduce los volúmenes de infarto, barrera hematoencefálica (BBB) ​​perturbación, y la respuesta inflamatoria posterior al accidente cerebrovascular durante semanas después de la última exposición a la hipoxia, lo que sugiere una inducción a largo plazo de un fenotipo SNC-protectora endógena. La metodología para la cuantificación de doble el volumen del infarto y disrupción de la BHE es eficaz en la evaluación de la protección neurovascular en ratones con RHP u otros neuroprotectores putativos. Adultos ratones macho Swiss Webster fueron acondicionados previamente por RHP o exposiciones de duración equivalente al 21% de O (es decir, aire ambiente). Una oclusión media transitoria 60 min arteria cerebral (tMCAo) fue inducida 2 semanas después de la última exposición hipóxica. Tanto la oclusión y reperfusión fueron confirmados por transcraneal flujometría Doppler láser. Veintidós horas después de la reperfusión, azul de Evans (EB) se administró por vía intravenosa a través de una inyección en la vena de la cola. 2 horas más tarde, los animales fueron sacrificados por sobredosis y secciones cerebrales isoflurano se tiñeron con cloruro de 2,3,5- trifeniltetrazolio (TTC). Los volúmenes de infarto fueron luego cuantificados. A continuación, EB se extrajo a partir del tejido durante 48 hr para determinar disrupción de la BHE después de tMCAo. En resumen, RHP es un protocolo simple que puede ser replicado, con un costo mínimo, para inducir protección neurovascular endógeno a largo plazo de una lesión derrame cerebral en ratones, con el potencial de la traducción de otros estados de enfermedad pro-inflamatorias CNS-basados ​​y sistémicos.

Introducción

Como la principal causa de discapacidad en los adultos y la cuarta causa principal de muerte, accidente cerebrovascular es uno de los estados de enfermedad más debilitantes que enfrenta la población adulta de los Estados Unidos. 1 Los modelos animales de accidente cerebrovascular permiten para la investigación experimental de nuevos métodos de reducción de la lesión isquémica y mejorar la recuperación después de un accidente cerebrovascular. Una vía novedosa para este tipo de investigación traslacional se preacondicionamiento. Preacondicionamiento es el uso intencional de un estímulo no perjudicial para reducir el daño de una posterior, y más grave, lesiones. 2 hipóxico preacondicionamiento se ha demostrado que producen cambios pleiotrópicos en el cerebro que proporcionan protección contra el accidente cerebrovascular en tanto in vivo e in vitro . 3 Sin embargo, una sola exposición a la hipoxia sólo ofrece neuroprotección corto plazo, lo que induce a menos de 72 horas de la tolerancia frente a la isquemia en ratones adultos. 4 incluso después de cuatro semanas de exposiciones diarias 14 hr a la hipoxia hipobárica, Lin et al. found neuroprotección que solamente se mantuvo durante una semana. 5 precondicionamiento hipóxico repetitiva (RHP) se caracteriza por las variaciones estocásticas en la frecuencia, duración e intensidad de las exposiciones hipóxicas. En contraste con un único reto preacondicionamiento, RHP induce un fenotipo cerebroprotectora que dura hasta ocho semanas en ratones. 6 RHP redujo los volúmenes de infarto, barrera hematoencefálica (BBB) ​​perturbación, inflamación vascular y diapedesis de leucocitos durante semanas después de la exposición hipóxica definitiva . RHP reduce específicamente la inflamación en el cerebro isquémico mediante la reducción de las células T, monocitos, macrófagos y las poblaciones, mientras que el mantenimiento de las poblaciones de células B en el hemisferio isquémico. 7 De hecho, RHP induce un fenotipo inmunosupresor en ratones antes de cualquier lesión del SNC, incluido el accidente cerebrovascular. Células B tratados con RHP aisladas de ratones sanos tratados-RHP exhibieron un fenotipo antiinflamatorio único, con una regulación a la baja tanto de la presentación de antígenos y la producción de anticuerpos. Losreducción general en mecanismos inmunes adaptativos pro-inflamatorias hace RHP una excelente metodología para inducir inmunosupresión endógena no sólo para enfermedades inflamatorias del SNC-específicos, sino también modelos de lesión o enfermedad sistémica que incluyen una patología pro-inflamatorio.

RHP reduce tanto el volumen del infarto y la disrupción de la BHE tras una oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAo). Los modelos animales de accidente cerebrovascular, tales como el comúnmente usado tMCAo, mejorar dramáticamente la comprensión de la fisiopatología del accidente cerebrovascular, así como el diseño de Neurotherapeutics más eficaces. Primero desarrollado por Koizumi et al., En 1986, el procedimiento tMCAo 8 es un método ampliamente utilizado de inducir accidente cerebrovascular en roedores y uno de los métodos preferidos para la investigación de la inflamación después de la reperfusión. Como los métodos para tMCAo evolucionan, el uso más reciente de filamentos recubiertos de silicona reducir aún más el riesgo de hemorragia subaracnoidea en comparación con otros modelos de 9,10 </ Sup> y mejorar la fiabilidad, aunque por desgracia tMCAo menudo produce una amplia variación en los volúmenes de infarto. 11-13 La mayor parte de estos estudios delinear regiones de infarto en el cerebro secciones coronales mediante tinción con cloruro de 2,3,5- trifeniltetrazolio (TTC), considerado un estándar de oro para la cuantificación del infarto debido a que es una manera simple y barata de producir vivos, resultados replicables. TTC sirve como un sustrato de deshidrogenasas presentes en las mitocondrias. Cuando rodajas de cerebro están expuestos a la solución de TTC, TTC se toma selectivamente en células vivas donde su producto de reducción no soluble, formazán, precipita a un color rojo intenso en la mitocondria viables. Debido a la disfunción mitocondrial en el tejido isquémico, este tejido permanece blanco, lo que permite la diferenciación del tejido dañado y sano. 14

RHP también reduce la acreditación interrupción en el hemisferio isquémico. 6 Por lo tanto, la doble cuantificación de acreditación integridad dentro de la misma blluvias como el volumen del infarto basado en TTC Determinaciones 15 proporcionaría información útil sobre la eficacia plena de la protección endógena, y posibles relaciones causales entre la disrupción de la BHE y el infarto en los animales no tratados y tratados. La afluencia de sangre periférica a través de una acreditación interrumpido, secundaria a un accidente cerebrovascular, aumenta poblaciones de leucocitos, citoquinas pro-inflamatorias, estrés oxidativo, edema vasogénico y transformación hemorrágica en el hemisferio isquémico, en última instancia, el aumento de las tasas de infección y mortalidad en pacientes con ictus isquémico 16,17. Un método común de medir la disrupción de la BHE en modelos animales es a través de la cuantificación de azul de Evans (EB) de fugas de tinte en el cerebro. 15,18-21 EB se une selectivamente a la albúmina sérica, una proteína globular (MW = 65 kDa) que no atraviesa la BBB en animales no lesionados. 22 Tras el accidente cerebrovascular isquémico, EB se infiltra en el cerebro, y emite fluorescencia a 620 nm, lo que permite la medición de la densidad óptica within el parénquima lesionado perfundido. 22 La densidad óptica es directamente proporcional a la permeabilidad de la BBB cuando EB ha sido lavada fuera de la vasculatura cortical post-mortem por perfusión transcardiaca. Con el procesamiento inmediato de los cerebros teñidas con TTC en animales con administración EB, tanto el volumen del infarto y la disrupción de la BHE se pueden cuantificar de manera efectiva. Cabe señalar, sin embargo, que el daño neuronal y la disrupción de la BHE no son procesos concomitantes en el cerebro post-accidente cerebrovascular, 23,24 lo que la selección de tiempo de sacrificio es una consideración importante.

El protocolo que sigue detalla el método RHP, el método tMCAo para inducir una oclusión arterial temporal que los modelos de las oclusiones de la arteria cerebral media en pacientes humanos, y los métodos histológicos duales para determinar neurales y vasculares puntos finales de lesiones accidente cerebrovascular. TTC mide la muerte celular y el daño tisular acumulativa, lo que permite la cuantificación de un infarto vol generalume, mientras que EB ofrece para la cuantificación hemisférica de acreditación daños.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) en UT Southwestern Medical Center, que se rige por los Institutos Nacionales de la política de la Salud (NIH) para el uso de animales de experimentación.

1. repetitivo hipóxico Precondicionamiento

  1. Diseño personalizado cuatro caudalímetros en reguladores de gas y conectar a las cámaras de inducción 15 L estándar con tubos de PVC para permitir que el gas comprimido del oxígeno (O 2) tanques fluyan a las cámaras a través de un orificio de entrada. Ver Equipos y Materiales para más detalles sobre el diseño personalizado.
  2. Divida los ratones en 2 grupos: Repetitivo hipóxico Precondicionamiento (RHP) del Grupo, que reciben las exposiciones al 8% y el 11% de O 2, y el grupo de control, que reciben las exposiciones al 21% de O2 (aire ambiente) al mismo tiempo. Ver Tabla 1 para las variaciones en la frecuencia, intensidad (8 y 11% de O 2 o el 21% de O 2), y la duración (2 o 4 horas) de las exposiciones RHP.
  3. Retire la tapa del filtro de la parte superior de cada jaula y coloque la jaula, con botellas intactas de alimentos y agua, en las cámaras conectadas a sus respectivos O 2 tanques. Cierre y asegure la tapa de la cámara.
    1. Abrir la válvula de gas principal para los tanques y establecer el flujo inicial para cada cámara de inducción a 2 L por min (LPM) durante los primeros 5 minutos de exposición. Reducir la tasa de flujo de 1 LPM para el resto de la exposición.
    2. Al final de la exposición, para reducir el flujo a 0 LPM y cerrar la válvula de gas para los tanques.
    3. Abra las tapas de la cámara y vuelva a colocar la tapa superior del filtro en cada jaula. Coloque las jaulas en la vivienda estándar hasta la próxima exposición hipóxica.
  4. Rocíe cada cámara de inducción con NPD (Steris) o un desinfectante equivalente / desodorante después de cada uso.
  5. Expose tanto 21% y ratones RHP en el mismo momento del día durante el transcurso de dos semanas como se describe en la Tabla 1.

2. TransitorioLa oclusión de la arteria cerebral media (tMCAo)

  1. Ver discusión para más detalles sobre el tiempo de la carrera después de la exposición final de RHP.
  2. Preparar un lugar de trabajo de la cirugía aséptica. Limpie el lugar de trabajo alrededores con un 70% de etanol o un desinfectante equivalente y autoclave todos los instrumentos quirúrgicos.
    1. Coloque el instrumento láser Doppler Flujometría (LDF) para medir los cambios relativos en el flujo sanguíneo cerebral (FSC). Encienda la almohadilla térmica a 37 ° C. Encienda la incubadora a 34 ° C.
  3. Anestesiar ratones con una breve exposición a una mezcla de 4% de isoflurano / 70% NO 2/30% O 2 en una cámara de inducción pequeño. Confirme la anestesia adecuadas ligeramente pellizcar la pata. Si el ratón retira su pata, devolver el ratón a la cámara de inducción y continuar la exposición isoflurano.
  4. Retire los ratones de la cámara de la inducción anestésica e inserte rápidamente la nariz del ratón en el cono de la nariz. Abra el flujo de gas al cono de la nariz, cerrando el flujo a las Anestesia cámara de inducción.
    1. Sin cambiar el 70% NO mezcla de gas 2/30% O 2, fijar isoflurano al 1,8% como la dosis de mantenimiento para el resto del procedimiento. La respiración debe seguir siendo lento y regular a lo largo del procedimiento, pero si la respiración se vuelve rápida y superficial, aumentar la dosis de isoflurano. Dosis de mantenimiento puede variar entre la fabricación de equipos y animal usado en el experimento.
  5. El uso de un microshaver, afeitar el pelo en la región temporal entre la esquina del ojo y el oído, así como la línea media ventral del cuello. Retire el exceso de piel y aplicar lubricante ocular con un hisopo de algodón estéril para mantener las córneas se sequen durante el procedimiento. Limpie el área de la incisión con almohadillas con alcohol y hisopo providona-yodo con un hisopo de algodón estéril para mantener las condiciones de asepsia.
  6. Administrar analgésicos según las directrices quirúrgicas roedores.
  7. Hacer una incisión a través de la piel temporal entre el ojo y el oído.Exponer el músculo temporal. El uso de micro-tijeras quirúrgicas, cortar el ligamento músculo temporal en la cresta temporal dentro del área de estriación muscular blanco.
    1. Empuje suavemente la masa muscular lateralmente con unas pinzas para visualizar la arteria cerebral media (ACM) a través del cráneo. Tras la incisión del músculo temporal, el área puede llenarse de sangre. Utilizar suavemente un hisopo de algodón para detener cualquier sangrado potencial.
    2. Apunte la punta de la sonda a la zona LDF MCA. Registre el vaso escogido ya que esta zona varía entre los ratones.
    3. Mantenga el LDF en su lugar y al ras con el cráneo hasta que se lee un flujo estable de células de sangre roja y registrar este valor como el CBF línea de base. CBF basal Ideal en un Doppler Flujometría láser son> 600 flujo, pero esto puede variar con el fabricante. Si la línea de base CBF es <400 de flujo, es más probable de una vena, o una colocación incompleta de la sonda sobre el vaso diana la grabación de flujo.
  8. Después de establecer la línea de base CBF, repositien el ratón de manera que se expone el cuello. Apoye la cabeza y mantener el ratón bajo anestesia constante de la ojiva.
  9. Haga una incisión en la línea media ventral desde justo debajo de la mandíbula a la clavícula.
    1. Con unas pinzas, blunt diseccionar todo fascia superficial para exponer la arteria carótida común izquierda (CCA). Separar la CCA a partir de tejido conectivo y el nervio vago.
    2. Permanentemente ligar el CCA con una sutura de seda 6.0. Coloque la sutura ligadura proximal como sea posible para permitir espacio suficiente para ocluir la colocación de filamentos.
    3. Loop y sin apretar atar un segundo seda 6.0 sutura alrededor del CCA distal a la oclusión de sutura. Tenga cuidado de no obstruir la arteria como el filamento de oclusión posteriormente se pasa a través de la carótida.
    4. Utilice un 8 x 2 mm de luz micro serrafine pinza areterial para sujetar la CCA distal a la sutura de seda atada vagamente. Levante con cuidado el CCA con pinzas y hacer una pequeña incisión longitudinal, como proximal a la ligadura de sutura comoes posible con 3 Vannas mm.
    5. Enrosque un 12 mm de calibre 6,0 oclusión nylon filamento de silicio recubiertos través de la incisión para entrar en el lumen de la arteria, y luego adelantarlo unos pocos mm. Sin apretar apretar la segunda sutura de seda floja alrededor de la punta del filamento de oclusión para asegurar el flujo sanguíneo no empuja el filamento de la CCA y retire la pinza arterial.
    6. En la primera bifurcación de la CCA en la arteria carótida interna (ACI) y la arteria carótida externa (CEPA), pase el filamento de oclusión en la rama derecha de la primera bifurcación para entrar en el ICA.Advance el filamento de oclusión 9-10,5 mm pasado la segunda sutura de seda en la arteria carótida interna izquierda (ACI).
    7. Poco después de entrar en el ICA, avanzar en el filamento de oclusión en la rama izquierda en la segunda bifurcación entre el ICA y la arteria pterogopalantine (PPA). La visualización de la PPA es poco probable por lo que procede hasta que sienta una resistencia leve con la colocación completa del filamento de oclusión.El levantamiento de la ACI con fórceps puede ayudar a que el filamento para enhebrar más fácilmente en la rama izquierda de la segunda birfurcation. Apriete la segunda sutura de seda.
    8. Ponga el ratón por lo que la incisión sobre el MCA es visible. Con el equipo LDF, confirme que la CBF se bloquea a través de lecturas LDF. Una oclusión exitosa es una reducción> 80% a partir de la línea de base CBF.
    9. Completamente apriete y de doble nudo de la segunda sutura de seda alrededor del filamento de oclusión cuando se alcanza la posición correcta. Si es necesario, empuje ligeramente en o sacar el filamento de oclusión para lograr criterios CBF para una oclusión éxito (por ejemplo, reducción> 80% del valor inicial CBF).
    10. Cierre la abertura del cuello y la cabeza con suturas de nylon 6.0.
  10. Coloque los ratones en la incubadora a 34 ° para la duración de la oclusión. La longitud recomendada de la oclusión es de 60 minutos, pero esto varía de edad, las diferencias de tensión dependiente de la anatomía vascular cerebral, el 25 y el grado de injury desea (leve, moderada, severa). Asegúrese de que los animales recuperen la conciencia dentro de minutos saliendo de la anestesia.
  11. Re-anestesiar a los animales con isoflurano, como se describe en el paso 2.3, 5 min antes del final del período de oclusión predefinida, abrir la incisión del cuero cabelludo y confirme que la perfusión MCA está todavía reduce utilizando lecturas LDF transcraneal. Si CBF no se reduce lo suficiente (por ejemplo, <20% CBF línea de base), la MCA ha reperfundido en algún momento durante la oclusión y el ratón debe ser excluido de la experimentación.
  12. Abra la línea media incisión en el cuello y sin apretar atar una tercera sutura de seda alrededor de la CCA, distal a la segunda sutura de seda, pero proximal a la bifurcación CCA para asegurar que la arteria carótida externa (CEPA) seguirá siendo viable después de retirar el filamento.
    1. Cortar o desatar el nudo que mantiene el filamento de oclusión (es decir, la sutura segundo seda) y retirar el filamento de oclusión lentamente. Una vez eliminado, cerrar rápidamente eltercera sutura de seda alrededor de la CCA para minimizar el reflujo de sangre desde el ICA. Doble nudo esta sutura y cerrar la incisión con suturas de nylon 6,0.
    2. Vuelva a colocar el ratón para cuantificar el nivel de CBF después de 5 minutos de la reperfusión. Reperfusión exitosa se define generalmente como CBF de> 50% de la línea de base CBF, pero, al igual que con el flujo de oclusión, los investigadores pueden establecer su propio criterio. Si los animales exhiben una CBF por debajo del 50% de su línea de base, es probable que el MCA es "permanente 'ocluida, y por lo tanto representa otro criterio de exclusión estudio.
    3. Cierre ambas incisiones con suturas de nylon 6.0. Proporcionar solución salina, anestésico (lidocaína) y antibióticos según las directrices de roedores. Sin embargo se han encontrado algunas pequeñas dosis de antibióticos (3 mg / kg de minociclina) ser siguiente golpe neuroprotector. 26
  13. Después de recuperar la conciencia en la incubadora calienta después de la cirugía, los ratones en un lugar, jaula estéril limpio. Proporcionar foo humedecidod o nutricionales de hidratación de gel suplementos dietéticos y una placa de Petri de agua como los animales se han restringido la movilidad después de un accidente cerebrovascular. Supervise de cerca los animales durante la recuperación para el dolor post-quirúrgico excesivo y la muerte.

3. Evans Blue (EB) Inyección

  1. Inyectar EB 22 horas después de la reperfusión y deben circular en el torrente sanguíneo durante 2 horas antes del sacrificio y la tinción TTC.
  2. Hacer una solución de EB para inyección (2% en solución salina EB) y mezclar suavemente a temperatura ambiente. Filtrar la solución a través de papel de filtro o empujar a través de un filtro de 0,2 micras unido a una pequeña jeringa para eliminar sin disolver EB y almacenar a temperatura ambiente.
  3. Preparar la cantidad de EB necesaria para la inyección (4 ml / kg de peso corporal) Dibuja la cantidad deseada de colorante en una jeringa de insulina 0.3 cc con una aguja de calibre 29 y asegúrese de que la solución esté a temperatura ambiente
    1. Restringir ratón usando inmovilización fondo plano. Mantenga la cola para que la vena lateral es uppermost. Venas laterales están situadas a ambos lados de la línea central de la cola. Sostenga la punta de la cola para mantener el ratón constante para inyección.
    2. Inserte la aguja en la vena de aproximadamente 3,5 mm, con cuidado de no perforar la vena. Confirme que la aguja está en la vena dibujando de nuevo en la jeringa y en busca de rastros de sangre.
    3. Inyectar todo del colorante en el transcurso de 1 min. Si la solución va en la vena debe ser mínima resistencia como se aplica presión a la jeringa. Confirme la administración venosa sistémica exitosa de EB por un cambio de color inmediata en la cola, extremidades y ojos del ratón.
    4. Retire la aguja de la cola y suavemente aplique presión con una gasa limpia para detener el sangrado.
  4. Comience momento cuando la piel del ratón se vuelve azul. Deje que el EB circule durante 2 horas para penetrar la acreditación debilitado.

4. 2,3,5- trifeniltetrazolio Cloruro (TTC) de tinción

  1. Perfusión y tinción TTC debe ocurrir 24 horas después de la reperfusión.
  2. Preparar una solución TTC 2% antes de la hora designada de sacrificio. Añadir 10 g de polvo de TTC a 500 ml de 0,01 M tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4. Solución de calor a 37 ° C en baño de agua para facilitar la solubilización de la TTC. PRECAUCIÓN: Polvo TTC y solución son una piel, pulmón y irritante para los ojos. Llevar equipo de protección personal adecuado al manipular estos materiales.
    1. Una vez que el polvo se haya disuelto por completo, transferir inmediatamente a una botella, cubierta en papel de aluminio, y se almacena a 4 ° C. TTC y el tejido teñido con TTC son sensibles a la luz.
  3. A las 24 h después de tMCAo y 2 horas después de la administración EB, sacrificar al animal con una sobredosis de isoflurano en una cámara de inducción pequeña. La perfusión debe comenzar inmediatamente después sacricice el fin de minimizar la autólisis que se inicia en ausencia de oxígeno después de la muerte.
  4. Asegurar el animal rápidamenteen una plataforma de espuma de poliestireno con antebrazos cubrió a través de las patas. Cortar una incisión lateral a través de la pared abdominal de la línea media justo debajo de la caja torácica. Corte cuidadosamente a través del diafragma para exponer el corazón.
    1. Arrancar la bomba de perfusión a 5 ml / min velocidad de flujo con una jeringa de 60 cc llena de hielo frío PBS 0,01 M y conectado a una aguja de infusión de calibre 27 con alas. Coloque la punta de la aguja alrededor de 0,5 cm en el ventrículo izquierdo del corazón y cortar la aurícula derecha. Progresivamente sangre venosa diluido debe fluir fuera de la aurícula durante la perfusión hasta que aparezca sangre venosa incoloro. Transcardially perfundir 30 ml 0,01 M tampón fosfato salino (PBS) a través del corazón.
  5. Añadir 5 ml de solución de TTC en botellas de centelleo transparentes 20.
  6. Inmediatamente después de la perfusión, decapitar a los animales y diseccionar los cerebros utilizando unas tijeras pequeñas y una espátula si es necesario. Examine los cerebros de excluir animales que se sometieron hemorrha subaracnoideage en el Círculo de Willis, secundaria a la colocación de sutura. Compruebe que el hemisferio contralateral a la oclusión MCA aparece pálida, sin notable fuga de EB o edema.
  7. Vierta PBS en una matriz cerebro acrílico diseñado para hacer 1,0 mm de espesor secciones coronales de cerebro de ratón. Coloque el cerebro, cara dorsal hacia arriba, en la matriz y de inmediato vierta PBS sobre el cerebro. Mantener el cerebro húmedo.
    1. Eliminar los bulbos olfatorios mediante la inserción de un acero inoxidable de 0,21 mm de espesor cuchilla en la segunda ranura desde el lado rostral de la matriz.
    2. Retire el cerebelo mediante la inserción de una cuchilla en la cuarta ranura desde el lado caudal de la matriz.
    3. Inserte una cuchilla en la ranura medio de las ranuras restantes en la matriz. Insertar las cuchillas restantes, de manera uniforme bisectriz del tejido restante para garantizar la distribución más uniforme de tejido durante el corte en lonchas.
    4. Una vez que se han insertado todas las cuchillas, agregue 1 a 2 gotas de PBS al cerebro para humedecerlo.
    5. Retire la hojas uno a la vez de la matriz a partir de la región rostral. Mantenga los primeros 7 rebanadas de análisis TTC después tMCAo. Use una pequeña espátula para transferir cuidadosamente las rodajas de la hoja al vial lleno-TTC.
  8. Después de todas las secciones están en el vial, tapar y colocar en un baño de agua tibia hasta que las secciones se vuelven de color rosa. Gire suavemente la botella en el baño si es necesario para evitar la sección de solapamiento, lo que podría conducir a la tinción desigual. Entonces disponer de la TTC y se vierte una solución de paraformaldehído al 4% en el vial para cubrir las secciones de cerebro para terminar la reacción química TTC.
  9. Inmediatamente organizar las secciones en un lugar limpio 1 "x 3" portaobjetos de vidrio y orientar las secciones de rostral a caudal.
    1. Cuando las secciones se disponen en la diapositiva, escanear la diapositiva utilizando un escáner estándar. Configure la resolución en un mínimo de 600 dpi para el análisis de imágenes. Asegúrese de incluir el nombre del animal y una regla métrica en la imagen escaneada.
    2. Dé la vuelta a la diapositivay escanear la parte de atrás para asegurar que todos los datos se recogen.

5. La cuantificación del volumen del infarto

  1. Cuantificar el volumen del infarto mediante el uso de un software de análisis de imagen estándar (por ejemplo, ImageJ).
  2. Escaneado de imágenes a alta resolución (por ejemplo, 600 dpi) para un análisis adecuado. Recorte de imágenes. Estandarizar la escala para todas las imágenes utilizando el regla métrica incluido en la imagen escaneada.
  3. Calcular el volumen total del hemisferio contralateral usando la siguiente fórmula. Repita esta fórmula para calcular el volumen total del hemisferio ipsilateral.
    Suma de hemisferio contralateral total de cada rebanada de espesor x rebanada
  4. Calcular el volumen del infarto indirecta. . Control para el edema ipsilateral de un accidente cerebrovascular mediante el, hemisferio contralateral sano como control 27 Utilice la siguiente fórmula para calcular el volumen del infarto indirecta:
    Volumen total de hemisferio contralateral -
    (Volum totale del hemisferio ipsilateral -Promedio volumen de 3 mediciones de infarto)

6. barrera hematoencefálica Cuantificación (BBB) ​​Integridad

  1. Para prepararse para EB cuantificación, primero pesan 2,5 pulgadas pesa barcos. Anotar el peso y la etiqueta de dos sopesar barcos para cada animal: una para el hemisferio ipsilateral y uno para el hemisferio contralateral.
  2. Después de escanear las secciones teñidas con TTC, dividir en dos cada sección con una cuchilla de afeitar desechable en hemisferios ipsilateral y contralateral. Coloca los hemisferios ipsilaterales de las 7 secciones en un barco pesar y registrar el peso. Repita para el hemisferio contralateral.
  3. Transferir inmediatamente los barcos de peso a un conjunto horno por 56 ° C durante 48 horas.
  4. Pesar las secciones secas. Traslado ambos hemisferios en 1,5 ml tubos de microcentrífuga separados.
    1. Calcular la cantidad de formamida necesario para cada hemisferio (8 ml / g de tejido seco), y añadir a sus respectivos microcentrifugtubos e. La formamida es sensible a la luz y cubren todas las muestras de formamida tratados en papel desde este punto en adelante.
    2. Transferir los tubos de microcentrífuga a una incubadora a 56 ° C durante 48 hr otro.
  5. Después de la 48 horas, pipetear el sobrenadante azul en otro conjunto de tubos de microcentrífuga etiquetados. Empuje tejido a la parte inferior del tubo para maximizar el volumen de sobrenadante extraído. Mantenga los tubos de sobrenadante y disponer de todos los tejidos.
  6. Preparar diluciones seriadas exponenciales de EB en formamida para la curva estándar. Incluya 1 en blanco (sólo formamida) y luego 10 soluciones exponenciales de 0.125 ug / ml a 64 ug / ml de EB en formamida.
    1. Pipetear 300 l de las diluciones realizadas para la curva estándar en una placa de 96 pocillos. Pipetear 300 l del sobrenadante en los pozos correspondientes.
    2. Medir la absorbancia en un espectrofotómetro a 620 nm.
    3. Comparación de la curva estándar de las diluciones EB con el o absorbanciaf las muestras de sobrenadante. La densidad óptica es directamente proporcional a la integridad de la BBB.
    4. Suponga que la densidad óptica del hemisferio contralateral como fondo y el uso de la fórmula (ipsilateral contralateral) / contralateral para determinar el cambio veces. Para más detalles sobre el análisis estadístico ver Martin et al., 2010. 18

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Resultados

Este estudio incluyó a 25 ratones macho Swiss Webster que eran las 10 semanas de edad en el inicio de la asignación al azar en RHP (n = 10) o 21% de O 2 (n = 15) grupos. Dos semanas después de la exposición final RHP, se realizaron procedimientos quirúrgicos, con grupos cegados y contrapeso entre los días. Siguiendo tMCAo, 1 ratón murió durante la recuperación postoperatoria y 1 ratón fue excluido del estudio, ya que no cumplía con el criterio CBF reperfusión. Ambos ratones fueron excluidos del gr...

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Discusión

Una sola exposición a la hipoxia sistémica (es decir, 2 hr de 11% O 2) en ratones protege "transitoriamente" el cerebro de tMCAo, 29 es decir, la respuesta epigenética al desafío de preacondicionamiento hipóxica es de corta duración, y el fenotipo de la línea de base se restablece dentro de día. Presentaciones repetitivo del estímulo hipóxico preacondicionamiento se extienden dramáticamente la duración del fenotipo neuroprotector. 6 Muchos estudios han demo...

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

Special thanks to the Gidday lab for their work in developing the RHP protocol, as well as the Neuro-Models Facility (UTSW) for their assistance in the tMCAo surgeries. This work was supported by grants from the American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS), and The Spastic Paralysis Research Foundation of the Illinois-Eastern Iowa District of Kiwanis International (JMG).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Flowmeters, regulatorsVetEquip, IncSpecialty orderFour flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench.
21% O2 tankAirGasOX USP200
11% O2 tankAirGasSpecialty order
8% O2 tank AirGasSpecialty order
15 L induction chambersVetEquip941454
Moor Laber Dopper Flow Moor Instruments moorVMS-LDF1-HP0.8 mm diameter probe 
High Intensity Illuminator NikonNI-150
Zoom Stereo Microscope NIkonSMZ800Other surgical microscopes may be used. 
Kent Scientific Right Temperature CODAKent Scientific CorporationDiscontinuedRecommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT).
Hovabator IncubatorStromberg's2362-EOur model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. 
V010 Anesthesia system VetEquip901807Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters
250 ml isoflurane Butler ScheinNDC-11695
D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer Andis #23905Replacement blades are available from Andis (#23995)
Betadine Fisher Scientific19-898-867 
Q-tipsMultiple sellers Catalog number not available 
Gauze PadsFisher Scientific67622
Surgical drapeFisher ScientificGM300 
Silk Sutures Look/Div Surgical SpecialtiesSP115
Nylon SuturesLook/Div Surgical SpecialtiesSP185
Durmont #5 forceps (2) Fine Science Tools 11251-35Angled 45°
Surgical ScissorsFine Science Tools 14028-10
3 mm VannasKent Scientific CorporationINS600177Straight blade
Hartman Hemostats Fine Scientific Tools13002-10
Occluding filamentsWashington UniversitySpecialty orderFilaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. 
Evans BlueSigma AldritchE2129-10G
Filter Paper Sigma AldritchWHA1001150150 mm, circles, Grade 1 
Weigh BoatsFisher Scientific02-202-1012.5" diameter
0.9% Sodium Chloride Injection USP Baxter Pharmaceutics 2B1321
0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needleBecton Dickinson Labware309301
Flat bottom restrainer Braintree Scientific FB M2.0" diameter
TTCSigmaT8877
10x PBS, pH 7.4Fisher ScientificBP399-20
Water BathMultiple sellers Catalog number not available Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath.
Styrofoam boardMultiple sellers Catalog number not available 
Large Syringe KitPumpSystems IncP-SYRKIT-LG
Perfusion PumpPumpSystems IncNE-300 
60 cc syringeFisher ScientificNC9203256
27 gauge winged infusion setKawasumi Laboratories, IncD3K1-25G 1
20 ml scintillation vialFisher Scientific50-367-126
Stainless steel spatulaFisher Scientific14-373-25A
Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronalCellPoint Scientific Catalog number not available 
0.21 mm stainless steel blades, 25 pkCellPoint Scientific Catalog number not available Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative.
4% paraformaldehydeSanta Cruz Biotechnology SC-281692
Superfrost microscope slides Fisher Scientific12-550-15
HP Scanjet G4050Multiple sellers Catalog number not available Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol.
ImageJ National Institute of HealthCatalog number not available 
Analytical BalanceMettler Toledo XSE 205U
Precision Compact Oven  Thermo Scientific PR305225M
1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs)Denville Scientific C2170
FormamideFisher ScientificBP228-100
96-well platesFisher Scientific07-200-9
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Catalog number not available 

Referencias

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