El uso de alta resolución Termografía Infrarroja (HRIT) para el Estudio de Hielo La nucleación y Hielo Propagación de Plantas

Resumen

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

Resumen

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

Introducción

Congelación temperaturas que se producen cuando las plantas están creciendo activamente puede ser letal, particularmente si la planta tiene tolerancia a la congelación poco o no. Tales heladas suelen tener efectos devastadores en la producción agrícola y también pueden desempeñar un papel importante en la conformación de la estructura de la comunidad en las poblaciones naturales de las plantas, sobre todo en los Alpes, los ecosistemas sub-árticas y árticas ^1-6. Los episodios de fuertes heladas de primavera han tenido un gran impacto en la producción de fruta en los EE.UU. y América del Sur en los últimos años ^7-9 y se han agravado por la aparición temprana de clima cálido, seguido por las bajas temperaturas más típicas medias. El clima cálido temprana induce brotes de romper, activando el crecimiento de nuevos brotes, hojas y flores de todos los cuales tienen muy poca o ninguna tolerancia a las heladas ^1,3,10-12. Tales patrones climáticos erráticos se han notificado a ser un reflejo directo del cambio climático en curso y se espera que sea un patrón de tiempo común para los foresfuturo eeable ^13. Los esfuerzos para proporcionar técnicas de gestión económicos, eficaces y respetuosas del medio ambiente o agroquímicos que pueden proporcionar una mayor tolerancia a las heladas han tenido un éxito limitado por una serie de razones, pero esto puede ser parcialmente atribuido a la naturaleza compleja de la tolerancia a la congelación y congelación mecanismos de evasión en las plantas. ¹⁴

Los mecanismos adaptativos asociados con la supervivencia heladas en las plantas se han dividido tradicionalmente en dos categorías, tolerancia a la congelación y la congelación de evitación. La primera categoría se asocia con mecanismos bioquímicos regulados por un conjunto específico de genes que permiten a las plantas para tolerar las tensiones asociadas con la presencia y el efecto deshidratante de hielo en sus tejidos. Si bien esta última categoría es normalmente, pero no exclusivamente, asociado con aspectos estructurales de una planta que determinan si, cuándo, y dónde se forma hielo en una planta ^14. A pesar de la prevalencia de la evitación de la congelación como un anunciomecanismo aptive, poca investigación se ha dedicado en los últimos tiempos a la comprensión de los mecanismos y regulación de evitar la congelación subyacentes. Se remite al lector a una revisión reciente ¹⁵ para mayores detalles sobre este tema.

Mientras que la formación de hielo a temperaturas bajas puede parecer un proceso simple, muchos factores contribuyen a la determinación de la temperatura a la que el hielo se nuclea en los tejidos vegetales y cómo se propaga dentro de la planta. Parámetros como la presencia de extrínseca e intrínseca nucleadores de hielo, frente a eventos de nucleación homogénea heterogéneos, térmica-histéresis (anticongelante) proteínas, la presencia de azúcares específicos y otros osmolitos, y una serie de aspectos estructurales de la planta todos pueden jugar un importante papel en el proceso de congelación en las plantas. Colectivamente, estos parámetros influyen en la temperatura a la que una planta se congela, donde se inicia hielo y cómo crece. También pueden afectar a la morfología de los cristales de hielo resultantes.Varios métodos han sido utilizados para estudiar el proceso de congelación en las plantas bajo condiciones de laboratorio, incluyendo espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) ^16, imágenes de resonancia magnética (MRI) ^17, crio-microscopía ^18-19, y microscopía electrónica de barrido de baja temperatura (LTSEM ). ²⁰ Congelación de plantas enteras en la configuración de laboratorio y de campo, sin embargo, ha sido principalmente controlarse con termopares. El uso de termopares para estudiar la congelación se basa en la liberación de calor (entalpía de fusión) cuando el agua se somete a una transición de fase de líquido a un sólido. La congelación se registra entonces como un evento exotérmico. ^21-23 A pesar de que los termopares son el método típico de elección en el estudio de la congelación en plantas, su uso tiene muchas limitaciones que limitan la cantidad de información obtenida durante un suceso de congelación. Por ejemplo, con termopares es difícil casi imposible determinar donde se inicia de hielo en las plantas, la forma en que se propaga,si se propaga a una velocidad constante, y si algunos tejidos permanecen libres de hielo.

Los avances en la termografía infrarroja de alta resolución (HRIT) ^24-27, sin embargo, han aumentado de manera significativa la capacidad de obtener información sobre el proceso de congelación en plantas enteras, especialmente cuando se utiliza en un modo de imagen diferencial. ^28-33 En el presente informe, describen el uso de esta tecnología para estudiar diversos aspectos del proceso de congelación y diversos parámetros que afectan a dónde y en qué hielo y la temperatura se inicia en las plantas. Un protocolo será presentado que demostrar la capacidad de la bacteria de hielo-nucleación-activo (INA), Pseudomonas syringae (Cit-7) para actuar como un nucleador extrínseca iniciar la congelación en una planta herbácea a una alta temperatura, a temperaturas bajo cero.

De alta resolución de la cámara de infrarrojos

El protocolo y ejemplos documentados en este informe utilizan una alta resolución de infrarrojosradiómetro de vídeo. El radiómetro (Figura 1) suministra una combinación de imágenes espectro de infrarrojos y visibles y datos de temperatura. La respuesta espectral de la cámara está en el rango de 7,5 a 13,5 micras y proporciona una resolución de 640 x 480 pixel. Imágenes espectro visible generados por la cámara puede ser fusionado con IR-imágenes en tiempo real, lo que facilita la interpretación de imágenes térmicas, complejos incorporado. Una gama de lentes para la cámara se puede utilizar para hacer primeros planos y observaciones microscópicas. La cámara se puede utilizar en un modo autónomo, o interconectado y controlado con un ordenador portátil usando software propietario. El software se puede utilizar para obtener una variedad de datos térmicos embebidos en los vídeos grabados. Es importante observar que una amplia variedad de radiómetros infrarrojos están disponibles comercialmente. Por lo tanto, es esencial que el investigador discutir su aplicación prevista con un ingeniero de producto bien informado y que el investigador probar la capacidad de cualquier específic radiómetro para proporcionar la información necesaria. El radiómetro de imágenes utilizado en el protocolo descrito se coloca en una caja de acrílico (Figura 2) con aislamiento de espuma de poliestireno i on el fin de disuadir a la exposición a la condensación durante los protocolos de calentamiento y enfriamiento. Esta protección no es necesaria para todas las cámaras o aplicaciones.

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Protocolo

1. Preparación de materiales vegetales

1. Utilice cualquiera de las hojas o plantas enteras de material de la asignatura planta (Hosta spp. O Phaseolus vulgaris).

2. Preparación de las soluciones de agua que contienen hielo nucleación activos (INA) Bacterias

1. Cultura la bacteria INA, Pseudomonas syringae (Strain Cit-7) en placas de Petri a 25 ° C en Pseudomonas Agar F preparada con 10 g / L de 100% de glicerol por la dirección del fabricante.
2. Después de culturas han crecido lo suficiente, a 4 ° C hasta que sea necesario, pero mantener a 4 ° C durante dos días previos para asegurar un alto nivel de actividad de nucleación de hielo.
3. Raspar las bacterias de una sola placa de la superficie del agar con un plástico, desechable o reutilizable espátula de metal en el momento de uso y lugar en 10-15 ml de agua desionizada en una cubeta desechable de 25 ml. La concentración debe estar en el rango de 1 × 10 ⁷ hasta 1 x 10 ^{9 ·} Ml ^-1. La solución aparecerá nublado. No hay necesidad de confirmar la concentración usando un hemocitómetro o espectrofotómetro, como concentración sólo necesita ser aproximada.
4. Vórtex con la cubeta durante un mínimo de 10 seg para distribuir las bacterias.
   Nota: La concentración específica de la mezcla de INA resultante no es importante y el protocolo descrito proporcionará más de un nivel adecuado de actividad de nucleación de hielo. Esta mezcla de bacterias INA y el agua se utilizará más adelante en los experimentos de nucleación.

3. Configuración de un experimento de congelación

1. Coloque la cámara de infrarrojos de alta resolución (SC-660) dentro de la caja protectora de acrílico para que los proyectos lente a través de la abertura en el frente de la caja y los cables que conectan la cámara a una salida del ordenador portátil o dispositivo de grabación a través de la abertura posterior de la caja . Asegure la tapa de la caja y colocar la caja dentro de la cámara ambiental o congelador en un lugar que lo hará todoflujo del material objeto planta para ser visto.
   1. Proporcionar un fondo oscuro en todo el material de la planta por el forro las paredes de la cámara con papel de construcción negro para evitar la interferencia de la energía infrarroja reflejada.
   2. Coloque la cámara con iluminación LED para minimizar el calentamiento de la fuente de luz cuando se requiere la grabación de imágenes en longitudes de onda visibles. Sólo un mínimo de iluminación, tal como una luz armario funciona con batería u otro dispositivo LED pequeña, se requiere para que las plantas sean visibles por la cámara.
      1. Una vez que se toman imágenes visibles de la materia objeto de la planta, apagar la iluminación LED. Distribuya todas las conexiones cableadas externos (conexión FireWire a la computadora, cable de alimentación, etc.) a la cámara a través de un puerto u otra abertura en la cámara.
   3. Rellene cualquier espacio extra en el puerto o abertura con material aislante de espuma para evitar o reducir los gradientes de temperatura dentro de la cámara. Ajuste la temperatura inicial de la cámara en 1 ° C.
2. Alinear las plantas o partes de plantas de manera que el material de la planta se encuentra en el campo de visión de la cámara y el material vegetal es visible en la pantalla de visualización remota o dentro del software elegido.
3. Permitir que las plantas se equilibre a 1 ° C durante 30 min a 1 hr, dependiendo del tamaño del material de planta, antes de iniciar un experimento de congelación controlada. Esto asegura que la temperatura de la planta no se quedará atrás temperatura del aire en muchos grados una vez que se inicia el experimento de congelación. La equilibración se logra cuando la temperatura del material vegetal está dentro de 0,5 ° C de temperatura del aire.
   1. Coloque una capa de aislamiento de espuma de poliestireno en la parte superior del suelo de las plantas en macetas si se utilizan las plantas en maceta. Una vez que las plantas hayan equilibrado, iniciar el enfriamiento de la cámara.
      Nota: La capa de aislamiento sobre la superficie del suelo de la olla reduce la cantidad de pérdida de calor continuación de la olla para el aire que rodea la planta, y evita que las raíces de freezing, ya que esto no sería típicamente ocurrir durante un evento de helada en la naturaleza debido al depósito masivo de calor residual presente en el suelo.
4. Establezca los parámetros de la cámara que desee (paleta de colores, rango de temperatura, áreas específicas de interés, etc.), como se comenta en 3.4.1-3.4.4.
   1. Seleccione la paleta del arco iris para mostrar las variaciones de temperatura mientras se visualiza la imagen en directo.
   2. Ajuste el intervalo de temperatura de 5 ° C ajustando la barra de temperatura situado justo debajo de la imagen en el software.
   3. Elija la escala lineal (algoritmo) para convertir los datos infrarrojos en la imagen en color falso como se define en la paleta seleccionada (arco iris) y establecer el rango de temperatura de 5 ° C y para realizar un seguimiento de forma automática basándose en la imagen. Alternativamente, ajuste el rango establecido manualmente mientras que la realización del experimento.
      1. Utilice la temperatura de un punto específico o una temperatura promedio dentro del área definida de interés proporcionada por el softwson. Recuperar los datos de temperatura de todos los píxeles de la secuencia de vídeo grabado o de la información incrustada en el archivo de imagen. La figura 3 muestra una captura de pantalla típico desde dentro software ResearchIR.
   4. Colocar un cursor en una ubicación en el tejido de la planta que representa un punto específico de interés. Definir el área de interés como puntos (1 -3 píxeles de tamaño), cajas, líneas, elipses o círculos. Múltiples combinaciones de puntos o formas se pueden situar sobre la imagen.
5. Grabación de una secuencia de vídeo
   1. Ajuste la cámara al grabar a 60 Hz y para la grabación se detenga manualmente.
   2. Indique la ubicación en el ordenador o disco duro externo donde se colocará el archivo de vídeo grabado.
   3. Comenzar la grabación.
      Nota: Grabación en un disco duro externo es muy recomendable ya que se generarán grandes archivos de video. Archivos de vídeo grabados se pueden editar más tarde para contener sólo la parte que contiene la neinformación nece-. Esto reducirá en gran medida el tamaño del archivo.
   4. Baje la temperatura de la cámara de forma incremental en un 0,5 -1,0 ° C. Espere hasta que la temperatura de la planta se equilibra con la temperatura del aire y luego bajar la temperatura de nuevo por 0,5 a 1,0 ° C. Dependiendo de la masa del tejido de la planta siendo observado y su morfología, de equilibrio puede tomar de 10 a 15 min. Por lo tanto, dando una tasa de enfriamiento de aproximadamente 4 ° C / hr.
   5. Continúe de esta manera hasta que la planta se congela y observaciones se han completado. Finalice la grabación cuando el proceso de congelación se ha completado.
      Nota: El tejido de la planta se ha equilibrado con la temperatura del aire cuando el material vegetal y el fondo son del mismo color, ya que son a la misma temperatura. Puesto que la temperatura de fondo y la temperatura del tejido de la planta son los mismos, puede ser difícil de visualizar el material vegetal hasta que de nuevo más baja la temperatura y no hay diferencial de temperatura entre el tejido de la planta y unatemperatura IR.

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Resultados

Actividad Hielo-nucleación del hielo + bacteria, Pseudomonas syringae (cepa Cit-7)

Una gota 10 l de agua y 10 l de agua que contienen P. syringae (Cit-7) se colocaron en la superficie abaxial de una hoja de Hosta (Hosta spp.) (Figura 4). Como se ilustra, la gota de agua que contiene las bacterias INA congeló primero y fue responsable de la inducción de la hoja para congelar, mientras que la gota de agua sobre la superficie de la hoja se mantuvo ...

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Discusión

El agua tiene la capacidad de superenfriar a temperaturas muy por debajo de 0 ° C y la temperatura a la que el agua se congele puede ser bastante variable. ³⁶ El límite de temperatura para el subenfriamiento del agua pura es de aproximadamente -40 ° C y se define como el punto de nucleación homogénea. Cuando el agua se congela a temperaturas más cálidas a -40 ° C, se produce por la presencia de nucleantes heterogéneos que permiten a los pequeños embriones de hielo para formar y que constituirán un ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infrared Camera	FLIR	SC-660	Many models available depending on application
Infrared Analytical Software	FLIR	ResearchIR 4.10.2.5	$3,500
Pseudomonas syringae (strain Cit-7)			Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California  Berkeley icelab@berkeley.edu
Pseudomonas Agar F	Fisher Scientific	DF0448-17-1