La inmunotinción para visualizar murino entérica Desarrollo del Sistema Nervioso

Resumen

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Resumen

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Introducción

Un funcionamiento del sistema nervioso entérico (ENS), que controla la motilidad, la absorción de nutrientes, y el flujo sanguíneo local, es esencial para la vida ^1. El ENS está formado por células de la cresta neural (NCC) que proliferan, migran y colonizar el intestino, donde se diferencian en neuronas de los ganglios que contiene y células gliales. Enfermedad de Hirschsprung (herencia mendeliana HSCR, en línea en el hombre), un trastorno congénito multigeneic con una incidencia de 1 en 4.000 nacidos vivos, se puede considerar la enfermedad prototípico para el estudio de la formación de ENS interrumpido. En HSCR, NCC dejan de migrar y colonizar a longitudes variables del intestino posterior distal ^2. Además, otra gastrointestinal común (GI) defectos en el desarrollo de la población pediátrica, como malformaciones anorrectales, atresias intestinales y trastornos de la motilidad se asocian con alteraciones en las funciones básicas de la ENS, y es probable que, asociados con cambios anatómicos subestimados sutiles y cambios funcionales enel ^3-6 ENS. Por lo tanto, las técnicas que nos permitan comprender los determinantes del desarrollo de la formación ENS pueden arrojar luz sobre la patogénesis y el tratamiento potencial de trastornos del tracto GI pediátricos.

A raíz de la migración y colonización, NCC se diferencia en neuronas con marcadores específicos para su fenotipo neurotransmisor. Las neuronas colinérgicas representan aproximadamente el 60% de las neuronas entéricas ^7, y pueden ser detectados por tinción para la colina acetiltransferasa (ChAT), la enzima sintetizadora de la acetilcolina del neurotransmisor excitatorio. Históricamente, los intentos de visualizar las neuronas colinérgicas fueron confundidos por los diferentes antígenos especificidad de anticuerpos dirigidos contra el sistema nervioso central (SNC) Chat contra el sistema nervioso periférico (SNP) Chat ^8-10. Sin embargo, los anticuerpos dirigidos contra ChAT placentaria reconocer tanto ChAT central y periférico ^11-13, y tenemos técnicas recientemente descritos que permiten visualización de las neuronas colinérgicas ENS con alta sensibilidad anteriormente en el desarrollo que se ha logrado con líneas reportero ChAT ^14.

A continuación, presentamos una técnica de disección, la fijación y la inmunotinción de la murino tubo digestivo embrionario visualizar ENS expresión neurotransmisor en las neuronas. Para estos estudios, hemos utilizado ratones chat-Cre se aparearon con R26R: animales tdTomato para producir chat-Cre; R26R:: floxSTOP ratones tdTomato (definidos como Chat-Cre tdTomato todo el manuscrito): floxSTOP. Estos animales fueron entonces aparearon con ratones reportero GFP-ChAT homocigotos, para obtener ratones que expresan ambos reporteros fluorescentes que detectan la expresión de ChAT ^14. Estos dos animales reportero están en un fondo C57BL / 6J y están disponibles comercialmente (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

Protocolo

La Universidad de Wisconsin Cuidado de Animales y el empleo Comisión aprobó todos los procedimientos.

1. Preparación de soluciones

1. Utilice fosfato 1x solución salina tamponada (PBS) como tampón de disección y solución de lavado.
2. Preparar 30% de sacarosa pesando 30 g de sacarosa y el lugar en una botella. Añadir 99 ml de 1x PBS y añadir 1 ml 10% de azida de sodio. Mezclar bien hasta que toda la sacarosa se disuelve. Almacenar a 4 ° C hasta que sea necesario.
3. Preparar la solución de bloqueo mediante la mezcla de 1x PBS, 3% de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,1% de Triton-X-100. Mezclar bien y guardar en la nevera hasta que se necesite.
4. Preparar 8% de paraformaldehído solución (PFA) en PBS 1x pesando la cantidad apropiada de PFA en PBS 1x y luego se incuba a 65 ° C hasta que se disuelva completamente. Almacenar en alícuotas de 25 ml en el congelador a -20ºC hasta que se necesite. Diluir hasta 4% PFA en PBS 1x en el día de uso.

2. Embriones y Gut Dissection

1. De conformidad con el animal de Atención Institucional y el empleo Comisión protocolos aprobados, la eutanasia del ratón embarazada cronometrado y transferir al útero en un 60 mm placa de Petri que contiene hielo frío PBS 1x.
2. Bajo un microscopio de disección con tijeras afiladas, corte la pared uterina abierta para exponer los embriones. Retire los embriones del útero y el lugar en una limpia de 60 mm placa de Petri que contiene hielo frío PBS 1x.
3. La eutanasia a cada embrión por decapitación en 1x PBS helado. Si está utilizando ratones transgénicos que contienen proteínas fluorescentes, con iluminación de fluorescencia, identificar los embriones transgénicos positivos.
4. Diseccionar el tracto GI de cada embrión utilizando un microscopio de disección. Usando unas pinzas finas, orientar el embrión de tal manera que el lado izquierdo está mirando hacia arriba y el lado derecho está en contra de la parte inferior de la placa de Petri. Retire la pared superior del cuerpo del embrión para exponer los órganos internos. Inserte pinzas finas entre la pared dorsal del cuerpo y los órganos internos. CrOSS los fórceps uno contra el otro en una acción de corte de tijera para eliminar los órganos internos del embrión.
5. Además sub-diseccionar el tracto GI lejos de los órganos circundantes y luego colocar cada tracto gastrointestinal en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contiene helada 1x PBS.

3. Fijación de GI Tracts

1. Enjuague cada tracto GI 3 veces con 1x PBS helado y luego vuelva a colocar con 4% PFA. Fijar los tractos gastrointestinales en los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en una plataforma oscilante a temperatura ambiente durante 1,5 hr. Enjuagar los tractos GI 3 veces durante 5 min a RT y luego durante 1 hr en la plataforma oscilante. En esta etapa, almacenar los tractos GI a 4 ° C en 30% de sacarosa en 1x PBS que contiene 0,1% de azida de sodio hasta que se necesite.
   NOTA: Como alternativa, almacenar los embriones en el 30% de sacarosa hasta por un año sin ningún efecto sobre la integridad de los tejidos. Almacenamiento de las muestras en 30% de sacarosa permite el procesamiento posterior de las muestras o bien para inmunotinción o en PTU para su crio-SECCIng. Como alternativa, proceda con el protocolo de inmunotinción se detalla a continuación.

4. Protocolo Inmunoticción

1. Si las muestras se han almacenado en el 30% de sacarosa, enjuagarlos 3 veces durante 20 minutos en 1x PBS en una plataforma oscilante.
2. Coloque los tractos GI en solución de bloqueo en una plataforma oscilante durante 1 hora a RT.
3. Eliminar la solución de bloqueo e incubar los tractos GI con la cantidad apropiada de anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo, ya sea para 4 horas a RT o O / N a 4 ° C en una plataforma oscilante. Utilice 1: 1000 dilución de anticuerpo humano anti-Hu (suero obtenido de paciente), 1: 1000 dilución de pollo anti-proteína verde fluorescente (GFP) de anticuerpos y dilución 1: 100 de anticuerpo de cabra anti-chat.
   NOTA: Utilizamos un anticuerpo anti-Hu humano que fue obtenida localmente a partir de un paciente, sin embargo, los anticuerpos anti-Hu están disponibles comercialmente, por ejemplo, de ratón anti-Hu, (uso en dilución 1: 500).
4. Enjuague los tractos gastrointestinales en 1x PBS3 veces durante 5 min y luego durante 1 hora a RT en una plataforma oscilante.
5. Vuelva a colocar la PBS 1x con anticuerpos secundarios diluidos 1: 500 en solución de bloqueo en una plataforma oscilante, ya sea para 4 horas a RT o O / N a 4 ° C. Utilice burro tinte amina reactiva antihumano como DyLight, Cy2 anti-pollo burro y burro anti-cabra Cy5. Si se utiliza el ratón anti-Hu luego use una dilución 1: 500 de burro anti-ratón-amina reactiva de colorante 405.
   NOTA: La intensidad de la GFP y la expresión endógena tdTomato y la claridad de la inmunotinción aumento con la edad de desarrollo. Por lo general inmunotinción tripas embrionarias individualmente en tubos de 0,2 ml con 150 l de solución de tinción con el fin de reducir el volumen de anticuerpo utilizado y también para asegurar la tinción eficiente del tejido.
6. Enjuagar los tractos GI en 1X PBS 3 veces durante 5 min y luego durante 1 hora a RT en una plataforma oscilante.
7. Coloque unas pocas gotas de medio de montaje de fluorescencia con DAPI en un portaobjetos de vidrio. Sumerja los tra GIct en el medio de montaje de fluorescencia y añadir una cubierta de vidrio directamente en la parte superior del tejido. El medio de montaje -G fluorescencia es un compuesto soluble en agua que proporciona un sello semi-permanente.
   NOTA: El uso medio de montaje de fluorescencia como Vectashield que es un glicerol basado medio que previene la decoloración y fotoblanqueo de anticuerpos de montaje. Ambos productos permiten a los tejidos para ser almacenados por largos períodos de tiempo a 4 ° C.
8. Capturar imágenes de cada uno de fluoróforo utilizando un microscopio confocal. Utilice longitudes de onda de excitación de los fluoróforos y filtros empleados se presentan en la Tabla 3.
9. Realizar análisis de imagen asistido por ordenador usando el software apropiado dependiendo del tipo de confocal utilizado para capturar imágenes.

Resultados

Hemos descrito previamente la generación de ratones que expresan tanto las buenas prácticas agrarias y tdTomato reporteros fluorescentes que detectan la expresión de ChAT ^14. En pocas palabras, los ratones chat-Cre se aparearon con R26R: floxSTOP: animales tdTomato para producir chat-Cre; R26R: ratones tdTomato (llamados chat-Cre tdTomato): floxSTOP. Estos animales fueron entonces aparearon con ratones reportero GFP-ChAT homocigotos. Se aislaro...

Discusión

Nuestro laboratorio y otros han demostrado que los defectos intestinales en HSCR no se limitan al colon aganglionar pero extenderse proximalmente, incluso en el intestino delgado ganglionar ^5,15,16. Estas alteraciones incluyen cambios en la densidad y ENS fenotipo neuronal neurotransmisor y puede dar cuenta de dismotilidad que se ha observado en pacientes con HSCR. Hemos utilizado las técnicas anteriores en nuestros esfuerzos para comprender los determinantes de la formación de la ENS. En concreto, estas t?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Oxoid	BR0014G
Sucrose	Fisher	S2
Sodium azide	Fisher	BP9221
Bovine serum albumin	Fisher	BP1605
Triton X-100	Sigma	X100
Paraformaldehyde	Sigma	158127
60 mm Petri dishes	Fisher	FB0875713A
Fluorescence microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Fine forceps	Fine science tools	11252-20
1.5 ml Eppendorf tubes	VWR	20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	0100-01
Glass slides	Fisher	12-550-15
Cover glass	VWR	16004-330
Confocal microscope	Nikon	Nikon A1
Nikon Elements	Nikon