Gel System Concentric para estudiar el papel de Biofísica de Matrix Microambiente en la migración de células en 3D

Resumen

Las propiedades mecánicas y la microestructura de la matriz extracelular afectan fuertemente a la migración de las células 3D. Un método in vitro para estudiar el comportamiento de la migración celular espaciotemporal en entornos biofísico variables, tanto a la población y los niveles de células individuales, se describe.

Resumen

La capacidad de las células para migrar es crucial en una amplia variedad de funciones celulares durante toda la vida desde el desarrollo embrionario y la curación de heridas de tumor y la metástasis del cáncer. A pesar de intensos esfuerzos de investigación, los principios básicos bioquímicos y biofísicos de la migración de las células aún no se entienden completamente, especialmente en los microambientes (3D) tridimensionales fisiológicamente relevantes. Aquí se describe un ensayo in vitro diseñado para permitir el examen cuantitativo de los comportamientos de migración celular en 3D. El método explota la capacidad mechanosensing de la célula y la propensión a migrar en la matriz extracelular previamente desocupada (ECM). Usamos la invasión de células de cáncer de mama altamente invasivas, MDA-MB-231, en geles de colágeno como un sistema modelo. La difusión de la población de células y la dinámica de migración de las células individuales durante semanas de cultivo pueden ser monitoreados utilizando imágenes de células vivas y se analizan para extraer datos espaciotemporalmente resueltas. Además, El método es fácilmente adaptable para diversas matrices extracelulares, lo que ofrece una manera simple pero potente para investigar el papel de los factores biofísicos en el microambiente sobre la migración celular.

Introducción

La migración de las células juega un papel clave en diversas respuestas fisiológicas, tales como el desarrollo embrionario, la hemostasia, y la respuesta inmune, así como en procesos patológicos tales como enfermedades vasculares, la inflamación y el cáncer ^1. La disección de los factores bioquímicos y biofísicos subyacentes migración celular es, por tanto, fundamentalmente importante no sólo para entender los principios básicos de las funciones celulares, sino también para avanzar diversas aplicaciones biomédicas, tales como en la ingeniería de tejidos, anti-metástasis y el desarrollo de fármacos antiinflamatorios. Dado que la observación in vivo es técnicamente difícil, una gran cantidad de esfuerzos se ha centrado en la recapitulación in vitro de la migración celular.

Los métodos in vitro para estudiar la migración celular en gran medida han sido diseñados para los ensayos en dos superficies dimensionales (2D), en particular el cero o cicatrización de la herida ensayo ^2. Dichos ensayos ofrecen configuración experimental simple, fácil ganadoimágenes de células, y proporcionar información útil sobre diversos mecanismos bioquímicos que subyacen a la migración celular. Sin embargo, estos ensayos no dan cuenta de la matriz (ECM), la arquitectura y la remodelación extracelular, que son aspectos críticos en la comprensión de la migración vivo. Recientemente, se ha apreciado cada vez que un modelo de cultivo 3D, a menudo en matrices a base de ^colágeno-3, proporciona una plataforma que mejor se asemeja a la situación in vivo. De hecho, las células presentan dinámicas migratorios que son distintos de los de las superficies en 2D, especialmente debido a la diferente dimensionalidad del medio ambiente ^4. Por otra parte, las propiedades biofísicas y mecánicas de la matriz afectan sensiblemente la migración celular ^5, incluso en el contexto de la invasión de células tumorales ^6.

A continuación, presentamos un método para estudiar el comportamiento de la migración celular 3D en ECM con propiedades biofísicas que pueden ser fácilmente variado, con condiciones de preparación. Las células sonsembradas en un "gel interior" y se les permite escapar hacia e invadir el "exterior de gel" inicialmente acelular. El método se basa en la capacidad de la célula para reconocer la presencia de, y la propensión a migrar a regiones libres de células en el exterior de gel, que está estrechamente vinculado a la celda mechanosensing ^7. En este estudio, utilizamos redes de colágeno como las ECMs invadidos por las células del cáncer de mama altamente invasivos, MD-MBA-231. Las propiedades mecánicas y la microestructura tanto de los geles de interior y exterior se pueden sintonizar ⁸ y ⁹ caracterizan para lograr condiciones fisiológicamente relevantes. Reconstrucción y el análisis de las vías celulares permiten examen cuantitativo detallado del comportamiento de la migración espacio-temporal, tanto a nivel de población y nivel de células individuales. Es importante destacar que la configuración del sistema de gel concéntrica imita el tejido vivo topología en enfrentado mediante la migración de las células, especialmente las células invasoras de cáncer, ofreciendo así importantes conocimientos ena los mecanismos físicos de la migración celular y la metástasis.

Protocolo

Cosecha 1. celular

1. Obtener MD-MBA-231 desde la 37 ° C, 5% de _CO2. Separe las células de la placa de cultivo de tejidos utilizando la solución de tripsina-EDTA 0,5%. Usar 1 ml de solución de tripsina-EDTA para células cultivadas en un matraz T25.
2. Precipitar las células en un tubo cónico de 15 ml mediante centrifugación a 200 × g durante 4 min, aspirar el sobrenadante, y Resuspender las células en 5 ml de medio de cultivo.
3. Contar la densidad celular, ρ, usando un hemocitómetro.
   Nota: Para preparar el gel interior sembrado de células, la suspensión de células después se diluyó 10 × para llegar a la densidad final de la siembra de células. Por lo tanto, se requiere 10 × suspensión celular concentrada.
4. Calcular el volumen de medio requerido para alcanzar una concentración de 10 × celular:
   
   Nota: Una densidad final siembra de células, c _final, en torno al 215; 10 ⁶ células / ml se recomienda para MD-MBA-231 y se utiliza en este protocolo. Otros densidades de siembra también se pueden explorar para otros tipos de células.
5. Precipitar las células una vez más en un tubo cónico de 15 ml mediante centrifugación a 200 × g durante 4 min, y aspirar el sobrenadante.
6. Resuspender las células en la cantidad requerida _(medio V calculados en el paso 1.3) de medio de cultivo celular libre de suero a fondo para minimizar la aglutinación de células.
   Nota: El fenol rojo es auto-fluorescente, y puede interferir con imágenes de fluorescencia / reflectancia. Uso de medio libre de rojo de fenol puede ser considerado para lograr mejor calidad de imagen.

2. Preparación de las soluciones de colágeno

1. Obtener la solución de colágeno de valores, 10 × tampón PBS, Milli-Q H ₂ O, 0,1 M NaOH, y varios tubos de microcentrífuga. Mantenga todo en hielo para evitar la polimerización prematura de colágeno, y mantener condiciones de esterilidad.
2. Equilibrar un vidrio estérilplato inferior por pre-calentamiento en el 37 ° C incubadora.
   Nota: Todos los volúmenes en este protocolo se han optimizado para un plato de fondo de vidrio con 12 mm así. Si se utiliza otro tipo de plato, ajustar los volúmenes correspondientemente.
3. Calcular el volumen requerido necesario para preparar 50 l de solución de colágeno 2,4 mg / ml para el gel interior (solución I) basado en la concentración de colágeno de valores.
   Nota: Otros concentraciones de colágeno para el gel interior también se pueden utilizar.
4. En un ambiente estéril (típicamente una campana de bioseguridad), añadir lentamente 5 l de 10 x tampón de PBS a la cantidad requerida de solución de colágeno de stock (calculado en el paso 2.3) con agitación suave. Tenga cuidado para evitar la formación de burbujas de aire.
5. Ajustar el pH de la mezcla a 7,4 utilizando NaOH 0,1 M usando calibrado pH-metro. Como regla general, utilice unos 5 l para llevar el pH cercano a 7,4 (la cantidad varía dependiendo de la acción concentración y pH).
   Nota: Tenga en cuenta que los volúmenes involucrados en estepaso es demasiado pequeño para el uso de medidor de pH estándar. Utilice uno de los siguientes trucos:
   1. Preparar soluciones de colágeno de múltiples muestras. Ajustar el pH a granel utilizando medidor de pH estándar y distribuir las soluciones de colágeno a través de las muestras.
   2. Alternativamente, ajustar el pH de una solución de colágeno en el volumen más grande (i. E., Volumen que permite el uso de medidor de pH estándar). Tenga en cuenta la cantidad de NaOH necesaria para llevar el pH al pH final. De bajar el volumen y utilizar la cantidad apropiada de NaOH para el experimento. Confirme el valor del pH con papel tornasol.
   3. De lo contrario, utilice un micro electrodo de pH para ajustar con mayor precisión el pH de pequeñas cantidades.
6. Poner la solución en un volumen de 45 l usando H ₂ O. Realice todos los pasos en el hielo para evitar la polimerización prematura de colágeno.

3. Formación de Gel Concentric Cultura

1. Tome el plato de fondo de vidrio precalentado (véase el paso 2.2) de The incubadora.
2. Añadir 5 l de la suspensión celular concentrada 10 × (preparado en el paso 1.5) a la solución I. Resuspender a fondo. Tenga cuidado para evitar la formación de burbujas de aire. La mezcla ahora tiene un volumen de 50 l y contiene la concentración final de colágeno (2,4 mg / ml) y la densidad celular (c _final = 2 × 10 ⁶ células / ml).
3. Añadir 20 l de la solución que contiene la célula-I lentamente hacia el centro del pozo, de manera que forme una gotita (Figura 1A) en forma de cúpula. Tenga cuidado para evitar la formación de burbujas en este paso. Si se forma una burbuja, con cuidado pero rápidamente se trate de cualquiera de romperse o aspirar a cabo utilizando una punta de pipeta. Con cuidado, coloque el plato de nuevo en la incubadora para que el gel interior polimeriza durante 45 minutos.
4. Preparar la solución de O (para la, gel de colágeno acelular exterior) aproximadamente 15 minutos antes del final de esta etapa de incubación.
   Nota: La condición exterior de gel se puede variar en términos de concentración de colágeno y pH de polimerización aobtener redes con diferentes microestructuras ^10. En este protocolo, se centran en un 1,5 - / gel de colágeno ml 4.0 mg polimerizado a un pH de 7,4.
   1. Sobre la base de la concentración de colágeno de valores, calcular el volumen requerido necesario para preparar 200 l de solución de colágeno O a la concentración final.
5. Añadir 20 l de 10 × tampón PBS lentamente a la cantidad necesaria de solución de colágeno de valores (calculado en el paso 3.4) con agitación suave. Ajustar el pH de la mezcla al pH final utilizando 0,1 M NaOH con el uso de calibrado pH-metro. Ver nota al paso 2.5 en relación con el ajuste del pH.
6. Poner la solución en un volumen final de 200 l usando H ₂ O. Realice todos los pasos en el hielo para evitar la polimerización prematura de colágeno.
7. Sacar la fuente de la incubadora después de 45 min de polimerización del gel interior (véase el paso 3.3). Añadir suavemente 180 l de solución de O en la parte superior del gel interno, de manera que la solución cubra completamente el interiorgel y se llena el pozo (Figura 1B).
   1. Realice este paso con cuidado, sin agitar la solución, que puede conducir a orientaciones de las fibras no uniformes en el exterior de gel. Tenga cuidado de no tocar el gel interior con una punta de pipeta, y para evitar la formación de burbujas o bolsas de aire. Si se forma una burbuja, con cuidado pero rápidamente se trate de cualquiera de romperse o aspirar a cabo utilizando una punta de pipeta. Con cuidado, coloque el plato de nuevo en la incubadora para que el polimerizan exterior de gel.
8. Sacar la fuente de la incubadora después de 45 min de polimerización. El gel debe estar ya bastante solidificó en este punto, a pesar de que todavía se puede separar de la superficie inferior si se maneja más o menos.
   1. Verter suavemente 2 ml de medio de cultivo celular se calentó hasta el plato (Figura 1C). Asegúrese de que el gel está completamente sumergido en el medio. Actualizar el medio cada 2 - 3 días a lo largo de la duración de la cultura.

4. Células vivas imágenes

1. Realizar las imágenes utilizando un microscopio confocal invertido equipado con capacidad de imágenes de células vivas a largo plazo. Incluir un incorporado en la cámara de incubación con una temperatura (37 ° C) y control de CO ₂ (5%). Encienda el microscopio y calentar el escenario por lo menos 1 hora antes de comenzar el experimento.
   Nota: El uso de lente de objetivo con distancia de trabajo larga para optimizar la observación y la localización de las células en los geles 3D.
2. Incubar el gel en medio que contiene 5 l de colorante de seguimiento de células fluorescentes durante 30 min para permitir una localización precisa de las células en el sistema 3D. Posteriormente, retirar colorante no unido por lavado tres veces con 1 × PBS. Después, se añade medio de cultivo celular para el plato.
3. Sacar la fuente de la incubadora y colóquelo sobre la platina del microscopio (Figura 1D).
   Nota: imágenes de células vivas puede comenzar en principio justo después de la polimerización del gel exterior. Sin embargo en este punto, las células in el gel interior aún no han diseminado. Para examinar la migración de las primeras células que han invadido el exterior de gel, imágenes de células vivas puede iniciar 24 hr (dependiendo del tipo de célula) después de la iniciación del cultivo. Como una guía general, alrededor de 12 - se necesitan 14 días de cultivo para la mayoría de las células en el gel interior para entrar en el exterior de gel.
4. Seleccione Volúmenes de Vista (VoV de) en las regiones en el gel exterior que rodea el gel interior. Después de 24 horas de incubación, la población de células se han propagado, cruzó la interfaz entre los geles de interior y exterior, y comenzó a invadir el exterior de gel.
   1. Para el VoV de, incluir las regiones de gel inmediatamente al lado de la interfaz de gel, regiones intermedias, y las regiones cerca de las afueras de la exterior de gel ^7. Excluir regiones más cerca de 50 micras, de las superficies inferiores y laterales, así como de la parte superior del gel, para evitar posibles efectos de borde. Cada VoV típicamente mide 647 × 647 × 100 m ³ (en x, Y, y Z, respectivamente), con un intervalo de 5 micras en el -stack z.
5. Asegurar los modos de imagen, canales / filtros, tiempos de exposición, y las resoluciones de imagen se seleccionan correctamente. Para imágenes sin etiqueta de la red de colágeno, utilice la microscopía confocal de reflectancia simultáneamente durante la obtención de imágenes de células vivas de lapso de tiempo.
6. Tomar imágenes de muestra, trazar los histogramas de intensidad, y ajustar las ganancias y las compensaciones para observar la señal sea suficiente y evitar la saturación, asegurando que el histograma se encuentra entre cero y la máxima intensidad. No cambie estos ajustes más largo de la duración del experimento.
7. Tomar imágenes con lapso de tiempo de la década de VOV seleccionados, con un intervalo de tiempo, Δ t, de 10 min durante 8 horas (o más si es necesario).

5. Seguimiento de la célula y Análisis de Datos

1. Realizar imagen cuantitativa de post-procesamiento de las imágenes -stack z utilizando apropiación software de procesamiento de imágenes TE.
   1. Segmento de las imágenes con lapso de tiempo para seleccionar automáticamente las posiciones celulares 3D en (x, y, z, t).
   2. Para cada cuadro, comprobar manualmente la precisión de localización y eliminar falsos positivos debido a los desechos celulares y protuberancias celulares que pueden haber sido confundido con células. Eliminar las células proliferativas de los análisis y las células se superponen o conectados divididas en objetos distintos.
2. Generar pistas de células de lapso de tiempo 3D a partir de las coordenadas de células (x, y, z, t) obtenidos en el paso anterior mediante la vinculación de la ubicación de cada célula en la secuencia de tiempo.
3. Eliminar el ruido aleatorio y sistema mediante la eliminación de las pistas más cortas que una longitud umbral de pista (típicamente 20 min).
4. Corrija para la muestra deriva restando los desplazamientos netos globales de las pistas si es necesario.
5. Calcular el desplazamiento celular,iles / ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg "width =" 80 "/>, y la distancia de la migración celular, , A partir de las trayectorias de células observadas, donde es un vector que representa la ubicación 3D de una célula en el momento y es el número total de puntos de tiempo.
   1. Calcular la velocidad de célula como S = d / (n • Δ t), donde Δ t es el intervalo de tiempo entre tramas. Calcular direccionalidad migración celular (o persistencia) utilizando P = Dd / d. Esta simple medida de la persistencia implica que para P = 0, el desplazamiento neto es cero y para p = 1 la trayectoria es una línea recta direccional.

Resultados

El ensayo de gel concéntrica que aquí se presenta se realizó utilizando células de cáncer de mama altamente invasivas, MDA-MB-231, con 2,4 mg / ml de gel de colágeno interior y una densidad de siembra de células de = 2 × 10 ⁶ células / ml, como un ejemplo. Como se muestra en la Figura 2, por lo general después de unos días de cultivo, las células incumplieron la interfaz gel interior-exterior y comenzaron a invadir el exterior de gel. La población de células propaga predominante...

Discusión

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration¹³, which has to date been lar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture incubator	Fisher Scientific Pte Ltd	Model: 371, S/No 318854-6055
Confocal microscope	Nikon A1R		Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	10082-147
Fluorescent CellTracker dye CMTMR	Life Technologies	C2927
Glass-bottom dish	IWAKI Cell Biology	3931-035	35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well
Hemocytometer	iN CYTO	DHC-N01 (Neubauer Improved)
Microprocessor pH meter	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen Collagen	Advanced BioMatrix	#5010-D	Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)
Objective lens	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
pH meter	Sartorius	S/No 29153352	Basic pH Meter PB-11
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054