El cultivo de ratón cardíaca válvulas en el sistema de cultivo tisular miniatura

Resumen

Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

Resumen

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.

Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.

In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.

Introducción

Enfermedad de las válvulas cardíacas son una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo occidental; su prevalencia aumenta con la edad y afecta a más del 10% de la población de 75 años y mayores ^1. Las válvulas de la parte sistémica del corazón, las válvulas aórtica y mitral, son en su mayoría afectada. Enfermedad de la válvula cardíaca se caracteriza por la pérdida de la estructura altamente organizada de las válvulas, lo que resulta en la alteración de las propiedades mecánicas ^2. La integridad estructural tanto, es fundamental para la función de la válvula.

Las valvas de la válvula se componen de células intersticiales valvulares (VIC), células endoteliales valvulares (VEC), y la matriz extracelular, que está altamente organizado en un patrón en capas ^3,4. Los VIC son responsables de la síntesis de ECM, la degradación y la organización. Factores que emana de la circulación sanguínea, EC o resida en el acto de ECM en los VIC orquestar su función. En adición,fuerzas mecánicas actúan sobre la valva durante el ciclo cardíaco que resulta en laminar o tensión de cizallamiento oscilatorio, tensiones de compresión que influyen en la resistencia a la tracción o comportamiento de VIC ^5.

Para entender cómo se regula la estructura de la válvula, primero hay que entender cómo VIC responden a la diversa serie de estímulos experimentados durante el ciclo cardíaco. Los estudios in vitro han sido muy informativo sobre las características y capacidades de las células valvulares. La respuesta de estas células in vitro, sin embargo, no siempre puede imitar con precisión la respuesta in vivo ^6; por ejemplo, la respuesta de VIC a los estímulos depende de la presencia de ECs y la composición ECM ^5. Además, la respuesta de las células a los estímulos valvulares depende de su ubicación específica en el prospecto ^7. Además de los estímulos bioquímicos, el comportamiento de las células valvulares se determina por las fuerzas mecánicas que actúan on la válvula ^8. Cada región de la válvula se somete a su propio conjunto específico de tensiones hemodinámicas. Aunque los modelos actuales ex vivo han demostrado que las fuerzas mecánicas son determinantes importantes de la estructura valvular ^5, los mecanismos asociados aún no están claros. Mientras que los modelos in vivo han proporcionado información sobre los mecanismos moleculares que subyacen el desarrollo valvular ^9,10, conocimientos sobre la biología valvular adultos sigue siendo difícil de alcanzar.

Por lo tanto, un modelo in vivo ex flujo fue desarrollado en el que las válvulas cardíacas pueden cultivarse en su posición natural en el corazón durante un período prolongado de tiempo ^11. Esto tiene la ventaja de que las válvulas se mantienen en su configuración natural y los VIC experimentan el mismo entorno que in vivo, por lo que las respuestas a los estímulos vics tan natural como sea posible. Además, la cultura de las válvulas en su posición natural en el corazón facilita sometiendo cada unoregión valvular a las tensiones hemodinámicas relevantes. En este modelo ex vivo, es decir, el sistema de tejido miniatura Cultura (MTCS), las válvulas se puede someter a diferentes estímulos bioquímicos y hemodinámicos que permiten la investigación de su papel en la remodelación de la válvula cardiaca.

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Protocolo

Este protocolo sigue las directrices LUMC del comité de ética de la investigación animal.

1. Preparación de instrumentos, medio de cultivo, y MTCS

Nota: Realice todas las preparaciones en la campana de flujo laminar. La cámara de perfusión MTCS, trampa de burbujas y el soporte se describen en Lieber et al., 2010 ^11.

1. Desinfectar los fórceps y micro tijeras con etanol al 70%. Preparar una jeringa de 5 ml con una aguja 21G con NaCl estéril de Tyrode Buffer (130 mM, 5,4 mM KCl, mM Hepes 6,0, 1,2 mM MgSO _4, 1,2 mM KH ₂ PO _4, mM glucosa 20, 1,5 mM CaCl ₂ • 2H ₂ O, pH = 7,2). Preparar una jeringa de 5 ml con una aguja 21G con una solución de KCl estéril (100 mM).
2. Preparar 65 ml de medio por DMEM: corazón suplementado con 10% suero de ternero fetal, de antibiótico / antimicótico (A / A; 100 unidades de penicilina, 100 g de estreptomicina y 0,25 ug de anfotericina B / ml), insulina-Transferrin-El selenio (ITS; 10 mg / ml de insulina, 5,5 mg / ml de transferrina, 6,7 ng / ml selenita de sodio) y esterilizar filtro.
3. Esterilizar la cámara de perfusión y la trampa de burbujas mediante pulverización con etanol al 70% y secar con una toalla de papel. Montar el MTCS (Figura 1D), sin embargo, inicialmente sin la cámara de perfusión. Coloque la trampa de burbujas en el estrado. Utilice una bomba de rodillo peristáltico con cabezales de bomba fácil de carga.
   1. Uso de tubo de silicona hacer conexiones entre el depósito (tubo de 50 ml) y la bomba, la bomba y la trampa de burbujas, la trampa de burbujas y el depósito (véase la Figura 1D). Hacer el tubo dentro de la incubadora tiempo suficiente para permitir medio alcance el equilibrio de gas con el gas en la incubadora a través de la tubería de gas permeable de silicio (1 m) y el tubo fuera de la incubadora tan corto como sea posible.
4. Llene el tubo de 50 ml con etanol al 70%, encienda la bomba (velocidad de flujo alrededor de 1 ml / min para permitir la circulación adecuada) y dejar que el cir etanolcular durante 30 min para esterilizar todos los tubos. Separar el etanol mediante el vaciado del depósito y bombear el etanol a partir del sistema.
5. Llene el tubo de 50 ml con agua destilada estéril, encender la bomba y deje circular el agua durante 30 minutos para deshacerse de etanol restante. Eliminar el agua vaciando el depósito y bombear el agua desde el sistema.
6. Llene el tubo de 50 ml con 45 ml de medio, poner el pie en la incubadora. Encienda el (velocidad de flujo alrededor de 1 ml / min) la bomba y circule el medio para llenar toda la tubería, retire todas las burbujas de aire y permitir que el medio para adaptarse a la composición del gas en la incubadora durante al menos 1 hora. Mantener la incubadora a condiciones de cultivo de tejidos estándar (5% de CO ₂ y 37 ° C). Asegúrese de que no hay burbujas en el tubo.

2. Aislamiento de ratón del corazón

1. Inyectar el ratón con 500 unidades de heparina. Esto evitará que la sangre se coagule y permite la eliminación de blood desde el corazón. Después de 10 min, anestesiar el ratón en una cámara de inducción con 4% de isoflurano usando un vaporizador de precisión. La anestesia es suficiente cuando el ratón no responde a la pizca dedo del pie.
2. Transferir el ratón para un tablero de disección y mantener la anestesia por medio de una mascarilla conectada a un circuito coaxial. Desinfectar la piel del ratón con un 70% de alcohol. Usando tijeras abiertas de la cavidad abdominal para exponer la vena cava y el diafragma.
3. Para exponer el corazón, hacer incisiones laterales a partir de la última a las primeras costillas y reflejan la caja torácica sobre la cabeza de ratón. Detener la anestesia como el ratón no está respirando más. Observar los latidos del corazón.
4. Insertar la aguja 21G unida a una jeringa 5 ml que contiene tampón estéril de Tyrode en la vena cava inferior desde el abdominal en la cavidad torácica (a través de diafragma). Asegúrese de que la sangre pueda salir de la vena cava caudal de la inserción de la aguja. Perfundir ªBuffer de correo Tyrode con suavidad y con una presión constante en la vena cava hasta que el corazón pierde en parte su color rojo. Nota: El corazón permanece superando lo que permite la extracción de la sangre desde el corazón.
5. Vuelva a colocar la aguja con la aguja 21G unida a una jeringa de 5 ml que contiene la solución KCl estéril. Perfundir suavemente la solución de KCl en la vena cava hasta que el corazón deja de latir y retire la aguja. Nota: La solución de KCl conserva el corazón en la fase diastólica relajado, lo que permitirá la inserción más fácil de las agujas de perfusión y la perfusión del sistema coronario.
6. Levante ligeramente el corazón utilizando pinzas curvas y con unas tijeras diseccionar el corazón libre de los tejidos circundantes, pero dejan las arterias y las venas proximales al corazón intacto y unido al corazón. Transferir el corazón a un tubo de 15 ml que contiene PBS enfriado con hielo suplementado con antibiótico / antimicótico (A / A). Guarde el corazón helado de PBS durante un máximo de 3 horas.

3. Cannulation de los corazones del ratón en la cámara de perfusión

1. Realizar todos los procedimientos en campana de flujo laminar. Transferir el corazón aislado del tubo de 15 ml a una placa de 10 cm Petri y añadir PBS suplementado con A / A.
2. Bajo un microscopio de disección, utilice la tijera micro y fórceps para eliminar todo el tejido no cardiaco pero preservar la aorta ascendente al menos a la bifurcación con la arteria braquiocefálica y las venas pulmonares, 2 mm proximal al corazón. Cortar la punta de la punta del corazón para crear el acceso al lumen del ventrículo izquierdo (típicamente 2 mm). Coloque la cámara de perfusión en el campana de flujo bajo el microscopio de disección.
3. Adjuntar una jeringa de 5 ml con medio a la aguja de inserción usando el tubo de silicona. Llenar la cámara de perfusión con 20 ml de medio y poner el corazón en la etapa de rotación entre las 2 agujas romas en la cámara de perfusión (Figura 1). Ajuste la altura de la etapa de rotación por lo que el corazón se coloca delante de laagujas.

4. La ligadura para el cultivo de la válvula mitral (ver Figura 1)

1. Ligar la aorta con sutura (seda 7.0). Ligar la orejuela auricular izquierda con sutura. Insertar la aguja (nr. 1 en la Figura 1) a través de la vena pulmonar hacia la aurícula izquierda y se liga con sutura proximal de su entrada en la aurícula izquierda. Asegúrese de que la aguja no está demasiado lejos en la aurícula izquierda ya que esto podría dañar la válvula mitral.
2. Insertar la aguja (nr.2 en la Figura 1) con movimiento lineal en el ventrículo izquierdo. Transferir el medio procedente de la cámara de perfusión a un tubo de 50 ml. Sellar la aguja al miocardio con pegamento biocompatible.
3. Después de que el pegamento se haya secado, inyecte cuidadosamente medio en el corazón mediante la conexión de una jeringa llena de mediano a la aguja nr.1 y compruebe si hay alguna fuga. Asegúrese de que las salidas de medianas de nr.2 aguja y la última sangre restante se perfunde fuera del corazón.

5. Ligación para el cultivo de la válvula aórtica (ver Figura 1)

1. Insertar la aguja (Nr.1 en la Figura 1) en la aorta y se liga con sutura. Asegúrese de que la aguja no está demasiado lejos hacia la aorta ya que esto podría dañar la válvula aórtica. Insertar la aguja (nr.2 en la Figura 1) con movimiento lineal en el ventrículo izquierdo. Transferir el medio procedente de la cámara de perfusión a un tubo de 50 ml. Sellar la aguja al miocardio con pegamento biocompatible.
2. Después de que el pegamento se haya secado, inyecte cuidadosamente medio hasta el corazón mediante la conexión de una jeringa llena de mediano a la aguja nr.2 y compruebe si hay alguna fuga. Asegúrese de que las salidas de medianas de nr.1 aguja y la última sangre restante se perfunde fuera del corazón.

6. Coloque cámara de perfusión en el Stand

1. Llenar cámara de perfusión con los 20 ml de medio transferidos. Coloque la junta y la tapa de la cámara y apretar con lavadora y tornillos.
2. Retire los MTCS reunidos desde el INCUBAtor. Coloque la cámara de perfusión en el estrado. Conecte la tubería (ver Figura 1D). Coloque el soporte en la incubadora (5% de CO ₂ y 37 ° C). Conectar el tubo a la bomba. Encienda la bomba con velocidad de flujo alrededor de 600 l / min.
3. Asegúrese de que en el depósito y / o la trampa de burbujas el nivel del medio permite que las visualizaciones de la presencia del flujo por la caída de las gotas medianas entrantes. Después del cultivo, el corazón es retirado del sistema, fijaron y procesaron para examen histológico.

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Resultados

La válvula aórtica (Figura 2) o la válvula mitral ¹¹ pueden ser cultivadas durante al menos 3 días. Mediante el cultivo en la posición abierta (que representa la posición sistólica de la válvula aórtica y la posición diastólica para la válvula mitral), las células permanecen viables valvulares. No se observa la muerte celular tal como se determina por la ausencia de células TUNEL positivas (Figura 2H, I) o exfoliados caspasa-3 de expresión (que no se muestra y ...

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Discusión

Los pasos críticos en el cultivo de las válvulas de ratón cardíacas incluyen hacer el tiempo entre la extirpación del corazón desde el ratón y la ligadura en la cámara de perfusión tan corto como sea posible para asegurar la viabilidad y la ligadura de las agujas perpendicular a las válvulas para garantizar la dirección apropiada de la corriente de . Adicionalmente, control del caudal después de la ligadura en la cámara de perfusión sin medio asegura la inserción y la ligación de agujas apropiada. Es fun...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies	10569-010
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140
Insulin-Transferrin-Selenium	Life Technologies	41400-045
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-06
Silk 7-0	Ethicon	768G
100 mm culture dish	Greiner bio-one	664160
50 ml tube	Greiner bio-one	227261
5 ml syringe	BD	309649
21 G needle	BD	304432
Heparin	LEO	012866-08
Forceps	Fine Science Tools	11295-00
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	Tedpella	1346
Silicon tubing	Thermo Scientific	8060-0020	I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm
Silicon tubing for pump	Masterflex	96400-13	I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm
Biocompatible glue (Histoacryl)	B. Braun	1050071
precision vaporizer	Dräger	Vapor 200
peristaltic roller pump	Masterflex	7521-35
Easy-load pump head	Masterflex	7518-00
Flow chamber			see Lieber et al., 2010
Bubble trap			see Lieber et al., 2010