Las inyecciones intramusculares largo de las placas motoras de final: un abordaje mínimamente invasivo de trazadores de traslado directamente en neuronas motoras

Resumen

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Resumen

Las enfermedades que afectan la integridad de las neuronas motoras de la médula espinal se encuentran entre las enfermedades neurológicas más debilitantes. Durante las últimas décadas, el desarrollo de varios modelos animales de estos trastornos neuromusculares ha proporcionado la comunidad científica con diferentes escenarios terapéuticos dirigidos a retrasar o revertir la progresión de estas condiciones. Al tomar ventaja de la maquinaria retrógrado de las neuronas, uno de estos enfoques ha sido para apuntar los músculos esqueléticos con el fin de genes terapéuticos de transporte en los correspondientes neuronas motoras de la médula espinal. Aunque una vez prometedor, el éxito del enfoque de prestación de dicho gen se ha visto obstaculizada por el número subóptimo de las neuronas motoras transducidas se ha mostrado hasta ahora a ceder. Placas de extremo del motor (MEPS) son regiones altamente especializados en la musculatura esquelética que están en contacto sináptica directa a la médula espinal α neuronas motoras. A este respecto, es importante señalar que, hasta ahora, los esfuerzos para retrógradamentegenes de transferencia en neuronas motoras se hicieron sin referencia a la ubicación de la región de MEP en los músculos objetivo. A continuación, describimos un protocolo simple 1) para revelar la ubicación exacta de los eurodiputados en la superficie de los músculos esqueléticos y 2) para utilizar esta información para guiar la entrega intramuscular y posterior transporte retrógrado óptima de trazadores retrógradas en neuronas motoras. Esperamos utilizar los resultados de estos experimentos de rastreo en otros estudios en la investigación de transporte retrógrado de genes terapéuticos a las neuronas motoras de la médula espinal a través de la focalización de los eurodiputados.

Introducción

La pérdida de control del movimiento voluntario que resulta de condiciones neurológicas como la enfermedad de la motoneurona espinal-y así como la atrofia muscular de Duchenne es una enfermedad debilitante que tiene impacto duradero de alto y largo en la vida cotidiana de los individuos afectados. Durante la última década, los esfuerzos de investigación con el objetivo de detener o al menos retrasar los efectos nocivos de estas enfermedades neuromusculares ha sido una prioridad para muchos médicos y científicos de todo el mundo. En este sentido, la reciente generación de modelos animales que imitan estas enfermedades neuromusculares ha sido fundamental en la obtención de conocimientos fundamentales de los mecanismos fisiológicos subyacentes al desarrollo y la progresión de estas condiciones ^1-13. El tratamiento de estas enfermedades neuromusculares requiere acceso directo a la médula espinal y se puede lograr por medio de inyecciones en la médula espinal ^14,15. Los recientes avances en la terapia génica también han atacado a los músculos estriados de la parte superior ymiembros inferiores a los genes terapéuticos de transporte a los correspondientes motoneuronas α que se encuentran dentro del asta ventral de la médula espinal ^1,9-13. Sin embargo, esta estrategia una vez prometedora no ha logrado mejorar el resultado de estas condiciones neurológicas. Si bien es justo concluir que estos pobres resultados podrían ser, al menos en parte, ser atribuible a la baja eficacia de estos genes protectores, no se puede excluir la baja eficacia de estos métodos de administración de genes.

Placas terminales del motor (los diputados) son regiones especializadas de las miofibras esqueléticas que se sangría por los terminales de los axones de las grandes fibras motoras periféricas procedentes de α neuronas motoras. En conjunto, las terminaciones de fibras nerviosas periféricas y los eurodiputados forman la unión neuromuscular, es decir, el lugar donde los impulsos sinápticos son provocados por la liberación anterógrada del neurotransmisor, la acetilcolina. Es importante destacar que la relación entre las fibras nerviosas periféricas y los eurodiputados es bi-direccional, aunque diferentes motores son responsables del transporte de moléculas y orgánulos hacia y fuera de la neurona Somata ^16-18. A la luz de estas consideraciones anatómicas, los eurodiputados parecen ser el blanco de elección para la entrega y transporte retrógrado subsiguiente de material genético a las neuronas motoras correspondientes. En este contexto, no es sorprendente que el éxito de la transducción de las neuronas del motor depende en gran medida de la distancia entre la inyección intramuscular de vectores virales y eurodiputados del músculo ^19-20. Sorprendentemente, sin embargo, la localización exacta de las zonas de MEP en las miofibras de la rata y el ratón de laboratorio, las dos especies de elección para modelar enfermedades neuromusculares, no estaban disponibles hasta hace poco.

Hemos producido mapas completos de la región MEP durante varios músculos de las extremidades anteriores en la rata y el ratón ^21-22. Más recientemente, hemos mostrado los detalles de la organización del MEP region durante varios músculos de la extremidad posterior del ratón ²³ y que están analizando las características de los diputados al Parlamento Europeo en la extremidad posterior de la rata. En nuestras manos, inyecciones intramusculares de trazadores retrógradas dirigidas a la totalidad de las zonas de MEP en estos músculos dieron lugar a las neuronas motoras más marcadas que se abarcan segmentos más de la médula espinal que se informó anteriormente. Aquí presentamos el protocolo que se ha desarrollado en los últimos años para revelar la ubicación de los diputados en la superficie externa, así como en toda la profundidad de las extremidades posteriores y músculos de la extremidad anterior, tanto en el ratón y la rata.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales aquí descritos cumplen con el Comité de Cuidado y Ética Animal de la UNSW Australia y se llevaron a cabo de acuerdo con el Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia reglamentos para la experimentación animal. Todos los procedimientos de este protocolo deben realizarse de acuerdo con el requerimiento de la Comisión correspondiente Cuidado de Animales y Ética.

1. La acetilcolinesterasa histoquímica tinción

1. Preparar la mezcla de reacción de la acetilcolinesterasa
   1. Añadir 290 mg de yoduro de acetiltiocolina a 200 ml de tampón fosfato 0,1 M (PB). Mezclar con un agitador magnético a 900 rpm.
   2. Añadir 600 mg de glicina bajo agitación continua.
   3. Añadir lentamente 420 mg de sulfato de cobre a la mezcla de reacción bajo agitación continua hasta que el producto se haya disuelto completamente.
2. Retire la piel de la canal animal (obtenido a través del intercambio de tejido) haciendo incisionesen la piel de una rata o ratón perfundido, agarrando la piel de la zona del cuello y tirando de él más allá de sus pies. Asegúrese de que la fascia que cubre cada músculo es o bien eliminado o perforado de manera significativa para asegurar una amplia exposición de las fibras musculares a la solución de reacción.
3. Sumergir todo el cuerpo o la integridad física de interés en la mezcla de reacción y se incuba O / N a 4 ° C.
4. Lavar la carcasa durante 2 minutos en agua destilada. Nota: En esta etapa, los músculos exhiben una coloración azul y las placas extremas del motor (MEPS) pueden verse como puntos blancos.
5. Exponer la carcasa a una solución de sulfuro de amonio al 10% durante 3-5 seg.
   Nota: Las fibras musculares se convierten rápidamente marrón y los diputados al Parlamento Europeo serán observables como puntos negros moteados. Si la reacción se produce con demasiada rapidez, y las fibras musculares se tiñen demasiado oscuro para distinguir entre los eurodiputados y las fibras musculares intente usar concentraciones más bajas de solución de sulfuro de amonio (por ejemplo, 5%). El tiempo de reacción para obtener elun contraste óptimo entre los eurodiputados y las fibras musculares varía de una muestra a la otra. Por lo tanto, es difícil definir el tiempo de exposición exacta para el reactivo. La reacción debe ser monitoreado de cerca y se detuvo cuando el contraste se considera adecuada.
6. Lave la canal dos veces, con agitación en agua destilada y acaricie suavemente el cadáver seco.
7. Fotografía los aspectos lateral y medial de la extremidad, lo que garantiza que los eurodiputados de todos los músculos de interés son capturados.

2. Las inyecciones intramusculares en las placas motoras de final

1. Tire micropipetas de vidrio con un extractor micropipeta (el uso de micropipetas graduadas con émbolos se recomienda). Con la ayuda de un microscopio de disección, romper las puntas de las micropipetas con un par de pinzas de tal manera que el diámetro interno del lumen de la micropipeta es de aproximadamente 0,5 mm.
2. Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos utilizados son recién autoclave y XXen el área quirúrgica es estéril.
3. Llenar las micropipetas con fluoro-Oro (5% en agua destilada).
4. Inducir anestesiar en el animal en una cámara de inducción con isofluorano (4% en O _2). Compruebe reflejo de enderezamiento y asegurar su ausencia antes de sacarla de la cámara de inducción. Asegurar un cono de la nariz sobre el hocico de la rata y entregar isofluorano (2% en O ₂₎ para el mantenimiento de la anestesia. Apriete los pies del animal y tocar suavemente el ojo del animal para asegurar que tanto la retirada del pedal y los reflejos corneales están ausentes. Nota: Una mezcla de ketamina y xylazil también se puede utilizar (80 y 10 mg / kg respectivamente, entregado por vía intraperitoneal). La ketamina es un Anexo 8 ("controlada") de drogas y protocolos necesarios relacionados con la compra, uso, almacenamiento y eliminación de la droga tendrán que ser respetados.
5. Aplicar lubricante ocular para evitar el secado de los ojos durante el curso del procedimiento.
6. Afeitarse la textremidad argeted y el uso de gasa para limpiar la zona afeitada con tres matorrales alternas de clorhexidina y alcohol al 70%. Transferir el animal para el área quirúrgica.
7. Colocar el animal en un underpad limpio y posicionarlo adecuadamente para garantizar un buen acceso al músculo (s) objetivo.
8. Use un par de pinzas con los apretones de dientes para levantar la piel sobre el músculo a tratar fuera de la musculatura subyacente y hacer una incisión en la piel con unas tijeras quirúrgicas. Asegúrese de que la incisión es lo suficientemente grande para exponer completamente el músculo (s) de interés. Asegúrese de que haya una interrupción mínima de la fascia.
9. Utilice las fotografías MEP transponer mentalmente la ubicación y la forma de la región MEP en el músculo (s).
   Nota: un marcador de fieltro bien podría ayudar a reproducir la región MEP en la fotografía en el músculo (s) de interés.
10. Realizar múltiples inyecciones a lo largo de toda la longitud de la región MEP (por fluoro-Oro, 3 a 4 inyecciones de 2.1 l cada should ser suficiente). Limpie suavemente el músculo (s) para eliminar cualquier filtración.
11. Traiga los dos extremos de la piel incisa muy juntos con unas pinzas romas y cerrar la herida con grapas quirúrgicas. Infíltrate en 0,1 ml de bupivacaína (0,5% en agua) (u otros anestésicos locales) a lo largo de todo el arco de la herida.
12. Encienda la máquina de anestesia fuera y controlar al animal hasta que se ha recuperado totalmente de la anestesia.
13. Espere 14 días entre la administración de inyecciones intra-muscular y la perfusión de los animales.

3. perfusiones

1. Administrar una dosis letal de pentobarbital de sodio solución (por ejemplo Lethabarb; 150 mg / kg) al animal mediante inyección intraperitoneal.
   1. Seguir de cerca el animal hasta que se alcance un nivel de profundidad de la anestesia, según ha confirmado la ausencia de la retirada del pedal y los reflejos corneales.
2. Coloque el animal sobre su espalda en una tabla de disección se coloca sobre un perfusion fregadero.
3. Use un par de pinzas con los apretones de dientes para levantar la piel que cubre la base del esternón. Haga una pequeña incisión en la piel con un par de fuertes tijeras quirúrgicas inmediatamente por debajo del esternón y luego usar las pinzas para agarrar el cartílago xifoides del esternón. Mientras sostiene el cartílago xifoides, agrandar la incisión en ambos lados de la cavidad del pecho, desde el esternón hasta las axilas.
4. Cortar el diafragma para exponer el corazón.
   1. Inyectar 0.ml de heparina directamente en el ápice del corazón para prevenir la coagulación de la sangre.
   2. Cortar el ápice para permitir la inserción de una cánula en el ventrículo izquierdo, y luego sujetar rápidamente la cánula en su lugar con la ayuda de un hemostático.
   3. Hacer una incisión en la aurícula derecha con un par de tijeras finas y comenzar inmediatamente la bomba peristáltica. Perfundir con 0,1 M PB hasta que el líquido que sale del atrio es casi libre de la sangre y el color del hígado se vuelve de color marrón claro. Entonces, perfundir con una solución de paraformaldehído (4% en PB 0,1 M) hasta que todo el cuerpo del animal se vuelve rígido.

4. cervical Médula Espinal La disección y preparación para Histología

1. Coloque el cadáver de un animal en su abdomen.
2. Cortar la piel en la línea media del cuerpo con un bisturí y reflejar de la base del cráneo hasta el nivel del hueso ilíaco.
3. Cortar y reflejan los músculos paravertebrales para exponer la cara dorsal de la columna vertebral.
4. Identificar la apófisis espinosa ósea del Atlas, el segundo segmento cervical (es decir, C2), y eliminarlo con un par de pinzas gubias quirúrgicas o para localizar la raíz dorsal correspondiente subyacente.
   1. Identificar la raíz C2 derecho coloreando con un rotulador permanente.
   2. Retire el siguiente vértebras uno por uno y marcar las raíces dorsales correctas con colores alternos (es decir, C2, C4, C6, C8 y pueden ser coloreados en verde y C3, C5, C7, T1 puede ser colORed en azul).
5. Utilice una aguja quirúrgica pequeña (por ejemplo, G aguja de calibre 30) para perforar suavemente a través de la duramadre que cubre el extremo inferior de la médula espinal. Con el bisel de la aguja hacia arriba, levante la duramadre lejos de la cuerda mientras se mueve la aguja rostralmente hacer una hendidura longitudinal.
   1. Reflejar la duramadre.
6. Cortar la forma transversal de la médula espinal en bloques de uno o dos segmentos con una nueva hoja de bisturí.
   1. Deja los segmentos de la médula espinal in situ y, para cada bloque, hacer cuidadosamente una pequeña marca fiducial en el lado izquierdo de cada bloque con la mitad de camino hoja de bisturí entre dos raíces adyacentes. Asegúrese de que la marca de referencia es lo suficientemente profunda a través del tejido que sea visible desde el aspecto ventral de los bloques. Hacer la marca fiducial en un ángulo de aproximadamente 45 °, señalando ya sea anterior o posterior con respecto a la anatomía animal, para ayudar en la orientación del segmento de tejido después de la disección.
7. Recoge los bloques individuales en pequeñas botellas, claramente etiquetados que contienen una solución de paraformaldehído (4% en 0,1 M PB) y dejar a temperatura ambiente O / N.
8. La transferencia de los bloques en botellas limpias, claramente marcado que contiene una solución de sacarosa (30% en 0,1 M PB) y mantener a 4 ° C durante al menos dos días.
9. Coloque los segmentos en crio-moldes y los cubrió con medio de congelación de tejido. Para la preparación histológica longitudinal, orientar los bloques con la cara dorsal hacia arriba y usar la marca de referencia para orientar el bloque en los crio-moldes.
10. Congelar las crio-moldes a -20 ° C y cortar con un criostato en secciones de 50 micras de grosor. Nota: Las secciones se pueden montar directamente en portaobjetos de microscopio de adhesión y se dejan secar O / N. Alternativamente, las secciones se pueden flotar en placas de 48 pocillos llenos de 0,1 M PB y posteriormente montados usando la marca de referencia para orientar las secciones de tejido en las diapositivas.

5. columna lumbar Cord disección y preparación para Histología

1. Coloque el cadáver de un animal sobre su espalda.
2. Realizar una incisión en la línea media a lo largo del abdomen del animal y eliminar las vísceras. Diseccionar los músculos de la pared abdominal posterior para exponer el aspecto ventral de la columna vertebral.
3. Localice el corto rib-caudal mayor y su contigua vértebra T13 donde la raíz ventral T13 sale del hueso.
   1. Eliminar consecutivamente uno por uno el rostral dos o tres vértebras T13 (es decir, T12, T11 y, si es necesario, T10) con gubias quirúrgicas finas para seguir la raíz ventral T13 hasta su punto de entrada en la cara ventral del cordón ventral y marcar con un rotulador permanente.
   2. A partir de ahora, repita el mismo procedimiento para identificar la ubicación de los puntos de entrada de la raíz ventral para L1, L2, L3, L4, L5, L6 y S1, colorear con colores alternados.
4. Siga el mismo procedimiento que se describe en la Sección 4.5 a 4.10 para lumbar disección de la médula espinal.

Resultados

La acetilcolinesterasa tinción histoquímica revela la localización de las placas extremas del motor a través de la anchura de los músculos. Figura 1 ilustra los resultados de tales tinción realizado en toda una extremidad anterior de rata. Se sugiere para optimizar la concentración de la solución de sulfuro de amonio (por ejemplo., 5-7% en lugar del 10%), así como el tiempo de la muestra se sumerge en la solución si la tinción de fondo no específica en las fibras de músculos es dem...

Discusión

Focalización intramuscular y transferencia retrógrada posterior de transgenes terapéuticos a los correspondientes motoneuronas α para el tratamiento experimental de la condición neuromuscular no es una estrategia nueva. Por ejemplo, este método de entrega se ha utilizado para retrasar la degeneración neuromuscular en diferentes etapas de la progresión de la ALS en ratones y ratas SOD1 ^1,9-12 así como en ratones con SMA ^13. Aunque prometedor, la eficacia de estos escenarios de terapia géni...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluoro-Gold	Fluorochrome, LLC	Nil	Diluted to 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10 µl	Drummond Scientific	5-000-1001-X10	accompanied with plungers
Acetylthiocholine Iodide	Sigma Life Science	A5751-25G
Copper(II) Sulfate Anhydrous	Sigma-Aldrich	61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T Compound	Sakura Finetek	25608-930
Glycine	Ajax Finechem	1083-500G
Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin	Life Technologies	D-3312	Diliuted in distilled water
Isothesia	Provet	ISOF00	1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour
Autoclip 9 mm Wound Clips	Texas Scientific Instruments, LLC	205016
Lethabarb Enthanasia Injection	Virbac (Australia) Pty Ltd.	LETHA450
Formaldehyde Solution	Ajax Finechem	A809-2.5L PL
SuperFrost Plus glass slides	Menzel-Glaser	J1800AMNZ
Ammonium Sulphide	Sigma-Aldrich	A1952	Diluted to 10%
Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)	Astrazenca		Diluted to 0.25%