Generación de oscilaciones γ CA1 locales por tetánica Estimulación

Resumen

Las oscilaciones son propiedades fundamentales de la red y son modulados por la enfermedad y las drogas. El estudio de las oscilaciones cerebrales rebanada permite la caracterización de las redes aisladas en condiciones controladas. Los protocolos se proporcionan para la preparación de cortes de cerebro agudos para evocar oscilaciones γ CA1.

Resumen

Oscilaciones de la red neuronal son características importantes de la actividad cerebral en la salud y la enfermedad y puede ser modulada por una serie de medicamentos que se utilizan clínicamente. Un protocolo se proporciona para generar un modelo para el estudio de oscilaciones γ CA1 (20 - 80 Hz). Estas oscilaciones γ son estables durante al menos 30 min y dependen de la actividad sináptica excitatoria y inhibitoria Además de la activación de las corrientes de marcapasos. Oscilaciones tetánicamente estimuladas tienen una serie de características reproducibles y fácilmente cuantificables incluyendo recuento de pico, duración de oscilación, la latencia y la frecuencia que informan sobre el estado de la red. Las ventajas de las oscilaciones estimuladas eléctricamente incluyen la estabilidad, la reproducibilidad y la adquisición episódica que permite la caracterización robusta de la función de red. Este modelo de oscilaciones γ CA1 se puede utilizar para estudiar mecanismos celulares y para investigar sistemáticamente cómo actividad de la red neuronal se altera en la enfermedad y por las drogas.Farmacología estado de enfermedad puede ser incorporado fácilmente por el uso de cortes de cerebro de modelos animales genéticamente modificados o intervencionistas para permitir la selección de fármacos que se dirigen específicamente mecanismos de la enfermedad.

Introducción

Oscilaciones de la red cerebral se producen dentro de las bandas de frecuencia distintas que se correlacionan con los estados de comportamiento. En los roedores, las oscilaciones θ hipocampo - se observan (5 de 10 Hz) durante conductas exploratorias ^1,2, mientras que las oscilaciones γ (20 - 80 Hz) asociado con diversos procesos cognitivos, incluyendo la percepción y la atención ^3,4. Actividad de la red γ síncrono también está implicado en la patología de trastornos tales como la epilepsia y la esquizofrenia ^5,6. Por ejemplo, se cree que las oscilaciones γ para corresponder a las áreas de cortical focos epilépticos ^5,7,8 y podrían ser utilizados como marcadores de pharmacosensitivity o resistencia, dos áreas importantes de la investigación en la investigación de la epilepsia ^9.

La rebanada del hipocampo del cerebro es un modelo que ha sido ampliamente utilizado para investigar la actividad de red ^10-12. Varios protocolos se han desarrollado para generar oscilaciones γ en rodajas de cerebro que normalmente involve modulación farmacológica como la baja Mg ^2+, 4-aminopiridina (4AP), bicuculina y ácido kaínico ^12-17. Deficiencias de oscilaciones farmacológicamente desencadenados son que ocurren al azar después de la aplicación de drogas y no se generan de forma fiable o estables en el tiempo. De disparo eléctrico oscilaciones γ superar muchos de estos problemas y también tienen la ventaja de estar temporalmente bloqueada para el evento estimulante que permite la grabación y el análisis episódica. Aquí se describe un protocolo para la generación de oscilaciones γ CA1 mediante la entrega de una estimulación tetánica a las estrato oriens en el corte de hipocampo.

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Protocolo

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el comité de ética animal Florey Instituto.

1. Configuración para cortar rebanadas de cerebro

1. Preparar una solución de corte compuesto por (mM) 125 La colina-Cl, 2,5 KCl, _CaCl2 0,4, 6 _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 _NaHCO3, 20 D-glucosa satura con gas carbógeno (95% O ₂ -5 % de CO ₂₎ y un líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa solución) de grabación consta de (mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 _CaCl2, 2 _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 10 D-glucosa, saturado con carbógeno. Coloque la solución de corte en el hielo para mantenerlo frío.
2. Congelar aproximadamente 400 ml de la solución de corte y mezclar junto con 100 ml de solución de corte no congelada para crear una suspensión de hielo. Burbuja con carbógeno (95% O ₂ -5% de CO ₂₎ a un flujo de aproximadamente 0,5 L / min a través de pequeños cAliber tubo o de vidrio sinterizado para producir un flujo constante pero suave de burbujas.
3. Preparar un vaso de precipitados de 250 ml con un inserto de malla de nylon elevada sobre la que se colocarán los cortes de cerebro. Rellenar con LCRa para cubrir la malla de aproximadamente 2 cm y burbuja con carbógeno, asegurando que las burbujas no interrumpen directamente el área del sector sostiene. También es importante que no haya burbujas de aire en la malla de nylon, por lo que si están presentes los eliminan. Esta será la cámara de retención y se mantiene a temperatura ambiente (20 - 25 ° C).
4. Layout los instrumentos de disección incluyendo un gran par de tijeras, un pequeño par de tijeras, pequeños y grandes espátulas micro y parejas grandes y pequeños de fórceps y relajarse en hielo. Coloque el bloque de corte de tejido vibratome sobre hielo en un cuadrado de papel de aluminio. Obtener 2 piezas de 6 cm de papel de filtro, una cuchilla de afeitar sola punta, y un vaso de precipitados de 25 ml llena con la suspensión de solución de corte también.
5. Llene un segundo recipiente con hielo, y poner un pedazo de tejido paper en el hielo y colocar una placa de cultivo de 12 cm en la parte superior. Llene la placa de cultivo con el corte de solución de suspensión de hielo y burbujas con carbógeno. Este es el contenedor en el que se realizará con la disección del cerebro.
6. Prepare el vibratome. Eliminar una hoja de afeitar de doble filo fresco (use una hoja fresca cada vez) de su envoltorio y rociar con etanol al 80% de agua desionizada a continuación. Cortar un 3 ml pipeta de transferencia de plástico en el punto donde comienza a disminuir. Esto se utiliza para transferir rodajas de cerebro. Doble un 27 G aguja en la base en aproximadamente 45 ° y se unen a una jeringa de 1 ml. Esto será utilizado para manipular rebanadas durante el corte.

2. Cortar las rebanadas del cerebro

1. Anestesiar un ratón (P16 - P18) con un 2% de isoflurano o un método aprobado a nivel local. Después de la inducción, decapitar al animal con un gran par de tijeras y colocar la cabeza en la placa de cultivo de 12 cm que contiene burbujeado suspensión solución de corte. La suspensión debe sumergir totalmente la cabeza deenfriamiento rápido.
2. Mantenga la parte delantera de la cabeza con una mano el pelado de la piel y el tejido conectivo hacia adelante hacia la nariz. Utilizando las pequeñas tijeras cortar el tejido conectivo para revelar el cráneo subyacente. A continuación, retire los músculos que recubren cara dorsal del cráneo y el cuello.
3. Retire el cerebro del cráneo fijando primero la parte frontal del cráneo con las grandes pinzas y luego hacer dos cortes laterales a través del hueso de cada lado del agujero occipital utilizando las tijeras pequeñas (Figura 1, cortes etiquetados A1 y ​​A2).
   1. Haga otro corte entre los ojos (justo anterior del bregma) (Figura 1, corte la etiqueta B) luego cuidadosamente cortado a lo largo de la sutura sagital anterior y reflejar las secciones del cráneo corte para revelar el cerebro (Figura 1, corte C marcado).
   2. Utilice la espátula para sacar el cerebro y el lugar en una placa de cultivo. Tenga en cuenta el crannervios ial en la cara inferior del cerebro que tendrá que ser cortadas, esto se puede hacer con la espátula micro tamaño más pequeño. Usando la espátula más grandes transfieren el cerebro para el vaso de precipitados de 25 ml lleno con la suspensión de solución de corte.
4. Preparando el hemisferio cerebral para cortar.
   1. Coloque un pedazo de papel de filtro 6 cm en la parte inferior de una placa de cultivo fresco luego rellenar con lechada fresca solución de corte y de la burbuja. Utilice la espátula grande para colocar el cerebro, con el lado ventral hacia abajo, sobre el papel de filtro. Tome una hoja de afeitar nueva y limpia solo filo y cortar el cerebro para eliminar el cerebelo, a continuación, hacer un corte a lo largo de la línea media para separar el cerebro en dos hemisferios.
5. Preparación del bloque de tejido vibratome.
   1. Tome el bloque de tejido vibratome fría, secar la superficie y colocar una gota de pegamento de cianoacrilato en el medio y extender uniformemente con el tamaño aproximado del cerebro. Utilice la pequeña espátula para manipular uno de lahemisferios cerebrales sobre la espátula grande micro por lo que el lado medial del cerebro está en el suelo.
   2. Toque el borde de la espátula en la interfaz del cerebro en la segunda pieza de papel de filtro para eliminar la mayor cantidad de la solución posible. Deslice el cerebro de los más grandes espátula utilizando la espátula pequeña para guiarla en la cola.
   3. Asegure el bloque de corte en la cámara vibratome y llenar la cámara con lechada de solución de corte y de la burbuja, lo que garantiza que el cerebro está completamente inmerso. Gire el bloque de corte por lo que la parte ventral del cerebro se enfrenta a la hoja.
6. Cortando el cerebro.
   Nota: Cada vibratome es única así que siga las instrucciones del fabricante.
   1. Ajuste el grosor de corte de 450 m, y garantizar la cuchilla está vibrando mientras se mueve a través del cerebro a una velocidad de aproximadamente 0,3 mm / s. Cortar por completo a través del cerebro desde la parte ventral a la superficie cortical, esto producirá cerebro rebanadas sagital enteros que pueden Be utilizado para registros electrofisiológicos. Rebanadas serán producidos lateralmente a medialmente y típicamente 3 - 4 rebanadas se pueden cortar de cada hemisferio.
   2. Si la base de los ascensores rebanada utilizar la inclinación 27 G aguja suave presión el corte hacia abajo. Como se corta cada rebanada, utilice la pipeta de transferencia para moverlo a la plataforma en la cámara de contención en el que son viables para un máximo de 8 horas.

3. extracelulares Electrofisiología Grabaciones

1. Montaje de la rebanada en la cámara de grabación.
   1. Usando la pipeta de transferencia, coloque una rebanada de cerebro en una cámara de grabación sumergida perfundido con LCRa que fluye a 1 - 2 ml / min y se calienta a 32 ° C. El LCRa utilizado para grabaciones difiere de la de la cámara de retención como la concentración de Mg ²⁺ se incrementa de 2 mM a 4 mM.
   2. Asegure la rebanada con un "arpa" (acero inoxidable semi circular con cadenas de nylon estirados a través de 2 - 3 mm de separación). Lugarel arpa de modo que las cadenas corren paralelas CA1. Aumentar la velocidad de la perfusión a 8 - 10 ml / min a 32 ° C.
2. Bajo un microscopio de disección lugar un electrodo de estimulación y un electrodo de registro (electrodo de vidrio lleno con la solución de grabación LCRa) en la superficie de la stratum radiatum de la CA1 (Figura 2A). Coloque el electrodo de estimulación primero y luego colocar el electrodo de registro.
3. Estimular el Schaffer colaterales con un 120 - 150 mu amplitud y 0,1 ms pulso de prueba de duración y observar el campo de post sináptica excitatoria potencial (fEPSP) forma de onda resultante para determinar la salud rebanada (Figura 2B). Los electrodos de estimulación y registro pueden necesitar ser movido en la rebanada de aproximadamente 50 - 100 micras de la superficie de la rebanada para obtener un fEPSP grabación con una pequeña volley fibra y gran amplitud. La garantía Schaffer evocó fEPSPs son estereotipadas y proporcionan un buen indicador de la salud de la rebanada. Healthy rebanadas típicamente muestran una volea fibra para fEPSP relación de amplitud inferior a 0,3.
4. Reposicionamiento de los electrodos.
   1. Usando un microscopio de disección, mover el electrodo de estimulación a la mitad de los estrato oriens y mover el electrodo de registro a la capa de células piramidales tan cerca del electrodo de registro como sea posible, como se muestra en la Figura 3A. Los electrodos de estimulación y registro pueden necesitar ser empujado en la rebanada de aproximadamente 50 - 100 micras de modo que la respuesta de amplitud fEPSP a la 120 - 150 mu pulso de prueba es de aproximadamente 1 mV.
5. Generación de oscilaciones γ.
   1. Para generar oscilaciones γ estimulan el tejido con un tren de pulsos de 20 x 0,1 mseg entregados a 200 Hz. Este estímulo tetánica puede dar respuestas reproducibles cuando se entrega cada 5 minutos.
6. Utilice los siguientes parámetros de grabación.
   1. Escala la ganancia de la señal de salida para que coincida con el voltaje de entrada delel convertidor de analógico a digital. Asegúrese de que la señal máxima esperada excursión utiliza un mínimo de 30% del rango de tensión de entrada. Tenga cuidado al ajustar las ganancias a alto como señales pueden recortar. El ancho de banda típica necesaria para grabaciones de campo es de 500 Hz con acoplamiento de CA a 0,1 Hz para eliminar la deriva de línea base.
   2. Digitalizar al menos 4-5 veces más rápido que la frecuencia de corte del filtro de paso bajo para evitar el aliasing de señales.
7. Análisis de los datos.
   1. Alto de paso de datos de filtro de 5 Hz para eliminar cualquier cambio de línea de base. Identificar los picos utilizando un umbral derivado, con una separación mínima caso de 10 ms, un tiempo de evento típico a pico y el intervalo de regresión de 7 ms, un umbral de ~ 100 mV / mseg, y un valle de separación del 100%. Calcular la latencia como el tiempo tomado para la primera espiga identificado que se produzca después del final del artefacto de estimulación. Este análisis permite la caracterización del número de picos, latencia, intervalo inter-evento, y la duración calcula comode la siguiente manera:
   2. Calcular el número de espigas como se determina el número total de espigas por oscilación para cada barrido.
   3. Calcular la latencia de oscilación. Para cada oscilación, restar el momento de la primera espiga identificado desde el extremo del artefacto de estimulación.
   4. Calcule el intervalo entre eventos promedio (ISI). Determinar el período de tiempo entre múltiples picos detectados y media.
   5. Calcular la duración de oscilación. Mida el tiempo entre el primer y último pico detectado dentro de cada oscilación.

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Resultados

Estimulación tetánica de los estrato oriens generado robustos y reproducibles oscilaciones γ (35,4 ± 2,2 Hz), véase la Figura 3B. Para demostrar que las oscilaciones se generaron dentro de la red local de CA1 las entradas de CA3 fueron separadas por el corte de la rebanada en la región CA2 usando un doblado 32 G aguja. Las propiedades de oscilación en las rodajas cortadas no difieren de las rodajas cortadas (p = 0,85; corte rebanadas 6,16 ± 1,1 puntos, n = 6; sin cortar rebanadas 5,89 ± 0,8 pun...

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Discusión

Un método robusto para generar CA1 oscilaciones γ en rodajas de cerebro agudas se describe. Las oscilaciones generadas surgen de un circuito local de permitir una mejor oportunidad para el control y la comprensión de la base neurofisiológica de las oscilaciones de la red ^12. Receptores AMPA, receptores GABA _A, I _h y tipo T Ca ^{2 +} canales son todos necesarios para oscilaciones γ en este modelo. Mientras que las oscilaciones CA1 locales descritos aquí pueden ser generados ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288)	Sigma-Aldrich	Z3777
Biuculline	Sigma-Aldrich	14340
6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX)	Sigma-Aldrich	C127
Nickel	Sigma-Aldrich	266965
Carbamazepine	Sigma-Aldrich	C4024
(2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV)	Tocris Bioscience	0105
Retigabine	ChemPacific	150812-12-7
Choline-Cl	Sigma-Aldrich	C1879-5KG
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638-250G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297-250G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
CaCl2 • 2H2O	Sigma-Aldrich	223506-500G
MgCl2 • 6H2O	Sigma-Aldrich	M2670-500G
Electrode glass	Harvard Apparatus	GC150F-10
Concentric bipolar stimulating metal electrode	FHC	CBBPF75
Digital Isolator	Getting Instruments	Model BJN8-9V1
Model 1800 amplifier	A-M systems	Model 1800 amplifier
Digitizer	National Intruments	NI USB-6211
Vibrotome	Leica	VT1200s