La clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5

Resumen

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

Resumen

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

Introducción

Para aplicaciones terapéuticas de genes es de gran importancia para evitar efectos secundarios citotóxicos e inmunogénicas causadas por la expresión de proteínas virales, el propio transgén o por las proteínas virales entrantes. Los vectores de adenovirus (ADV) se utilizan ampliamente para introducir ADN extraño en una amplia variedad de células para investigar el impacto de la expresión transgénica ^1,2. La versión más avanzada de AdV está representado por los vectores de adenovirus de alta capacidad (HCAdV) que carecen de todas las secuencias de codificación virales ^3,4 y ofreciendo con ello una capacidad de envasado de hasta 35 kb combinados con baja inmunogenicidad y baja toxicidad ^5-8. Debido a su alta capacidad de envasado que permiten la entrega de grandes o múltiples transgenes utilizando una dosis única vector. Por lo tanto, representan una herramienta valiosa para la comunidad de investigación.

En contraste con el primer o segundo AdV generación que carece de los genes tempranos E1 y / o E3 que se pueden producir fácilmente usando kits comerciales, vector producción de la construcción del genoma y virus de HCAdV es más compleja. El sistema para la construcción de genomas HCAdV se basa en la pAdFTC plásmido que lleva un genoma HCAdV desprovisto de todas las secuencias de codificación virales y el plásmido lanzadera pHM5 ^9-12. Cualquier gen de interés de hasta 14 bases kilo (kb) se puede clonar en el pHM5 vector lanzadera en la que el sitio de clonación múltiple está flanqueada por el reconocimiento / sitios de las endonucleasas de la vivienda escindir PI Sce I y I-Ceu I. Por lo tanto, un gen clonado de interés puede ser liberado por PI- Sce I y consecutiva I- Ceu I digiere para la inserción dirigida posterior en los mismos sitios de restricción presentes en el genoma HCAdV contenida en el plásmido pAdFTC. En pAdFTC el sitio de inserción del transgén situado entre el PI- Sce I y I-Ceu I división sitios está flanqueado por ADN de relleno y las secuencias no codificantes adenovirales requeridos para el envasado del genoma tales como repeticiones terminales 5 'y 3' invertida (ITR)en ambos extremos y la señal de empaquetamiento aguas abajo de la 5'ITR. El ADN de relleno adicional proporciona tamaño óptimo del genoma HCAdV final en un intervalo de 27 a 36 kb para asegurar el empaquetamiento eficaz durante la producción de virus. Desde pAdFTC es un plásmido grande con hasta 45 kb (dependiente del tamaño del transgén insertado) y el uso de endonucleasas de la vivienda con los sitios de reconocimiento de ADN largas comparativamente exhibe una fuerte unión a ADN, varios pasos de limpieza son necesarios durante la transferencia del transgén de pHM5 a pAdFTC. Se recomienda un manejo cuidadoso evitando fuerzas de cizallamiento.

Las ITR del genoma HCAdV están flanqueadas por No me sitios de reconocimiento de enzimas de restricción localizados directamente arriba de la 5'ITR y aguas abajo del 3'ITR ^12. Por lo tanto, HCAdV puede ser puesto en libertad por no digiero para la posterior transfección del genoma viral en la línea celular productora HCAdV. Tenga en cuenta que el uso de la enzima de restricción Not I para relfacilidad del genoma viral de la pAdFTC plásmido implica que el transgén insertado carece de sitios de reconocimiento Not I de ADN. Las células productoras basadas en células HEK293 (116 células) expresan de forma estable la recombinasa Cre. Para la amplificación del virus 116 células están coinfectados con un virus auxiliar (HV) proporcionar todos los genes AdV necesarias para la replicación y el embalaje en trans ^3,4. El HV es un AdV primera generación con una señal de embalaje floxed que se elimina durante la amplificación del virus por la recombinasa Cre expresada en células 116 ^4. Esto asegura que los genomas predominantemente HCAdV contienen una señal de embalaje intacto se encapsidados.

Pre-amplificación de la HCAdV se lleva a cabo mediante la realización de pasos pases seriados en 116 células cultivadas en superficies en placas de cultivo de tejidos. Después de cada paso de partículas víricas se liberan de las células infectadas mediante la realización de tres pasos de congelación-descongelación consecutivas. Con cada paso de un número creciente de células se infectan con1/3 del lisado celular del paso anterior. Finalmente lisado procedente se utiliza el último paso de pre-amplificación para infectar células productoras se cultivan en suspensión en un matraz de agitación para la amplificación a gran escala. Los viriones se purificaron a partir de las células en suspensión mediante la realización de ultracentrifugación en un gradiente de densidad de cloruro de cesio ^4,12. Con este procedimiento las partículas vacías y las partículas totalmente ensamblados se separan en dos bandas distintas. Para concentrar aún más el HCAdV partículas se lleva a cabo una segunda etapa de ultracentrifugación no gradual. Posteriormente se recoge la banda resultante que contiene el HCAdV y se dializa frente a un tampón fisiológico. Preparaciones de vector final se caracterizan con respecto a los números absolutos de partículas virales, partículas infecciosas y los niveles de contaminación HV. Partículas virales absolutos pueden ser determinados mediante la lisis de las partículas virales y midiendo la absorbancia a 260 nm o mediante la realización cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) ^12. La infectividad del purpartículas de virus ficados pueden ser determinados por los genomas de medición HCAdV qPCR presentes dentro de las células infectadas 3 hr después de la infección.

Protocolo

1. Construcción del recombinante HCAdV Genomas basado en el plásmido pAdFTC

Nota: Todos los plásmidos se han descrito anteriormente ^11,12 y están disponibles a petición. El procedimiento de clonación se muestra esquemáticamente en la Figura 1.

1. Clonar un gen de interés (GOI) incluidos el promotor y señal de poliadenilación (pA) en la lanzadera de plásmido pHM5, usando una estrategia de clonación de elección, para generar pHM5-GOI.
   NOTA: Como pAdFTC es un plásmido relativamente grande, se recomienda protocolos de preparación de plásmido clásicos para evitar sheering del ADN plasmídico mediante el uso de kits comerciales de purificación de plásmido que se basan en las membranas de sílice. I- Ceu I y PI -Sce Ato fuertemente al ADN y cambiar la movilidad electroforética de ADN digerido. Por lo tanto, se requiere una extracción con fenol-cloroformo y precipitación con EtOH (paso 1.3) antes de la electroforesis en gel de agarosa.
2. Recopilación de 20 g de pHM5-GOI y 10 g de pAdFTC por I-CeuI (10 U) durante 3 horas a 37 ° C en un volumen total de 100 l para linealizar plásmidos (~ 2,8 kb + GOI secuencia ORF y ~ 31kb, respectivamente).
3. Purificar plásmidos linealizados utilizando extracción con fenol-cloroformo, seguido de etanol (EtOH) precipitación ^13.
   1. Añadir 100 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y mezclar suavemente invirtiendo el tubo varias veces. Centrifugar durante 2 min a 15.000 x g.
   2. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo, añadir 20 l de acetato de sodio (pH 5, 3 M) y 400 l de hielo frío EtOH (99,8%) y mezclar la suspensión vigorosamente. Centrifugar durante 10 min a 15.000 x g.
   3. Eliminar el sobrenadante, añadir 300 l de EtOH al 70% y centrifugar durante 2 minutos a 15.000 x g. A continuación, retire el sobrenadante y sedimento de ADN se seque al aire. Disolver el precipitado en 10- 20 l de dH ₂ O. Haga sedimento de ADN no se seca demasiado tiempo, ya que será más difícil obtener ADN en solución.
4. Digesto I-Ceu I -digested pHM5-GOI y el plásmido pAdFTC desde el paso 1.3) durante al menos 3 horas o O / N con la enzima de restricción PI -Sce I (10 U) a 37 ° C en un volumen total de 50 l y posteriormente purificar I -CeuI y PI -Sce I digirieron los plásmidos utilizando extracción con fenol-cloroformo seguido de precipitación con EtOH (véase el paso 1.3). Disolver ADN en 20 l de nucleasa libre dH ₂ O.
5. Plásmido separada backbone pHM5 (2,8 kb) y el Gobierno de la India (del paso 1.4) en un gel de agarosa preparativa y gel-purifican el Gobierno de la India utilizando una de gel comercial y PCR kit de limpieza. Un gel de agarosa al representante de la digestión se muestra en la Figura 2A.
6. Desfosforilar I- Ceu I y digerido I-PI -Sce pAdFTC (del paso 1.4) con fosfatasa alcalina intestinal de ternera CIP (10 U) durante 1 hora a 37 ° C en un volumen total de 25 l y purificar el plásmido desfosforilado pAdFTC por extracción con fenol-cloroformo y posterior EtOH precipitation (paso 1.3). Eluir el ADN en 20 l de nucleasa libre dH ₂ O.
7. Realizar la electroforesis en gel analítica a partir de una alícuota de la plásmido desfosforilado pAdFTC (del paso 1.6) y el GOI-fragmento purificado (procedente de la etapa 1.5) para analizar si digiere están completos y los tamaños de los fragmentos esperados son correctos (~ 31 kb para pAdFTC linealizado ).
   Nota: El tamaño del GOI es variable dependiendo del tamaño de la casete de expresión del transgén. Estimar las concentraciones relativas de los respectivos fragmentos para ligación posterior. Un gel de agarosa al representante de fragmentos purificados se muestra en la Figura 2B.
8. Configurar la reacción de ligación en un volumen total de 20 l usando 400 U de ADN ligasa de T4 y una relación molar de vector para insertar de 1: 3.
   NOTA: En concordancia con el gel de agarosa se ​​muestra en la Figura 2B por lo general ligar en un volumen total de 20 l con 2 a 6-l vector, de 8 a 12 linsertar y 400 U de T4 ADN ligasa. A medida que la concentración de ADN es generalmente baja después de varios pasos fenolización, utilizar tanto ADN como sea posible de modo que ningún adicional H ₂ O tiene que ser añadido para alcanzar el volumen final de 20 l. Ligar a 16 ° CO / N y posteriormente realizar la extracción con fenol-cloroformo seguido de precipitación con EtOH (paso 1.3).
   1. Eluir el ADN en 15 l de nucleasa libre de dH ₂ O y digerir la reacción de ligación se purificó con la enzima de restricción SwaI (10 U) durante 2 horas a 25 ° C en un volumen total de 20 l. A continuación, concentrar y purificar el ADN, mediante la realización de la extracción con fenol-cloroformo seguido de precipitación con EtOH (paso 1.3). Eluir el ADN en 10 l de nucleasa libre dH ₂ O.
9. Transformar 2 l de la SWA purificado digerido producto de ligación mediante electroporación en DH10B o DH5a electrocompetentes E. coli y seleccionar clones de 16 a 24 horas a 37 ° C sobre que contiene la ampicilina-LBplacas (50 mg / ml de ampicilina). Seleccionar 5- 10 clones y preparar mini-preparaciones de ADN plásmido utilizando lisis alcalina seguido por extracción con fenol-cloroformo y precipitación con EtOH posterior (paso 1.3) ^13.
10. Realizar una digestión analítica de mini-preparaciones de plásmido seguido de electroforesis en gel de agarosa para comprobar el tamaño de fragmentos de ADN. Enzimas de restricción sugeridos son, por ejemplo I-Ceu I y PI Sce I liberando el inserto, Spe I o HincII (Figura 2C).
11. Amplificar un clon correcto en medio LB que contiene ampicilina (50 mg / ml de ampicilina) y llevar a cabo una preparación midi- o-maxi plásmido utilizando cualquier kit de purificación de plásmidos disponibles comercialmente.

2. La liberación de HCAdV-genomas de pAdFTC plásmido y preamplificación de HCAdV Vectores en la Línea 116 Productor celular

1. Digerir 20 mg del plásmido adenoviral de producción basados ​​en pAdFTC contiene el GOI clonado a partir del paso 1.11) enun volumen total de 100 l usando Not I (20 T) a 37 ° C durante> 2 horas y realizar la extracción con fenol-cloroformo dos veces seguidas por precipitación con EtOH. Disolver en 20 a 30 l dH ₂ O. estéril
2. Compruebe una alícuota de 1:10-GOI-ADN digerido pAdFTC diluida por electroforesis en gel. Un fragmento de 9 kb para el esqueleto del plásmido y, dependiendo del tamaño de la GOI, un segundo fragmento de ADN para el genoma HCAdV (tamaño: 28- 36 kb) es detectable.
   NOTA: Un ejemplo representativo de la No he digerido se muestra en la Figura 2D. ADN linealizado se puede almacenar durante varios días a 4 ° C o -20 ° C a durante varias semanas.
3. Antes de proceder con el protocolo, asegúrese de que el virus auxiliar AdNG163R-2 ha sido amplificada ^4.
   Nota: Las células transfectadas con pAdFTC derivada vectores HCAdV son organismos modificados genéticamente clasificados como nivel de bioseguridad 2 (BSL-2), por favor utilice la contención y manejo de desechosmedidas, incluido el equipo de protección personal, y trabajar bajo BSL-2 campanas de flujo laminar.
4. Cultura 116 células en medio MEM de Eagle suplementado con 10% de FBS y la higromicina B (100 mg / ml). Semilla de paso bajo (por debajo de pasaje 10) 116 células (~ 0,4 x 10 ⁶ células) en un 60 mm placa de cultivo tisular un día antes de la transfección para que lleguen a 50- 80% de confluencia el día siguiente.
5. Transfectar linealizado genoma HCAdV de la etapa (2.1) en 116 células mediante el uso de métodos, tales como transfección con fosfato de calcio u otros reactivos de transfección disponibles comercialmente (Figura 3A). 16- 18 horas después de la transfección, retire con cuidado el medio, añadir 3 ml de medio fresco (MEM, 5% de SFB) e infectar a las células con el HV AdNG163R-2 ⁴ aplicando 5 unidades de transducción (TU) por célula (ya que una confluencia de 60 mm placa de cultivo de tejidos contiene ~ 3.2x 10 ⁶ células, añadir ~ 1.6x 10 ⁷ TU de HV).
   1. Mueva suavemente el plato cada 20 minutos durante la primera hora después de la infección agarantizar una distribución igual HV. Cultivar las células infectadas a 37 ° C y 5% de CO _2. En caso de efecto citopático amplificación del virus eficiente (CPE) causada por la replicación del virus (células se redondean y vagamente unidos o separados de la placa de cultivo de tejidos) es observable 48 horas se observa después de la infection.If CPE anterior la cantidad de HV tiene que ser reducido. Si CPE comienza más tarde, más virus auxiliar tiene que ser utilizado.
6. Células de la cosecha incluyendo sobrenadante 48 horas después de la infección por el lavado de las células de la placa de cultivo utilizando el medio de cultivo. Las células que se encuentran suspendidas en el medio de cultivo se llaman pasaje 0 (P0). Dividir P0 en dos fracciones.
   1. A partir de 0,5 ml de las células desprendidas giran hacia abajo las células durante 3 min a 2.000 xg y eliminar medio del sedimento celular, que se utiliza después para aislar ADN genómico (ADNg) para el análisis basado qPCR del proceso de amplificación. Sedimentos celulares Almacenar a -20 ° C hasta su posterior procesamiento.
   2. De 2.5ml de las células desprendidas liberar partículas virales por congelación (a -80 ° C o en nitrógeno líquido) y descongelación (a temperatura ambiente o en un baño de agua a 37 ° C) las células se resuspendieron en que su medio de tres a cuatro veces. Esta fracción es de llamada lisado de P0.
7. Asegurar que las placas de cultivo de tejidos con 116 células que se cultivan al 90- 95% de confluencia utilizando MEM-medio suplementado con FBS (10%) e higromicina B (100 mg / ml) y HV están disponibles para los siguientes pasos pases.
8. Mezclar 1 ml de medio fresco (MEM, FBS al 5%) con 2,5 ml del lisado del paso anterior (paso 2.6.2) hasta un volumen final de 3,5 ml, añadir HV aplicar 2 TU por célula (ya que un tejido 60 mm placa de cultivo a una confluencia de 90- 95% contiene ~ 3.2x 10 ⁶ células, añadir ~ 6.4x 10 ⁶ TU de HV). (Figura 3B). Retirar con cuidado el medio de un plato 60 mm de 116 células y añadir la mezcla viral a las células. Repita el paso 2.6) - 2.8) dos veces para obtener lisados ​​de paseedades P1 y P2.
9. Mezclar 17,5 ml de medio fresco (MEM, 5% de FBS) con el 2,5 ml del lisado de P2 y añadir HV aplicar 2 TU por célula (ya que un 150 mm placa de cultivo de tejido a una confluencia de 80- 100% contiene 10 ~ 2x ⁷ células, añadir 10 ~ 4x ⁷ TU del HV). Retire el medio de un plato de 150 mm de 116 células e infectar las células con la mezcla viral. Cultivar las células infectadas a 37 ° C y 5% de CO _2.
10. Las células de la cosecha después de la infección 48h como se describe en el paso 2.6) para obtener el paso P3 (Figura 3B).
    1. Repita el paso 2.6) 1.
    2. Desde el restante 19,5 ml de liberación P3 partículas virales de las células resuspendidas por congelación y descongelación tres a cuatro veces. Esta fracción es de llamada lisado de P3.
       Nota: Algunos vectores finalmente pueden requerir pasos adicionales en 150 mm platos hasta que se amplifican lo suficiente. Por lo tanto la efectividad del proceso de pre-amplificación debe ser monitoreado durante el pase de serieenvejecimiento. análisis basado qPCR del proceso de amplificación puede llevarse a cabo como se describe en la sección 3 (véase también la figura 4A). Pre-amplificación de HCAdV que lleva un casete de expresión para la proteína verde fluorescente (GFP) puede ser fácilmente evaluada mediante la observación de la señal flourecscent GFP usando un microscopio de fluorescencia (Figura 4B).

3. Seguimiento del proceso de amplificación usando-cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) (véase también la figura 4A).

1. Aislar gDNA de sedimentos celulares de cada paso de la preamplifaction (pasos 2.6) - 2,10) utilizando cualquier kit de aislamiento de ADN comercial para aislamiento de gDNA de células cultivadas u otro método de elección. Para obtener resultados óptimos PCR utilizar gDNA lo más fresco posible. De lo contrario gDNA se puede almacenar a -20 ° C hasta su uso posterior.
2. Para determinar el número de genomas HCAdV presente en las células del paso respectivo mediante análisis de qPCR generar una curva estándar usando 10 ^{1 <}/ sup> - 10 ⁹ copias de un plásmido que lleva el GOI contenidas en el genoma HCAdV.
3. Analizar la misma cantidad de gDNA de P0- P3 (paso 2.6- 2.10) aplicar qPCR usando 400 nM de cebadores específicos para el GOI contenidas en el genoma HCAdV. Para llevar a cabo las instrucciones de seguimiento del fabricante qPCR de los respectivos productos químicos qPCR. Ajuste el programa de qPCR de la siguiente manera: pre-incubación a 95 ° C durante 10 min, la amplificación en 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 55- 60 ° C durante 15 s y 72 ° C durante 20 s. Sobre la base de la curva estándar el número de genomas HCAdV en la reacción se puede interpolar.

4. Gran Escala La amplificación de HCAdV vectores en 116 células que crecen en suspensión

1. Añadir 900 ml de precalentado (37 ° C) MEM fresco suplementado con FBS al 10% e higromicina B (100 mg / ml) en un matraz de 3 l de cultivo spinner (Figura 3B).
2. Retire medio de al menos 10 150 mm platos individuales de cultivo de tejidos con 116 células cultivadas a una confluencia del 90% 100 y al ras de las células con 10 ml de fresco precalentado (37 ° C) suplementado con FBS MEM (10%) y la higromicina B (100 mg / ml) utilizando una pipeta serológica. Pipeta arriba y abajo varias veces para obtener una suspensión celular homogénea. Transferencia de células directamente en el matraz spinner que ya contiene 900 ml del paso 4.1).
   Nota: No utilice tripsina / EDTA, ya que puede afectar negativamente el crecimiento de células en suspensión. Después de la eliminación del medio de transferir inmediatamente las células en el matraz spinner. No manipule más de dos placas de cultivo de tejido a la vez. El más largo el tiempo de espera después de la adición de medio fresco más difícil será independiente de las células de la placa de cultivo tisular.
3. Para asegurar el crecimiento celular óptimo matraz spinner Incubar en un agitador magnético en una incubadora de cultivo de tejidos durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO _2. Ajustar el agitador magnético a 70 rpm para evitar la unión de las células a las superficies de vidrio.
4. Monitorear el crecimiento celular en frasco de cultivo spinner para examinar si las células cultivadas en el frasco de cultivo spinner son viables y si crecen a cantidades suficientes. Cada vez antes de añadir medio fresco de transferencia de 2 ml del biorreactor a un 60 mm placa de cultivo tisular. Observar la morfología celular bajo un microscopio.
   Nota: Las células que forman grumos que flotan en el medio de cultivo indican crecimiento y la viabilidad (véase también la Figura 4C) óptimo. Después de 24 hr forman colonias en la superficie de la placa de cultivo tisular. 30- 50% de confluencia indica la densidad óptima.
5. 24 horas después de la creación de la frasco de cultivo centrifugador añadir 500 ml de medio fresco (MEM, 10% FBS), complementado con higromicina B (100 mg / ml). 24 horas más tarde repetir este paso.
6. 72 hr después de configurar el cultivo giratorio, añadir 1.000 ml de medio MEM fresco (10% FBS) con higromicina B (100 mg / ml) dando como resultado un volumen total de 3 l de suspensión celular.
7. 24 horas después de llegar a avolumen de tres litros, cosecha 116 células en suspensión por centrifugación durante 10 min a 500 xg a TA. Eliminar el sobrenadante. Mantenga el frasco de cultivo spinner vaciado bajo el capó de cultivo de tejidos.
8. Resuspender los sedimentos celulares en MEM fresco suplementado con 5% de FBS pipeteando arriba y abajo sobre 8- 10 veces para obtener una suspensión celular homogénea. El volumen de medio depende de si el lisado procedente de la Etapa 2.10) 2. (19,5 ml, véase paso 4.8) 1. la opción a) o una acción viral purificada de HCAdV desde el paso 5.9) 2. (varios l depanding el título viral, ver el paso 4.8) 2., la opción b) se utiliza para la infección de las células. Utilice un volumen total de 150 ml.
   1. Opción A: Para la infección de 116 células en suspensión con lisado de P3 (amplificación primaria) células de transferencia desde el paso 4.8) a una botella de 250 ml de almacenamiento equipado con una barra estéril de agitación magnética o un matraz de agitación a pequeña escala de 250 ml y las células con la co-infectar virus dentro del lisado de P3 (paso 2.10.2) y 2 TU de HV por célula. Suponiendo una densidad de 3x10 ⁵ células por ml, el número total de células es 9x 10 ⁸ células. Así agregar 1.8x 10 ⁹ TU del HV.
   2. Opción B: Para la infección de 116 células en suspensión con Stock viral purificada, las células de transferencia desde el paso 4.8) a una botella de almacenamiento 250 ml equipado con una barra estéril de agitación magnética o un matraz de agitación a pequeña escala de 250 ml y co-infectar las células con las partículas virales 100 por célula de HCAdV anteriormente purificado (procedente de la etapa 5.9) 2.). Por lo tanto añadir 9x 10 ¹⁰ VP de acuerdo con el título físico (medido por absorbancia a 260 nm; paso 6) de la HCAdV purificada y 1.8x 10 ⁹ TU del HV.
9. Se agita la mezcla de células-virus de SEP 4.8.1) o 4.8.2) en en un agitador magnético en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 2 horas a 60 rpm. Asegúrese de que la botella de almacenamiento no está completamente cerrada para permitir la circulación del aire.
10. 2 horas después de la infección transferir el volumen total de la mezcla de células de virus de nuevo en el 3 l spinner cultomatraz de ure y añadir 1.850 ml de fresco precalentado (37 ° C) MEM medio suplementado con 5% de FBS a un volumen total de 2 L y se incuban en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 48 horas a 70 rpm.
11. Cosecha células por centrifugación durante 10 min a 890x g a temperatura ambiente en 500 ml tubos de centrífuga. Retire el medio y volver a suspender las células sedimentadas en un volumen total de 28 ml de DPBS. Pipetear hacia arriba y abajo para obtener una suspensión celular homogénea. Congelar la suspensión de células de virus en nitrógeno líquido o a -80 ° C asegurándose de que la suspensión está completamente congelado. Almacenar la suspensión de células de virus a -80 ° C hasta el momento de comenzar la purificación de virus.

5. Purificación y Diálisis de HCAdV

1. Para preparar lisado viral de cloruro de cesio (CsCl) gradientes, congelar suspensión de células de virus desde el paso 4.11) en nitrógeno líquido y descongelación en un baño de agua a 37 ° C en cuatro ocasiones.
2. Centrifugar el lisado viral a 500 xg durante 8 min a RT y recoger el sobrenadante que contiene el HCAdV.
3. Para preparar soluciones de CsCl Ultracentrifugación como follows.Weigh 37,5 g (por 1,5 g / cm ^3), 33,5 g (por 1,35 g / cm ^3), y 31,25 g (por 1,25 g / cm ³⁾ de polvo de CsCl, respectivamente, y llenar con dH _{2 O} y 25 ml.
   1. Stirr hasta que la solución se vuelve filtro transparente y estéril las soluciones. Finalmente retire 1 ml de cada solución y pesar en una escala fina para comprobar wether la densidad es correcta. 1 ml debe ponderar 1,5 g, 1,35 y 1,25 g, respectivamente.
   2. Si la densidad es demasiado alta ajustar por adición gradual de pequeños volúmenes (mu l) de dH estéril ₂ O. Tras la adición de _dH2O medir la densitiy nuevo. Si es necesario añadir más _H2Od
   3. Repita el procedimiento hasta que la densidad es la correcta. Si la densidad es demasiado baja ajustarlo añadiendo una pequeña cantidad de polvo de CsCl. Filtro estéril de nuevo y comprobar la densidad. Si la densidad es demasiado alta ajustarlo por complementog _H2Od como se describe antes. Si la densidad es demasiado baja añadir mor CsCl, filtro estéril de nuevo y comprobar la densidad. Repita el procedimiento hasta que la densidad es la correcta.
4. Preparar paso gradientes de CsCl en seis tubos de ultracentrífuga claras. Con cuidado y lentamente pipetear soluciones de CsCl en los tubos utilizando el siguiente orden: 0,5 ml de 1,5 g / cm ³ solución de CsCl, 3 ml de 1,35 g / cm ³ solución de CsCl y 3,5 ml de 1,25 g / cm ³ solución de CsCl (Figura 2C) .
5. Superposición ~ 4,5 ml de sobrenadante aclarado vector del paso 5.2) en la parte superior del g / cm ^{3 capas} CsCl 1,25. Centrifugar los gradientes en una ultracentrífuga utilizando un columpio cabo rotor (SW-41) a 12 ° C durante al menos 2 horas a 226.000 xg (35.000 rpm) con una aceleración lenta y deceleración para HCAdV-genoma separado que contiene las partículas virales de partículas vacías y celular escombros.
   NOTA: En condiciones óptimas de una banda difusa de formes escombros celular en la parte superior de lalos tubos. A continuación se pueden observar de dos bandas blancas. La banda superior contiene partículas vacías mientras que la banda inferior es igual a la HCAdV (Figuras 2C y 5A).
6. Retirar con cuidado las capas de restos de células y las partículas vacías y recoger 1 ml de las bandas más bajas de cada tubo y virus de transferencia con una punta de pipeta limpia en un tubo de 50 ml estéril. Añadir un máximo de 24 ml de 1,35 g / cm ³ solución de CsCl a las partículas del virus recogidos y mezclar con cuidado.
7. Llenar los tubos de centrífuga con 1,35 g / cm ³ solución de CsCl-virus para el O superior y centrifugar / N (18- 20 h) a 226.000 xg (35.000 rpm) a 12 ° C en una ultracentrífuga usando un columpio cabo rotor (SW-41 ) con una aceleración lenta y desaceleración.
8. Recoger el HCAdV presente en la banda inferior prominente. Como banda superior potencial contiene partículas vacías eliminar las capas superiores de la parte superior con una pipeta (ver Figuras 2C y 5B) Luego quita el usi banda inferiorng de una pipeta.
9. Dializar las partículas del virus recogidos para el intercambio de búfer.
   1. Cortar una tira de tubos de diálisis (MWCO: 50000) de unos 8 cm de longitud, lávela con dH _{2 O} estéril durante tres veces. A continuación, cierre un lado del tubo de diálisis con una abrazadera de plástico y transferir el virus recogido desde el paso 5.8) en el tubo usando una pipeta de 1 ml. Evitar las burbujas de aire dentro de la tubería y cerrarla en el otro lado con un plástico cierres de diálisis abrazadera.
   2. Se dializa en 1 l de tampón de diálisis (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% de glicerol y 1 mM de MgCl ₂ en desionizada H ₂ O) durante 2 horas a 4 ° cwith agitación lenta. Tampón de diálisis Exchange con 2 l de tampón de diálisis y se dializa O / N a 4 ° C con agitación lenta. Alternativamente, puede utilizar un sucrosebuffer (NaCl 140 mM, 5 mM Na ₂ HPO ₄ x2H _{2 O,} mM KH sacarosa mM 1,5 ₂ PO _{4 y} 730, pH 7,8).
   3. Recoge partículas virales dializados desde el paso 5.9) 2. utilizando un 1 ml de pipette. Preparar múltiples alícuotas de pequeños volúmenes deseados (25- 100 l) y almacenar virus purificado a -80 ° C.

6. Medir la Titer física de Preparativos HCAdV finales por densidad óptica (DO)

1. Diluir 25 l de la preparación de vector final de la etapa 5.9) 2 con 475 l de tampón de lisis (Tris-HCl 10 (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0), 0,5% SDS)), agitar suavemente durante 20 min a RT y finalmente Centrifugar durante 2 min a TA a 15.000 x g.
2. Dado que los valores de absorbancia a 260 nm (A260) son generalmente bajos, medir la absorbancia cuatro veces con 100 l de sobrenadante y calcular el valor medio de las cuatro mediciones. Calcular el número de partículas virales por ml (vp / ml ^-1) utilizando la siguiente fórmula: vp / ml ^-1 = (A260 media) x (20) x (1,1 x 10 ¹²⁾ x (36 kb de tamaño / HCAdV en kb ).
   NOTA: Los resultados de un rendimiento típico de las partículas virales absolutos (titulación OD) se muestran en la Figura 7A . La experiencia demuestra, que el título OD sobreestima el número de partículas de virus. Partículas virales absoluto medido por OD pueden ser de 20 a 100 veces mayor que las partículas virales infecciosas medidos por Q-PCR. Para la medición más precisa de partículas HCAdV absolte e infecciosas, así como la contaminación HV por q-PCR consultar en el capítulo 7.

7. Medición total Partículas, Unidades Infecciosas del HCAdV y Niveles HV contaminación en la final Preparación del vector por qPCR. Un esquema del procedimiento de titulación se muestra en la Figura 6

1. Semilla células HEK293 en 6 ó 12 placas de cultivo tisular de modo que así células alcanzan 90% de confluencia en el día siguiente. Para determinar el número de partículas virales infecciosas (título infeccioso), infectar las células de un pocillo de una placa de múltiples pocillos con 1 l y un segundo bien con 10 l de virus purificado de la etapa 5.9) 3.
2. Las células de la cosecha después de la infección de 3 horas. Retire medio y agregar la tripsina para cubrir todo el bien e incubar a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 5 min. Enjuague fuera de las células con el tripsina usando una pipeta y centrifugar las células a 890 xg durante 3 min a TA.
3. Resuspender las células sedimentadas en 200 l de DPBS y lavarlos a fondo para eliminar (no-infecciosos) partículas libres de vectores. Centrifugar durante 3 minutos a 890 xg a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y resuspender sedimentos celulares en 200 l de DPBS fresco.
   Nota: Para la determinación precisa de la título infeccioso, es crucial para eliminar todas las partículas virales no infecciosas a partir de las superficies de las células mediante tratamiento con tripsina y lavado a fondo.
4. Para determinar el número de partículas virales totales (partículas infecciosas y no infecciosas las partículas = título física), la cosecha no infectados células HEK293 de dos pozos sin tripsina por lavado fuera de las células con su medio de cultivo utilizando una pipeta.
5. Centrifugar las células durante 3 min a 890 xg a TA. Deseche el medio y volver a suspender las células sedimentadas en 200 l de DPBS. Suañadir bsequently 1 l y 10 l de preparación HCAdV purificado directamente a las células, respectivamente. Utilice las células no infectadas como fondo, para garantizar las mismas condiciones para el aislamiento gDNA y posterior q-PCR.
6. Aislar gDNA a partir de células HEK293 derivados de pasos 7.3) y 7.5)
   1. Vortex células resuspendidas en 200 l de DPBS (paso 7.3 y 7.4) durante 3 s, añadir 200 l de solución de SDS. (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0), 0,5% SDS) y 20 l de proteinasa K (20 mg / ml) y la suspensión de vórtice durante 3 seg. Incubar 12- 16 horas a 55 ° C y agitar lentamente. A continuación, añadir 2 l de RNasa A (20 mg / ml) y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C.
   2. Añadir 350 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y se centrifuga durante 2 min a 15.000 x g. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y repita este paso una vez
   3. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo, se añaden 50 l de acetato de sodio (pH 5, 3 M) y 1 ml de hielo frío EtOH (99,8%) y mezclar la suspensión. CentriFUGE muestras durante 10 minutos a 15.000 xg para sedimentar el ADN genómico.
   4. A continuación, eliminar el sobrenadante, añadir 500 l de EtOH al 70% y se centrifuga durante 2 min a 15.000 x g. Eliminar el sobrenadante, añadir 500 l de EtOH al 70% y agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar durante 2 minutos a 15.000 x g.
   5. Eliminar el sobrenadante y sedimento de ADN se seque al aire. Hacer bolitas de ADN no seco durante mucho tiempo, ya que será más difícil de conseguir gDNA en solución. Resuspender el sedimento de ADN en 120 l de dH _{2 O} y se incuba durante ~ 1 hora a 37 ° C mientras se agita. Si la solución de ADN aparece viscosa, agitar durante varias horas a 37 ° C, o se incuba a 55 ° C durante ~ 1 hora.
7. Para determinar HCAdV-partículas infecciosas y HCAdV-partículas absolutas, generar una curva estándar de 10 ^{8 01 al 10} copias de un plásmido que lleva el GOI contenidas en el genoma HCAdV.
8. Determinar partículas totales y partículas infecciosas mediante el análisis de las mismas cantidades de ADNg de c infectados HEK293anas desde el paso 7.3) y 7.4) se aplican qPCR usando 400 nM de cebadores específicos para el Gobierno de la India que contiene el genoma HCAdV.
9. Ajuste el programa de PCR de la siguiente manera: pre-incubación a 95 ° C durante 10 min, la amplificación en 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 55 ° C durante 10 seg y 72 ° C durante 20 seg. Sobre la base de la curva estándar (paso 7.7), interpolar el número total de los genomas adenovirales en la reacción.
10. Calcular el número de genomas adenovirales en la preparación vector final utilizando el siguiente Formular: (Número de HCAdV / peso en ng de gDNA en la reacción) x (peso en ng de ADN de todas las células en el plato infectada virus / volumen en l) .
    NOTA: El rango típico de partículas virales infecciosas absolutos y los rendimientos son alrededor de 1x10 ⁷ -1x10 ⁸ viral partículas / l. Los títulos que son diez veces mayor o menor que mostró aquí se pueden considerar como normal. Títulos más altos sería una mejora. Con respecto a la relación de partic HCAdV absolutales a partículas HCAdV infecciosas, la experiencia muestra que aproximadamente 5- 10% de las partículas HCAdV absolutos son infecciosas (Figura 7A).
11. Para determinar los niveles de contaminación con HV, realice qPCR mediante la amplificación de una parte de la tarde gen adenoviral 3 (L3) presente en el genoma HV. Utilice un plásmido que lleva el gen adenoviral tarde 3 (L3) para generar una curva estándar (paso 7.7).
12. En esta reacción aplicarán 400 nM de la L3 cebadores adelante 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'y L3 inverso 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3', junto con 300 nM de la sonda-L3 específica 5'-Fam-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-Tamra-3 '.
13. Ajuste el programa de PCR de la siguiente manera: pre-incubación / activación a 95 ° C durante 10 min, la amplificación durante 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min. Utilice cualquier sonda universal de PCR Mastermix para la reacción qPCR. Sobre la base de la curva estándar (paso 7.7), calcular el número de enpartículas infecciosas de alta tensión en la preparación vector final. Ver (Figura 7A) para los rendimientos típicos para partículas de alta tensión.
14. Finalmente calcular la relación de partículas infecciosas absolutos de HCAdV a los niveles de contaminación de alta tensión para evaluar la calidad de la preparación del vector.
    NOTA: Hasta ahora una pequeña parte del restante HV no se puede excluir. Por lo general, el porcentaje de contaminación HV es de ~ 5% de las partículas infecciosas o menos, lo que es aceptable (Figura 7B). Por supuesto como menos HV como sea posible es deseable, especialmente si el preparado vector va a ser utilizado para los experimentos con animales.

Resultados

Se muestran ejemplos Aquí representativos para la clonación, amplificación y purificación de preparaciones HCAdV. Una visión general de la estrategia de clonación (Figura 1) y ejemplos representativos para la clonación y la liberación del genoma HCAdV por enzimas de restricción digerir son proporcionados (Figura 2). Un patrón de restricción típica después de la liberación del casete GOI-expresión de pHM5 por PI Sce I y I-Ceu

Discusión

El protocolo que aquí se presenta permite la purificación de los vectores basados ​​en adenovirus HCAdV tipo humano 5 basado en procedimientos descritos previamente ^4,12. El genoma HCAdV dentro del plásmido pAdFTC está desprovisto de todos los genes de adenovirus y sólo lleva a los 5 'y 3'-RTI y la señal de empaquetamiento. En esta estrategia, el HV AdNG163R-2 ⁴ proporciona todos los genes necesarios para la producción de virus eficiente en trans. Esto ofrece una capacid...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
I-CeuI	New England Biolabs	R0699S	restriction digest
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S	restriction digest
T4 Ligase	New Engand Biolabs	M0202S	ligation
SwaI	New England Biolabs	R0604S	restriction digest
NotI	New England Biolabs	R0189S	restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290S	dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B	PAN Biotech	P02-015	selection of CRE expressing 116 cells
DMEM	PAN Biotech	P04-03590	Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116 cell culture medium
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS)	PAN Biotech	P04-36500	washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle	Sigma	CLS430281-24EA	infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes	Sigma	CLS431123-36EA	sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask	Bellco	1965-61030	growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes	Beckmann Coulter	344059	density gradient centrifugation
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
SW-41 rotor	Beckmann Coulter		density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane	VWR	132129	dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes	Thermo	66383	dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli	invitrogen	C4040-52	transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2495	midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit	Peqlab	12-3396-02	isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305	tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS)	Gibco	31985-062	transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	170-8882	q-PCR
CFX 96 C1000 touch	Biorad		qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol	Carl Roth	A156.1	purification of DNA
Cesium chloride	Carl Roth	8627.1	density gradient centrifugation
sodium acetate 99%	Carl Roth	6773.2	DNA precipitation
LB medium	Carl Roth	X968.3	bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure	Carl Roth	9065.5	DNA precipitation and washing
SDS 99.5%	Carl Roth	2326.2	lysis  buffer
EDTA	Carl Roth	8043.2	lysis  buffer
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5%	Carl Roth	3783.1	dialysis buffer
MgCl2 98.5%	Carl Roth	KK36.2	dialysis buffer
NaCl	Carl Roth	3957.1	optional dialysis buffer
KH2PO4	Carl Roth	3904.2	optional dialysis buffer
sucrose	Carl Roth	9286.1	optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O	Carl Roth	4984.2	optional dialysis buffer
1.5-ml tubes	sarstedt	72,730,005	storage of virus preparations at -80 °C