Generación de Scalable, metálico de alta Aspect Ratio nanocompuestos en una Biológica Medio Líquido

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para sintetizar nuevos, biocomposites elevada relación de aspecto en condiciones biológicas y en medios líquidos. Los biocomposites escala de nanómetros a micrómetros de diámetro y longitud, respectivamente. Nanopartículas de cobre (CNP) y sulfato de cobre en combinación con cistina son los componentes clave para la síntesis.

Resumen

El objetivo de este protocolo es describir la síntesis de dos nuevos biocomposites con estructuras de elevada relación de aspecto. Los biocomposites consisten en cobre y cistina, ya sea con nanopartículas de cobre (CNP) o sulfato de cobre contribuye el componente metálico. La síntesis se llevó a cabo en un líquido en condiciones biológicas (37 ° C) y la forma composites autoensambladas después de 24 hr. Una vez formados, estos compuestos son muy estables tanto en medios líquidos y en una forma seca. Los materiales compuestos escala de la nano- a micro gama de longitud, y desde unos pocos micrómetros a 25 nm de diámetro. Emisión de campo microscopía electrónica de barrido con espectroscopia de rayos X de energía dispersiva (EDX) demostró que el azufre estaba presente en las estructuras lineales derivados de NP, mientras que estaba ausente de material de partida CNP, confirmando así la cistina como la fuente de azufre en los nanocompuestos finales . Durante la síntesis de estos nano y micro-compuestos lineales, una amplia gama de longitudes de structures se forma en el recipiente de síntesis. La sonicación de la mezcla líquida después de la síntesis se demostró para ayudar a controlar el tamaño promedio de las estructuras por la disminución de la longitud media con un aumento del tiempo de sonicación. Dado que las estructuras formadas son muy estables, no se aglomeran, y están formados en fase líquida, centrifugación también puede ser usada para ayudar en la concentración y la segregación de los materiales compuestos formados.

Introducción

Copper is a highly reactive metal that in the biological world is essential in some enzyme functions ^1,2, but in higher concentrations is potently toxic including in the nanoparticulate form ^3,4. Concern over copper toxicity has become more relevant as CNPs and other copper-based nanomaterials are utilized, due to the increased surface area/mass for nanostructures. Thus, even a small mass of copper, in nanoparticle form, could cause local toxicity due to its ability to penetrate the cell and be broken down into reactive forms. Some biological species can complex with and chelate metal ions, and even incorporate them into biological structures as has been described in marine mussels ⁵. In studying the potential toxic effects of nanomaterials ⁴, it was discovered that over time, and under biological conditions used for typical cell culturing (37 °C and 5% CO₂), stable copper biocomposites could be formed with a high-aspect ratio (linear) structure.

By a process of elimination, the initial discovery of these linear biocomposites, which occurred in complete cell culture media, was simplified to a defined protocol of essential elements needed for the biocomposites to self-assemble. Self-assembly of two types of highly linear biocomposites was discovered to be possible with two starting metal components: 1) CNPs and 2) copper sulfate, with the common biological component being cystine. Although more complex, so called “urchin” and “nanoflower” type copper-containing structures with nanoscale and microscale features have been previously reported, these were produced under non-biological conditions, such as temperatures of 100 °C or greater ^6-8. To our knowledge, synthesis of individual, linear copper-containing nanostructures that are scalable in liquid phase under biological conditions has not been previously described.

One of the starting materials utilized for synthesis of nanocomposites, namely CNPs, has been reported previously to be very toxic to cells ⁴. It has recently been reported that after the nanocomposites are formed, these structures are less toxic on a per mass basis than the starting NPs ⁹. Thus, the synthesis described here may be derived from a biological and biochemical reaction that has utility in stabilizing reactive copper species, both in the sense of transforming the NP form into larger structures and in producing composites less toxic to cells.

In contrast to many other nanomaterial forms which are known to aggregate or clump upon interaction with biological liquid media ^10,11, once formed, the highly linear composites described here avoid aggregation, possibly due to a redistribution of charge which has been previously reported ⁹. As detailed in the current work, this avoidance of aggregation is convenient for the purposes of working with the structures once formed for at least 3 reasons: 1) composite structures once formed may be concentrated using centrifugation and then easily dispersed again using vortex mixing; 2) formed structures can be decreased in average size by sonication for different periods of time; and 3) the formed linear structures may provide an additional tool for avoiding the recently described “coffee ring effect” ¹² and thus provide a dopant for creating more evenly distributed coatings of materials, especially those containing spherical particulates.

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Protocolo

1. Planificación de Experimentos

1. Determinar el volumen de nanocompuestos de cobre necesarios para la síntesis. Sobre esa base, elegir un número de frascos pequeños volumen (25 ^cm2), o frascos más grandes, como se indica a continuación en la preparación de materiales.
2. Para esta síntesis, utilizar una incubadora a 37 ° C con 5% de CO ₂ y al menos 40% de humedad. Asegúrese de que una incubadora tal está disponible y que no será perturbado en repetidas ocasiones durante el periodo de síntesis (aproximadamente 24 hr).
   PRECAUCIÓN: apertura repetida y el cierre de la incubadora sin duda causar fluctuaciones de temperatura que pueden resultar en la síntesis alterada de las estructuras de nanocompuestos.

2. Preparación de los materiales

1. Preparar todos los materiales frescos antes del inicio de un experimento, mediante la adición de materiales sólidos a los disolventes justo antes de la síntesis es comenzar. Mantener las soluciones stock de los materiales de partida de cistina y cobre en líquido para tiempos largos bntes no se recomienda el experimento y puede conducir a resultados variables. Una vez abierto desde el proveedor, mantener los materiales secos envolviendo la parte superior del recipiente con Parafilm de partida.
   Nota: El siguiente protocolo se utiliza como un ejemplo para la reacción en un 25 cm ² frasco de cultivo celular usando 7 l de cistina, 6643 l de agua estéril, y 350 l de CNP.
2. Preparar una solución de 2 mg / ml de las nanopartículas de cobre pesando al menos 2 mg de CNP. Use guantes desechables durante este paso para evitar el posible contacto con la piel del CNP. Coloque las nanopartículas en una estéril 16 ml vial vaso vacío.
   1. Para el vial que contiene CNP, añadir agua desionizada estéril en el volumen adecuado para hacer una solución de 2 mg / ml y agitar la solución durante 20 segundos para proporcionar una dispersión de las nanopartículas antes del comienzo de síntesis (se recomienda al menos 1 ml de volumen total). No llene el camino vial más de la mitad con agua ya que esto inhibirá la mezcla por agitación. CNP will asiente rápidamente a la parte inferior del vial y aparecerá de color oscuro (gris a negro).
   2. Sonicar la solución CNP por 17 minutos a temperatura ambiente para proporcionar la dispersión máxima de CNP antes del inicio de la síntesis. Revise periódicamente para asegurarse de que los CNP se mezclaba debido al tratamiento con ultrasonidos. Después de una sonicación éxito, CNP permanecen suspendidas en solución durante al menos 30 min y la solución será de color oscuro.
3. Pesar masa suficiente de cistina para hacer una solución / ml 72,9 mg para la síntesis. Desde cistina no es directamente soluble en agua, coloque la cistina pesaron en un recipiente de pesada antiestático.
   1. Para el recipiente que contiene cistina pesaje, añadir un volumen suficiente de estéril, 1 M NaOH, de modo que la cistina se disuelve completamente. Por ejemplo, se disuelven 7,29 mg de cistina completamente en 100 l de 1 M NaOH, para hacer una solución 72,9 mg / ml.
   2. Para mantener condiciones estériles, llevar a cabo este paso en un tejido flujo campana de cultivo estéril.
      PRECAUCIÓN: NaOHa 1 M de concentración es cáustico, así que use guantes desechables durante este paso para evitar el contacto de NaOH concentrado con la piel
4. Trabajando en una campana de cultivo de tejido estéril, añadir 7 l de cistina con 6643 l de agua estéril al matraz estéril primera síntesis, y dejar incubar durante 30 min en la incubadora a 37 ° C con la tapa de matraz ventilada (suelto) para proporcionar eficaz de mezcla. Resuspender la solución de 2 mg / ml CNP por agitación durante 30 segundos, ya que los CNP se han asentado después de la etapa de sonicación.
   1. Añadir suficiente solución CNP en el matraz de síntesis (utilizando una técnica estéril) para mantener las relaciones de los componentes siguientes: 1 combinar partes cistina, 50 partes CNP, y 949 partes de agua estéril en un matraz de cultivo de ² células 25 cm para iniciar la síntesis. Por ejemplo, para un volumen de síntesis 7 ml, combinar 7 l de solución de cistina Stock, 350 l de CNP, y 6.643 l de agua estéril. Vuelva a colocar la tapa en el frasco y apriete de modo que sea sege.
   2. Después de combinar todos los componentes para la síntesis, mezclar suavemente en el matraz por agitación 4-5 veces. Colocar el frasco en la incubadora de CO ₂ y ventilar el frasco aflojando el tapón de modo que no habrá intercambio de gases en y fuera del matraz durante la síntesis.
5. Permita que la síntesis se ejecute en la incubadora durante aproximadamente 24 horas. Durante la síntesis, se puede observar, con microscopía y por el ojo, la formación de materiales compuestos altamente lineales.
   Nota: El proceso de formación de las estructuras puede ocurrir de repente en el sentido de que las estructuras son inicialmente difícil de detectar, a continuación, apariencia procede rápidamente a una densidad creciente. Por lo tanto, la formación puede ocurrir antes de las 24 horas. El proceso también puede ser observado por el ojo una vez que las estructuras se hacen más grandes y aumenta su densidad. Mientras que la generación de las estructuras se puede observar con el tiempo bajo el microscopio y por el ojo en puntos de tiempo posteriores, interrumpiendo continuamente las condiciones de síntesis y la temperatura dará lugar a pobreresultados de la síntesis.
6. Terminar síntesis de biocomposites por tapado herméticamente el matraz de síntesis y el almacenamiento de la embarcación en un refrigerador (4 ° C). Estructuras, una vez generados, se mantienen estables en esta forma por lo menos durante un año. Etiquetar el matraz con condiciones de síntesis, incluyendo componentes utilizados, fecha de la síntesis, y tiempo de incubación de la síntesis antes de la terminación.

3. Síntesis Uso de sulfato de cobre

1. Llevar a cabo la síntesis de auto-ensamblaje mediante la sustitución de los CNP con sal de sulfato de cobre. Utilizando una técnica estéril, disolver al menos 2 mg de sulfato de cobre en un volumen suficiente de agua desionizada estéril para hacer una solución de 2 mg / ml. Los cristales de sulfato de cobre fácilmente entran en solución a esta concentración, pero vórtice el vial si es necesario, e inspeccionar por ojo para asegurar que todos los cristales se disuelven.
2. Después de la preparación del sulfato de cobre, llevar a cabo la síntesis como se describe anteriormente, pero sustituyendo los CNP con el sulfato de cobre.
   Nota: nanocompuestos autoensambladas utilizando sulfato de cobre como material de partida se encontraron a ser mucho más coherente en forma final que para estructuras sintetizados a partir de los CNP.
3. Terminar la síntesis de biocomposites sulfato de cobre como para materiales compuestos CNP (paso 2.6) y almacenarlos a largo plazo a 4 ° C.

4. Caracterización y Manejo de Biocomposites post-síntesis

1. Caracterizar biocomposites derivados de CNP y de sulfato de cobre por la luz blanca de la microscopía ⁹ y por microscopía electrónica ^9.
   1. Para la caracterización y la inspección de biocomposites post-síntesis por la luz de microscopía blanco, usar un microscopio invertido como compuestos se depositan en la superficie inferior del frasco dentro de unos pocos minutos de la puesta del matraz plana, y luego se pueden poner en el foco. Utilice el ajuste de campo claro en el microscopio para maximizar el contraste entre biocomposites y el medio líquido. Compuestos derivados de CNP y la policíapor tanto el sulfato se aparecerá claro a opaco en color, pero los agregados CNP sin reaccionar aparecerá muy oscuro en color.
      1. Utilice una cámara digital conectada al microscopio para capturar imágenes de los materiales compuestos. Se observó un intervalo de longitudes para las estructuras individuales.
   2. Para la caracterización y la inspección de biocomposites post-síntesis y después de almacenamiento a 4 ° C, permiten frascos para llegar a la temperatura ambiente durante al menos 15 minutos como frascos formarán condensación inicialmente después de la retirada de la nevera, que oscurecer eficaz centrarse en el ejercicio de formación de imágenes de microscopía. Después de permitir el equilibrado a TA, limpie las superficies superior e inferior del matraz con una toalla de papel limpia para maximizar la calidad de imagen de microscopía.
   3. Cuando se trabaja con imágenes o materiales compuestos que se han almacenado a largo plazo, vórtice del frasco durante 30 segundos para disociar grupos de compuestos que se forman mientras que en el refrigerador. Después vórtex, inspeccione las estructuras con un micrófono invertidaroscope para asegurar que los agregados han disociado, y repetir vórtex según sea necesario.
   4. Utilice la luz blanca microscopía invertida para evaluar la eficacia de la síntesis para un experimento dado usando CNP. Por ejemplo, documentar la presencia o ausencia de los CNP sin reaccionar en matraces de síntesis utilizados para biocomposites derivados de CNP de frascos con diferentes parámetros tales como el tiempo de síntesis.
      Nota: Individual CNP son demasiado pequeños para observar con un microscopio de luz, pero que no ha reaccionado CNP agregados aparecerá como redondo y objetos oscuros, en contraste con los CNP-materiales compuestos han sintetizado con éxito que tendrá una alta relación de aspecto, forma lineal, y tendrá una gama de diferentes longitudes. Evitar realizar síntesis para demasiado largo de un período de tiempo antes de la terminación, ya que esto dará lugar a muy ramificadas estructuras tipo "de erizo", que son difíciles de dispersar en estructuras individuales, una vez formados.
   5. Utilice invertido microscopio de luz blanca para evaluar la eficaciade la síntesis para un experimento dado usando sulfato de cobre. Desde el sulfato de cobre va completamente en solución usando este protocolo, la solución aparecerá menos oscuro que la solución de síntesis utilizando CNP. Documentar el tamaño y la extensión de los materiales compuestos de sulfato de cobre mediante la comparación de frascos con diferentes condiciones de síntesis tales como el tiempo de síntesis antes de la terminación.
      Nota: Los compuestos sintetizados con éxito se mostrará una gama de diferentes longitudes. Evitar realizar síntesis para demasiado largo de un período de tiempo antes de la terminación, ya que esto dará lugar a agregados altamente ramificadas de compuestos, algunos de los cuales serán "erizo-like" en la estructura, y que son difíciles de dispersar en estructuras individuales, una vez formados .
2. Concentrar biocomposites post-síntesis, las soluciones de centrífuga de composites en un tubo de centrífuga. Añadir 6 ml de cualquiera de las estructuras derivadas-CNP o estructuras de sulfato de cobre-derivado a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar durante 10 minutosa 500 xg a temperatura ambiente para formar un pellet. Para volúmenes más pequeños, añadir 500 l de estructuras en solución a 0,6 ml tubos de tamaño. Centrifugar a 2000 xg a temperatura ambiente durante al menos 10 min para formar un pellet.
   1. Después de centrifugar durante un tiempo suficiente (al menos 10 min para microfuges), guardar el precipitado observable en la parte inferior del tubo donde las estructuras se concentran eliminando cuidadosamente el líquido sobrenadante por encima del sedimento. Estructuras biocompuesto derivados de sulfato de cobre aparecen de color azul y estructuras derivadas de los CNP son más oscuros (gris a negro).
   2. Añadir más compuestos a este tubo y repetir el proceso en el mismo tubo para concentrar las estructuras si se desea. Para dispersar a los gránulos concentrados, añadir el volumen deseado de solución al tubo, y agitar durante 10 a 30 segundos.
3. Estructuras sonicado una vez formado, para mover el tamaño de la población media (longitudes) de las estructuras a valores más bajos. Coloque las estructuras en agua desionizada estéril y sonicado durante al least 10 min. Utilizando este proceso, con el tiempo, las estructuras se fragmentan y más pequeño en longitud media (véase la figura 6 del texto). Documentar los cambios en los tamaños de compuestos con diferentes tiempos de sonicación utilizando un microscopio de luz blanca invertida y cámara digital.

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Resultados

La figura 1 muestra un diagrama de flujo esquemático de las etapas de síntesis para formar los biocomposites lineales descritos en este trabajo. CNP o sulfato de cobre como materiales de partida se combinan con agua estéril para formar una solución 2 mg / ml, esta solución se mezcla y se sometió a ultrasonidos para proporcionar una mezcla homogénea, y esta solución de cobre se mezcla a continuación en la siguiente relación para la síntesis de: 949 partes estéril agua: 50 partes de la mezcla ...

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Discusión

Mientras que la evaluación de potenciales efectos tóxicos de los nanomateriales incluyendo CNP, se observó que en el largo plazo, CNP fueron transformados de una distribución de partículas más dispersa inicialmente a una forma más grande, agregada (Figura 2). En algunos casos, estas formaciones altamente agregados que se produjeron en la placa de cultivo de células, en condiciones biológicas, formaron proyecciones altamente lineales del agregado central, que recuerda cobre descrito anteriorment...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini Vortexer	VWR (https://us.vwr.com)	58816-121
CO2 Incubator Model # 2425-2	VWR (https://us.vwr.com)	Contact vendor	Current model calalog # 98000-360
Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge)	Labnet (http://labnetinternational.com/)	C2500-R	Model Prism R
Cell Culture Centrifuge Model Z323K	Labnet (http://labnetinternational.com/)	Contact vendor	Current model Z206A catalog # C0206-A
Sonicator (Ultrasonic Cleaner)	Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)	1510R-MTH
Balance	Sartorius (http://dataweigh.com)		Model CP225D similar model CPA225D
Olympus IX51 Inverted Light Microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Olympus DP71 microscope digital camera	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
external power supply unit - white light for Olympus microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	TH4-100
10X, 20X, and 40X microscope objectives	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Scanning Electron Microscope	Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)	model S-4800
Transmission Electron Microscope	Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)	model Libra 120
Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench	Envirco (http://envirco-hvac.com)	model PNG62675	Used for sterile cell culture technique