Los protocolos para pruebas de resistencia a los herbicidas robusta en diferentes especies de malezas

Resumen

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Resumen

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

Introducción

Los herbicidas son la medida de control de malas hierbas más ampliamente utilizado, que representa hasta un 50% del mercado global de protección de las plantas ^1. Son herramientas relativamente baratas, evitar prácticas de cultivo del suelo en mano de obra intensiva y requiere mucho tiempo, y en última instancia resultar en la producción rentable, segura y rentable de alimentos ^2. Sin embargo, la gran variabilidad genética fenológico y presente en muchas especies de malezas, junto con un exceso de confianza en el uso de herbicidas, se traduce con frecuencia en la selección de poblaciones de malezas resistentes a los herbicidas. La introducción de herbicidas selectivos con un objetivo metabólica muy específico ^3-5 se ha incrementado dramáticamente el número de casos de resistencia a lo largo de los años. Hasta la fecha, 240 especies de malezas (140 dicotiledóneas y monocotiledóneas 100) en todo el mundo han desarrollado resistencia a los diferentes sitios de herbicidas de acción (SOA) ^4. Esta es una preocupación importante para el manejo de malezas y más en general, para la producción agrícola sostenible.

e_content "> La detección temprana de la resistencia, con base en pruebas fiables, se realizan con frecuencia en un invernadero, es un paso clave para manejar malezas resistentes a los herbicidas. Los diferentes enfoques se han desarrollado de acuerdo con los objetivos, el nivel requerido de precisión, el tiempo y los recursos disponibles, como así como las especies de malas hierbas consideradas ^6-12. Sin embargo, cuando se requiere la confirmación del estado de resistencia de un nuevo biotipo de malezas (es decir, un grupo de individuos que comparten varias características fisiológicas, incluyendo la capacidad de sobrevivir a uno o más herbicidas pertenecientes a una grupo particular utilizado en una dosis que normalmente controlar ellos), un robusto bioensayo de toda la planta se debe realizar en un ambiente controlado ^{4, 11.}

Un biotipo rara vez es resistente a un solo herbicida. Por tanto, cada biotipo se caracteriza por un patrón de resistencia determinado, es decir, número y tipo de SoA de los herbicidas es resistente a, y por una resistencia dadanivel para cada herbicida ^13. La determinación precoz y fiable del patrón de cruz o resistencia múltiple ^{5, 14} es importante para la gestión de la resistencia de campo.

Vale la pena mencionar que la resistencia a los herbicidas no tiene nada que ver con la tolerancia natural que algunos exhiben especies de malezas a algunos herbicidas, por ejemplo, las especies dicotiledóneas vs. herbicidas ACCasa inhibidoras, especies monocotiledóneas vs. 2,4-D, Equisetum arvense vs. glifosato.

Este artículo presenta un enfoque sólido para probar biotipos resistentes a herbicidas putativo muestreados en los campos donde se había reportado un mal control por el herbicida (s). Se presentan variantes relevantes a los protocolos estándar en relación con las especies de malas hierbas que participan. Las ventajas sobre las técnicas / protocolos alternativos basados ​​en cualquiera de los bioensayos de plantas enteras utilizando sólo una dosis de herbicida ^15, o el tratamiento de semillas en placas de Petri ⁸ están relacionados con la mayor reliability y la posibilidad de inferir el nivel de resistencia debido a la inclusión de dos dosis de herbicidas en los experimentos. Sin embargo, para las pruebas de resistencia de rutina, los mismos métodos pueden ser aplicados en una sola dosis de herbicida, por lo que la reducción de los costes.

Además de permitir la confirmación de la condición de la resistencia, la información obtenida se puede utilizar tanto para la optimización de los siguientes pasos de la investigación y / o la elaboración de estrategias de manejo de resistencia.

Protocolo

1. Semilla Muestreo y almacenamiento

1. Monitorear campos cultivados para el rendimiento herbicida pobres injustificada, es decir, no se debe a las condiciones climáticas adversas o tratamientos herbicidas de baja calidad.
2. Se recoge una muestra de semillas de una especie a la vez y asignar un código único. Las semillas maduras suelen ser recogidos antes de la cosecha de cultivos de plantas que habían sobrevivido al tratamiento (s) herbicida. Monitor oportuna para observar si las semillas se desprenden de la planta madre cuando madura.
3. Rellenar un formulario para cada muestra que indica el código único asignado, el nombre de la especie, fecha de recolección, coordenadas GPS, municipio, el nombre del agricultor, el tamaño del campo, nivel de infestación, los cultivos, los herbicidas (s) que se utilizan durante la temporada y los registros históricos del campo .
4. Recoger las semillas de al menos 30 plantas seleccionadas al azar que son representativos de la infestación de campo. Asegúrese de que la muestra de semillas contiene al menos 5.000 semillas maduras. Por una especie de malezas obligados cruzamiento(Por ejemplo, Lolium spp. O Amaranthus spp.), Reducir el número de plantas a 10-15, manteniendo el número total de semillas alrededor de 5000 ^11.
5. Sub-muestrear el campo si los parches de malezas se encuentran dispersos en grandes áreas (más de una hectárea) como los diferentes biotipos resistentes a herbicidas son seleccionados.
6. Tienda semillas en bolsas de papel sin sellar marcadas con el código único asignado.
7. Deje que se evapore la humedad pero no exponga semillas de alta temperatura (es decir, evitar lo que les deja en un coche bajo el sol) o fluctuaciones extremas de temperatura para evitar la inducción de la latencia secundaria.
8. Limpio (quitar la paja, las semillas de-casco, etc.) y almacenar a temperatura ambiente en un lugar seco. Después de realizar las primeras pruebas de resistencia, almacenar las semillas por largos períodos de tiempo en un cuarto oscuro a 4 ° C, preferiblemente en bolsas de plástico selladas al vacío. En esta manera semillas preservar su viabilidad durante un tiempo significativamente más largo.

2. Semillas latencia Breaking

NOTA: latencia de la semilla proporciona un mecanismo flexible y eficiente que permite a las malas hierbas para adaptarse y persistir en los agroecosistemas. Para romper la latencia y permitir la germinación de semillas, diferentes protocolos tienen que ser utilizados, dependiendo de las especies de malezas, es decir, el tipo de latencia ^16.
Hay tres formas principales para eliminar la latencia:

1. Vernalización
   NOTA: Para obtener la germinación simultánea y emergencia de las plántulas, un período de vernalización semillas que van desde unos pocos días a una semana es necesario para eliminar la latencia fisiológica de muchas especies:. Por ejemplo, Amaranthus retroflexus, Chenopodium album, Lolium spp, Avena fatua, Polygonum persicaria , Phalaris paradoxa ^17-19. Se requiere un período de hasta 15 días más para Papaver rhoeas, Cyperus difformis y coccinea Ammania y hasta 30 días para que Schoenoplectus mucronatus 20.
   1. Ponga un poco de agua desionizada en platos de plástico. Corte dos capas de papel de filtro y remojar en el agua, eliminar cualquier exceso. Coloque las semillas secadas al aire en el papel. La transferencia de los platos de plástico de una nevera a 4 ° C durante el período de tiempo requerido.
2. Escarificación
   NOTA: Algunas especies de malas hierbas son más recalcitrantes a la germinación que otros debido a la latencia mecánica, es decir, características de la capa de semillas, y requieren el uso de una escarificación química con ácido sulfúrico a germinar ^21.
   1. Preparar un vaso de precipitados con ácido sulfúrico concentrado (95-98%). Preparar un vaso lleno de agua. Ponga las semillas en un sobre de tela no tejida.
   2. Remojar por ejemplo, semillas halepense Echinochloa spp. O sorgo durante 20 min o 5 min, respectivamente, en ácido sulfúrico concentrado.
   3. Tome el sobre del vaso de precipitados con un par de pinzas y lo puso en el vaso lleno de agua. Abre elsobre, poner las semillas en un pequeño colador y enjuague a fondo con agua corriente.
   Variante: A. plantago-aquatica necesita un protocolo diferente ^{22, 23}
   1. Remoje las semillas durante 2 minutos en cloroformo. Enjuague las semillas con agua desionizada y secar con papel absorbente. Dunk las semillas en ácido sulfúrico 80% durante 5 min.
   2. Ponga las semillas en un pequeño colador y enjuague a fondo con agua corriente.
3. Poscosecha maduración de la semilla
   NOTA: Las semillas de otras especies de malas hierbas no germinan en absoluto durante unos meses después de su vencimiento, independientemente del método utilizado para romper la latencia.
   1. Guarde las semillas por un período de al menos 3-4 meses a temperatura ambiente y la humedad baja y luego siga los protocolos anteriores para romper la latencia (por ejemplo, Oryza sativa var. Fagus o P. rhoeas).

Germinación 3. Semilla

1. Coloque las semillas a germinar en plasplatos de tics que contienen 0,6% (m / v) de agar con nitrato de potasio al 0,1% (KNO ₃₎ ha añadido:
   1. Preparar una solución de agar al 0,6% + 0,1% KNO ₃ usando agua desionizada. Se disuelve el agar en un horno microondas.
   2. Verter la solución de agar en platos de plástico. Enfriar el sustrato y luego poner en las semillas.
   Variante: del suelo también puede ser utilizado como un sustrato en platos de plástico. Esta práctica es particularmente eficiente para Echinochloa spp., S. halepense y Lolium spp.
2. Coloque platos de plástico en un armario de germinación por alrededor de una semana con condiciones de luz y temperatura en función de las condiciones óptimas para cada especie de maleza. Para la mayoría de las especies de invierno, el rango de temperatura es 15/25 ° C noche / día y 12 hr fotoperíodo con tubos de neón que proporcionan una densidad de flujo de fotones fotosintético (PPFD) de 15-30 mol m ^-2 seg ^-1. Para muchas especies de verano, el rango de temperatura es 15/30 ° C la noche / día.
   Variante: SOme especies, tales como S. halepense, necesitará un tratamiento térmico. Por lo tanto después de la escarificación, semillas de S. halepense se someten a las siguientes condiciones: ciclos de 4 horas a 45 ° C y 20 horas a 24 ° C durante tres días en el armario de la germinación, y luego tres días en condiciones normales.

4. El trasplante de plántulas y Crecimiento

1. Trasplante de quince a veinte plántulas en bandejas de plástico (325 x 265 x 95 mm) llenos de una mezcla estándar de encapsulamiento (60% suelo franco limoso, 15% de arena, 15% y 10% Agriperlite turba - por volumen).
   NOTA: El trasplante, en lugar de la siembra directa, permite un soporte uniforme de las plantas en la misma etapa de crecimiento que se obtiene, que es una condición previa importante para optimizar el rendimiento del tratamiento herbicida.
2. Identifique cada bandeja con un código de barras que incluye toda la información para la identificación única: Código de la población, el herbicida se está probando, replicar número y número de bandeja progresiva <./ Li>
3. Coloque las bandejas en una sala climatizada plantas de invernadero y el agua según sea necesario para mantener el sustrato en o cerca de la capacidad de campo.
   NOTA: La temperatura de crecimiento varía dependiendo de las especies de malas hierbas. A menudo se realizan pruebas durante el otoño / invierno / primavera, así que la luz se complementa utilizando 400 W lámparas de halogenuros metálicos, que proporcionan una PPFD de aproximadamente 150 mol m ^-2 s ^-1 y un fotoperíodo de 12 h ^{24, 19.} Especies de malezas de verano con C ₄ ciclo fotosintético por lo general requieren una mayor intensidad de la luz y por lo tanto, las pruebas se realizan a finales de primavera-verano o la intensidad de la luz es complementado aproximadamente 400 mol m ^-2 s ^-1 con un fotoperiodo de 14 h.
4. Use un protocolo diferente para algunas especies de malezas que infestan arroz con cáscara, por ejemplo, A. plantago-aquatica, S. mucronatus y C. difformis como se describe en ^22.
   1. Transplante las plántulas en bandejas de poliestireno con 24 células redondas (55 mm de diámetro, 64 mm de profundidad) filconducido con 60% de suelo franco limoso, 30% de arena y 10% de turba (en volumen).
   2. Establecer las bandejas de 12 cm envases plásticos profundos llenos de agua y aseguradas mediante varillas roscadas de acero inoxidable para evitar que se flotante (Figura 1).
   3. Mantener el nivel de agua en los recipientes a 1-2 cm por debajo del nivel de la superficie del suelo y añadir 1,5 g de sulfato de cobre a cada recipiente (que contiene 10-12 L de agua) para evitar la proliferación de algas.

5. Tratamientos herbicidas

1. Los tratamientos con herbicidas de pre-emergencia:
   1. Después de tres días en el gabinete de la germinación como se describe en la sección 3, transplantar las semillas que germinan en bandejas de plástico que contienen el sustrato descrito anteriormente y cubrir con una capa de tierra (aproximadamente 1 cm). Este es un paso crítico a fin de garantizar que las plántulas no surgirán debido al efecto herbicida en lugar de una profundidad de enterramiento excesiva.
   2. Tome el sustrato de campo capaciudad mediante la colocación de las bandejas, que tienen unos agujeros en la parte inferior, en platillos llenos de agua.
   3. Un día después del trasplante, el tratamiento de las bandejas con el herbicida de preemergencia ^25.
   4. Mantenga el sustrato o por la capacidad de campo cerca de la adición de agua, según sea necesario, tanto desde arriba y abajo por capilaridad desde el platillo. Este procedimiento favorece la permanencia del herbicida a la profundidad adecuada (es decir, donde las semillas en germinación son) para una buena eficacia del tratamiento.
2. Los tratamientos con herbicidas de post-emergencia:
   1. Rociar las plantas cuando llegan a la etapa de 2-3 hojas (es decir, etapa de crecimiento 12-13 de la escala BBCH crecimiento extendido ^26).
   2. A partir del día después del tratamiento, ajuste el sistema de riego en función de las necesidades de agua de las especies de malezas y la temporada (por ejemplo, para Echinochloa spp. Que suministra agua durante 3 minutos 4 veces al día, a intervalos regulares, de 9 am a 9 pm). El agua es discontribuido mediante un sistema de riego por aspersión automática.
      Variante: glifosato se aplica en la planta de la etapa BBCH 14-21.
3. Preparación de herbicidas y la distribución.
   NOTA: Todos los herbicidas (pre y post-emergencia) se aplican como formulaciones comerciales con surfactantes recomendados en dos dosis, la dosis recomendada de campo (1x) y tres veces mayor que (3x).
   1. Si es necesario, preparar la solución de tensioactivo a granel con arreglo a las instrucciones de la etiqueta; la concentración final se expresa generalmente como un porcentaje del volumen final (por ejemplo, 0,3%) o como volumen a ser distribuido por unidad de área (por ejemplo, 1 L ha ^-1).
   2. Utilice la solución de tensioactivo como disolvente para la solución de herbicida (soluto) con el fin de mantener la concentración correcta del ingrediente activo. Preparar la solución herbicida más concentrada primero (3x). Calcular la cantidad de producto comercial que se disuelve en la solución de tensioactivo (o en agua desionizada si unatensioactivo no es necesario) usando la siguiente ecuación:
      _Hierbas Dosis = [(Dosis _campo x Dosis _máxima) x V _aleta] / V _del
      Dónde: _hierba = dosis Dosis herbicida (ml), dosis _{de campo} = campo herbicida Dosis (ml ha ^-1), Dose _max = dosis máxima entregada, V _aleta = volumen final de la solución (L), V = volumen _del emitido por el pulverizador de banco (L ha ^-1).
   3. Diluir (2: 1, v / v) la solución 3x herbicida para preparar el menos concentrado (1x). Este procedimiento reduce la posibilidad de cometer errores al pesar o pipetear los herbicidas. Concentración de la solución herbicida se expresa como volumen a ser distribuido por unidad de área (L ha ^-1).
   4. Iniciar la secuencia de tratamiento con la dosis de herbicida inferior (1x). De esta manera no hay necesidad de lavar el gabinete de pulverización entre dos tratamientos con la misma herbicida.
   5. Distribuya el solutio herbicidan usando un pulverizador de banco precisión la entrega de 300 L ha ^-1 (± 1%), a una presión de 215 kPa, y una velocidad de 0,75 m ^s-1, con un brazo equipado con tres abanico plano (rango extendido) boquillas hidráulicas .
   6. Lave el gabinete rociar dos veces cuando el herbicida se cambia el uso de cloro al 1% (v / v) y luego enjuague.
      Variante: glifosato se aplica con un volumen de pulverización de 200 L ^{ha-1 27.}
      NOTA: Especial atención tiene que ser pagado cuando, como el sulfometuron o flazasulfuron sulfonilureas, se utilizan herbicidas altamente biológicos. En este último caso hacer un lavado con una solución de lejía y otro con amoniaco (2,5% v / v), seguido de un enjuague cuidadoso con agua.

6. Recopilación y Análisis de los Datos

1. A través de un lector de código de barras, que identifica automáticamente cada bandeja, registre el número de plantas que sobrevivieron al tratamiento, así como la biomasa estimada Visual (VEB). Las plantas son culocomputan como estar muerto si no muestran crecimiento activo, independientemente del color o de otro aspecto.
   1. Hacer la evaluación de tres o cuatro semanas después del tratamiento (WAT) en función de los herbicidas probados (por ejemplo, tres WAT para los inhibidores ACCasa y cuatro WAT para los inhibidores de ALS o glifosato).
   2. Evaluar la eficacia del tratamiento en general mediante la inclusión de una población susceptible (comprobar S) en todos los experimentos, es decir, una población recogida en un sitio que nunca o raramente tratados con herbicidas era.
   3. Supervivencia de las plantas Express como porcentaje del número de plantas tratadas, contó justo antes del tratamiento con herbicida, y calcular el error estándar (SE) por valor medio (valor de las dos repeticiones significa).
   4. El VEB se obtiene a través de una comparación visual de la biomasa vegetal entre tratado y verificación de la misma población de ^{25, 28} no tratados. Una puntuación, que van desde 10 para las plantas no afectadas por el herbicida (en comparación con la comprobación no tratada) a 0 Cuándolas plantas son claramente muerto, se le da a cada bandeja tratada.
2. Poblaciones atribuyen a cuatro categorías en función de los resultados obtenidos de los tratamientos con dos dosis de herbicidas: S cuando menos del 5% de las plantas sobrevivieron los 1x dosis de herbicidas, SR cuando los sobrevivientes oscilaron entre 5% a 20% en 1x dosis de herbicidas, R cuando más de 20% de las plantas sobrevivió a los 1x dosis de herbicida y RR cuando los sobrevivientes son más de 20% en dosis de herbicida 1x y más de 10% en dosis de herbicida 3x ^17.

Resultados

Para evaluar el estado de resistencia de una población resistente putativo, es fundamental para incluir un cheque susceptible en el ensayo con el fin de verificar la eficacia herbicida. Los resultados de una prueba de detección llevados a cabo en P. poblaciones rhoeas, una mala hierba que infestan los campos de trigo, se presentan en la Figura 2, donde se presenta la eficacia de cuatro herbicidas de post-emergencia en un testigo susceptible (09-36) y, por un presunto resistente (10-9...

Discusión

Varios pasos dentro de los protocolos son fundamentales para una evaluación exitosa de resistencia a los herbicidas en una población: 1) las semillas deben recogerse en la madurez de las plantas que habían sobrevivido al tratamiento (s) herbicida. La maduración de las semillas de la planta madre es crucial para evitar dificultades en la germinación de las semillas más tarde; 2) Se recomienda el almacenamiento adecuado de semillas para evitar la proliferación de mohos que impidan la germinación; 3) las plántulas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paper bags	Celcar SAS
Plastic dishes	ISI plast S.p.A.	SO600	Transparent plastic
Sulfuric acid 95-98%	Sigma-Aldrich	320501
Non-woven fabric	Carretta Tessitura	Art.TNT17	Weight 17 g m-2
Chloroform >99.5%	Sigma-Aldrich	C2432
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Potassium nitrate >99.0%	Sigma-Aldrich	P8394
Plastic containers	Giganplast	1875/M	600 x 400 x 110 mm
Plastic trays	Piber plast	G1210A	325 x 265 x 95 mm
Polystyrene trays	Plastisavio	S24	537 x 328 x 72 mm, 24 round cells (6x4)
Copper sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Agriperlite	Blu Agroingross sas	AGRI100
Peat	Blu Agroingross sas	TORBA250
Germination cabinet	KW	W87R
Nozzles	Teejet	XR11002-VK, TP11001-VH	The second type of nozzles are used only for glyphosate
Barcode generator	Toshiba TEC	SX4
Labels with barcode	Felga	TT20200	Stick-in labels with rounded corners
Barcode reader	Cipherlab	8300-L	Portable data terminal
Bench sprayer			Built in house
Herbicides included in the results:
Commercial product	Active ingredient	Company	Comments
Altorex	imazamox	BASF
Azimut	florasulam	Dow AgroSciences
Biopower		Bayer Crop Science	Surfact to be used with Hussar WG
Dash		BASF	Surfact to be used with Altorex
Granstar	tribenuron-methyl	Dupont
Gulliver	azimsulfuron	Dupont
Hussar WG	iodosulfuron	Bayer Crop Science
Nominee	bispyribac-Na	Bayer Crop Science
Roundup	glyphosate	Monsanto
Trend		Dupont	Surfact to be used with Granstar and Gulliver
Viper	penoxsulam	Dow AgroSciences
Weedone LV4	2,4-D	Isagro