Instilación y Fijación Métodos Útiles en pulmón de ratón Cancer Research

Resumen

El objetivo de este trabajo es describir métodos sencillos que ayudarán en gran medida en la configuración y el análisis de los pulmones de ratones con cáncer de pulmón u otras patologías. Presentamos 3 protocolos para llevar a cabo simple y fiable instilaciones de pulmón, fijación, y mediciones de volumen pulmonar.

Resumen

La capacidad de infundir agentes vivos, células o productos químicos directamente en el pulmón sin herir o matar a los ratones es una herramienta importante en la investigación del cáncer de pulmón. Aunque hay un número de métodos que se han publicado que muestra cómo intubar ratones para las mediciones de función pulmonar, ninguno es sin problemas potenciales para la instilación traqueal rápida en grandes cohortes de ratones. En el presente trabajo, un método sencillo y rápido se describe que permite a un investigador para llevar a cabo tales instilaciones de una manera eficiente. El método no requiere de herramientas especiales o iluminación y se puede aprender con muy poco práctica. Se trata de anestesiar un ratón, haciendo una pequeña incisión en el cuello para visualizar la tráquea, y después la inserción de un catéter intravenoso directamente. La pequeña incisión se cierra rápidamente con adhesivo tisular, y los ratones se les permite recuperarse. Un estudiante calificado o técnico pueden hacer instilaciones a una tasa promedio de 2 min / ratón. Una vez tque esté establecido el cáncer, hay con frecuencia una necesidad de un análisis histológico cuantitativo de los pulmones. Tradicionalmente patólogos generalmente no se molestan en estandarizar la inflación pulmonar durante la fijación, y los análisis a menudo se basan en un sistema de puntuación que puede ser muy subjetiva. Si bien esto puede en algún momento ser lo suficientemente adecuada para las estimaciones brutas del tamaño de un tumor de pulmón, cualquier cuantificación estereológicos adecuada de la estructura de pulmón o células requiere un procedimiento de fijación reproducible y la medición del volumen pulmonar subsiguiente. Aquí se describen los procedimientos fiables simples, tanto para la fijación de los pulmones bajo presión y luego medir con precisión el volumen pulmonar fijo. El único requisito es una balanza de laboratorio que es precisa en un rango de 1 mg-300 g. Los procedimientos que aquí se presentan de este modo podrían mejorar en gran medida la capacidad de crear, tratar y analizar los cánceres de pulmón en ratones.

Introducción

Por una serie de razones, cáncer de pulmón no ha sido ampliamente estudiado en el ratón. Una razón para esto es que el acceso a los pulmones es muy difícil in vivo, y el análisis cuantitativo de los pulmones fijos no se hace comúnmente. Los métodos descritos en este documento están diseñadas para remediar esta situación. Los objetivos de este documento son para describir métodos sencillos que ayudarán en gran medida en la configuración y el análisis de los pulmones de ratones con cáncer de pulmón u otras patologías. Aunque ninguno de estos enfoques son totalmente nuevo, que no se han presentado juntos como métodos independientes de la forma simplificada como se describe aquí.

Ha habido un número de manuscritos que han descrito métodos para la intubación del pulmón de ratón principalmente con el propósito de hacer la función pulmonar de repetición o lavado broncoalveolar en ratones individuales en estudios longitudinales. Dado que el papel original, ha habido varios otros papeles que han descrito diferentes enfoques para mouse intubación ^{1 -9.} Si bien todos estos métodos se pueden utilizar con éxito, por lo general requieren un entrenamiento considerable y no son a menudo sin una tasa de fracaso no trivial. Además, con el fin de llevar a cabo mediciones de la función pulmonar, la cánula tiene que encajar herméticamente la tráquea lo suficiente para que no haya fugas de aire. Sin embargo, otro uso práctico para la intubación es para administrar agentes específicos (células de cáncer u otros insultos) o fármacos terapéuticos directamente al pulmón. Tal procedimiento no requiere una cánula de ajuste apretado ni ningún equipo sofisticado de la función pulmonar. La novela característica de este método se muestra aquí implica un procedimiento quirúrgico menor que permite que la intubación sin ninguna posibilidad de la cánula de entrar en el esófago. Este enfoque simple permite la intubación exitosa con relativamente poca formación o experiencia. Nada menos que 30 ratones / hr pueden ser tratados con este enfoque con una tasa de fracaso cercanos a cero.

Una vez tque los ratones están listos para ser sacrificados, los pulmones lesionados o cancerosas luego se puede quitar para histológico y análisis patológico. Sin embargo, con el fin de cuantificar correctamente las variables histológicas para la comparación con otros pulmones, es esencial para estandarizar los procedimientos de fijación y cuantificar adecuadamente el volumen pulmonar fijo ^10. En este trabajo se describe en detalle los procedimientos simples que permiten a los procedimientos de fijación estandarizados, así como una manera de medir el volumen pulmonar fijo. El volumen es una métrica esencial en la cuantificación de la histología, ya que sin dicha determinación de volumen, sólo densidades relativas se pueden medir ^10. Una vez que se conoce el volumen de pulmón, sin embargo, las mediciones absolutas de células y otras mediciones estructurales en el pulmón pueden ser cuantificados.

Protocolo

El siguiente protocolo describe un sistema que funciona bien en 20-35 g ratones. El método podría ser fácilmente adaptable a los ratones grandes o más pequeñas simplemente cambiando el tamaño del catéter. Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins.

1. La instilación de pulmón

1. Seleccionar una de una pulgada de largo 20 g cánula intravenosa comercial a utilizar para la intubación.
2. Modificar la punta del catéter de flexión manualmente para generar una ligera curvatura en la punta como se ilustra en la Figura 1.
3. Anestesiar al ratón con una mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (15 mg / kg) inyectada IP, y confirmar la anestesia por la ausencia de movimiento reflejo. Aplicar la pomada veterinaria en los ojos inmediatamente después de la anestesia. Inmediatamente después de la anestesia se aplican pomada de veterinaria en los ojos y dan carprofeno (5-10 mg / kg SQ) para analgesia post quirúrgico y la instilación.
4. Coloque el mouse supina sobre una plataforma inclinada. Como se muestra en la Figura 2, una gran aglutinante de oficina con lazos de sutura grabada el funciona perfectamente bien.
5. Afeitarse la parte ventral del cuello y limpiar y desinfectar la zona del cuello con un 70% de alcohol. Con nuevos de látex y guantes sin pólvora, utilice instrumentos quirúrgicos desinfectados con un 70% de alcohol.
6. Usando tijeras afiladas hacen una pequeña incisión quirúrgica en el cuello de aproximadamente 12 mm por debajo del incisivo inferior.
7. Con unas pinzas tire suavemente de la piel en el cuello caudalmente hasta que la pared ventral de la tráquea puede ser visto.
8. Retraer la lengua suavemente e inserte la cánula con la punta doblada inclinada hacia la superficie ventral del ratón. Al igual que en 1.4, tire suavemente sobre la piel en el cuello, e insertar la cánula en la tráquea.
   NOTA: Con un poco de práctica, el catéter será visible en movimiento por la tráquea. Si se va en el esófago, entonces no habrá ninguna observación visual del movimiento del catéter. No hay incisionesse hacen en la tráquea.
9. Una vez que el catéter se ve en la tráquea en el cuello, lo adelantó unos 5 mm para ser fiable pasado las cuerdas vocales, pero todavía muy por encima de la carina.
10. Prepárese para inculcar hasta 50 l de líquido mediante la inyección a través del catéter con una punta de pipeta de carga de gel. Coloque la punta en el conector luer, pero antes de inyectar mirada cuidadosamente para observar el movimiento del fluido en el sincrónica punta con la respiración del ratón. Entonces inyectar el instilado.
11. Con una jeringa de 1 ml, inmediatamente hacer un relativamente rápida inflación de 0,6 ml de aire a los pulmones a través del catéter para ayudar a distribuir la profunda líquido en los pulmones. Retire la cánula.
12. Retire la cánula.
13. Use una pequeña cantidad de adhesivo de cianoacrilato para cerrar la pequeña herida quirúrgica según las instrucciones prospecto de Vetbond. Coloca los ratones en jaulas individuales y controlar visualmente hasta que se despiertan y comportarse normalmente sin ninguna indicación de discomfort.

2. Fijación de pulmón

NOTA: una vez que todos los procedimientos experimentales se realizaron en un ratón, los pulmones pueden ser preparado para el procesamiento histológico por fijación con formaldehído (o cualquier otro fijador se desea).

1. Sacrificar el ratón con un procedimiento IACUC aceptable. Para el ratón representativo se muestra en el video, se utiliza dislocación cervical de un ratón anestesiado.
2. Realice una traqueotomía (si no lo ha hecho) mediante la exposición quirúrgica de la parte ventral de la tráquea, lo que hace un pequeño corte, y la inserción de una punta de la aguja talón de 18 G en la tráquea, y atar con hilo.
3. Abra cuidadosamente el tórax con una incisión en la línea media, cortar el diafragma, y ​​quitar las paredes laterales de tórax para exponer los pulmones.
4. Conectar el extremo luer de la aguja a un depósito en un soporte de anillo que contiene formaldehído. Vea la Figura 3.
5. Establezca la superficie superior del formaldehído 25 cm por encima del nivel del mouse. Vea la Figura 3. A continuación asegúrese de que no hay aire en el tubo de fijación mediante la ejecución de fluido fuera el final de una llave de paso. Conectar el extremo luer de la cánula traqueal a la tubería de depósito. Abra la llave de paso para inflar los pulmones con el formaldehído. Deja los pulmones bajo presión durante al menos 20 min.
6. Abra la llave de paso para inflar los pulmones con el formaldehído. Deja los pulmones bajo presión durante al menos 20 min.
7. A continuación, atar la tráquea más allá del extremo de la aguja trozo. Puede ayudar a retroceder lentamente en la aguja para exponer más de la tráquea uncannulated. Cuando atada con seguridad, retire la llave de paso.
8. Diseccionar cuidadosamente los pulmones.
9. Coloca los pulmones en formaldehído durante la noche. Tiempos más largos están muy bien, y algunas manchas o procedimientos pueden especificar tiempos específicos. También cualquier otros fijadores líquidos, tales como z-fix se pueden utilizar para la instilación y la inmersión.
10. Antes de su posterior procesamiento histológico, midael volumen pulmonar fija como se describe a continuación.

3. Medición del volumen pulmonar fijo

1. Medir el volumen de pulmón utilizando el principio de Arquímedes, como se ilustra en la Figura 4. Retire el pulmón fija desde el formaldehído y diseccionar el corazón y cualquier otro tejido no pulmonar.
2. Utilice un dispositivo de fabricación casera sencilla previamente construido soporte de alambre que se utiliza para mantener los pulmones completamente bajo el agua.
   NOTA: Este dispositivo debe ser compatible con lo que el equilibrio se está utilizando. Un dispositivo típico se muestra en la Figura 5 está hecho de pipetas de plástico y fina (20 G) de alambre. Este sistema funciona bien con el saldo utilizado en el vídeo, pero podría ser fácilmente adaptado a la mayoría de balanzas de laboratorio.
3. Coloque un vaso con ≈200 ml de agua en el equilibrio y la tara con la jaula de soporte en su lugar en el agua. Ver Figura 6 Retire la jaula de metal.; colocar el pulmón en la superficie del agua y presione bajo el aguacon la jaula.
4. Anotar el peso en la balanza. Este número refleja el volumen de agua desplazada y es así una medida directa del volumen pulmonar. Tenga cuidado para asegurarse de que el pulmón o de sutura o cualquier parte de la jaula de alambre no toque los lados o fondo del vaso.
5. Para mayor precisión, repetir la medición. Retire el pulmón del agua y seca en un pañuelo de papel. Tarar el vaso con jaula en lugar de nuevo y repetir la medición del volumen pulmonar. Las dos mediciones de volumen deben entonces ser promediados.
   NOTA: Si los pulmones se dejan en el formalina durante más de aproximadamente una semana, el aire en los pulmones se disolverá en el líquido. Cuando esto sucede, el pulmón se hundirá, por lo que ya no es necesario el uso de cualquier dispositivo como en la Figura 5 para mantener el pulmón sumergido. En tal caso, el volumen se puede medir por simplemente manteniendo el pulmón por uno de los hilos de sutura hasta que esté completamente sumergida como se ilustra en la Figura 4.

Resultados

El procedimiento se describe en el primer protocolo no por sí mismo conducir a ningún resultado generalizadas. Sólo se describe un medio muy fiable para inculcar sustancias directamente en la tráquea. La figura 7 muestra un ejemplo de un pulmón en el que se instiló azul de tripano con el método descrito aquí. Hay una amplia distribución del colorante, similar a lo que se ha visto con otros colorantes o trazadores dadas directamente en la tráquea o los ratones ^11,12. También hemos u...

Discusión

Los procedimientos descritos aquí tienen varias ventajas. En primer lugar el equipo requerido es sencillo y barato. En segundo lugar, la intubación puede hacerse rápidamente con pocos errores. En tercer lugar, la capacidad de fijar los pulmones a una presión constante, y luego medir el volumen pulmonar fijo permite la cuantificación adecuada de estructuras o células en el pulmón ^10.

Una desventaja posible a la intubación es la cirugía menor. Esto puede limitar la capacida...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory Balance	Ohaus	Adventurer Pro Model AV 313	Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter	Insylte		Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle	Various		Several other possible vendors