Aislamiento y cultivo de expansión de las células endoteliales-tumorales específicas

Resumen

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Resumen

Recién aisladas células endoteliales específicos de tumores (TEC) se pueden usar para explorar los mecanismos moleculares de la angiogénesis tumoral y servir como un modelo in vitro para el desarrollo de nuevos inhibidores de la angiogénesis para el cáncer. Sin embargo, a largo plazo en la expansión in vitro de células endoteliales murinas (CE) es un reto debido a la deriva fenotípica en la cultura (transición-endotelial-mesenquimal) y la contaminación con no comunitario. Esto es especialmente cierto para TEC que se outcompeted fácilmente por co-purificado fibroblastos o células tumorales en cultivo. Aquí, un método de aislamiento de alta fidelidad que se aprovecha de enriquecimiento inmunomagnética junto con la selección de la colonia y la expansión in vitro se describe. Este enfoque genera fracciones CE puros que son totalmente libre de contaminación de las células del estroma o tumorales. También se muestra que el linaje de trazado de Cdh5 ^{cre: / l} reportero ratones ZsGreen ^{l / s,} que se utiliza con el protocolo descrito en este documento, son una valiosa herramienta para verificar celularpureza como las colonias de la CE aislados de estos ratones muestran fluorescencia ZsGreen duradero y brillante en la cultura.

Introducción

Las células endoteliales (CE) son esenciales durante el desarrollo de tumores sólidos. A partir de la iniciación del cambio angiogénico en los tumores latentes a la difusión y la siembra de metástasis en sitios distantes, EC formar los conductos que suministran sangre, oxígeno y nutrientes para sostener el crecimiento del tumor ^1. Como se ha sugerido recientemente, EC también tiene funciones de perfusión independiente y formar un nicho que soporta el crecimiento de células madre de cáncer y otras células del estroma tumoral ^2-5. Por lo tanto, altamente purificado específico de tumor CE (TCE) para el cultivo in vitro permite estudios funcionales de rutina que arrojará luz sobre nuevos mecanismos moleculares que median la angiogénesis tumoral y la diafonía con células tumorales.

CE son altamente especializados dependiendo del tejido de origen ^6. Debido a la naturaleza heterogénea de diferentes tipos de tumores y el microambiente tumoral, TEC también puede mostrar características únicas que reflejan una especialización o específico de tumorf la vasculatura. Por ejemplo, no es sorprendente variabilidad en las firmas de expresión génica en TEC aisladas a partir de diferentes tipos o grados de tumores ^7,8. Sin embargo, la co-purificación frecuente de no comunitario, especialmente los fibroblastos asociados al tumor y las células tumorales, con TEC puede confundir a los análisis de la expresión de todo el genoma. Estos tipos de células no deseadas son especialmente problemáticas en los estudios que se basan en a largo plazo en la expansión in vitro de cultivos de TEC.

Aquí descrito es un método de alta fidelidad que produce consistentemente culturas CE puros de tumores y otros tejidos. Tras enriquecimiento columna inmunomagnética de las fracciones de la CE y la eliminación de co-purificado no comunitario, un paso anillo clonación adicional para capturar colonias CE puro se utiliza ^9. Cada colonia se puede expandir en cultivo durante varios pasajes sin la aparición de contaminantes no comunitario. Este método también produce múltiples clones CE de un único procedimiento de aislamiento, que es ideal para el estudio de endoheterogeneidad telial. Además, se muestra que Cdh5 ^{cre: / l} ratones ZsGreen ^{l / s} reportero son una valiosa herramienta para la generación de la CE "destino asignada", indelebles, que mantienen ZsGreen fluorescencia en la cultura ^10. Con pequeños ajustes en el protocolo, este método debe ser adaptable a diferentes tipos de tumores o tejidos normales.

Protocolo

El siguiente protocolo se lleva a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por el Departamento de Medicina de Laboratorio Animal de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.

1. Prepare el siguiente material y reactivos Antes de empezar

1. Preparar los medios de comunicación CE completándola 400 ml bajo nivel de glucosa (1 g / L D-glucosa o LG) de Dulbecco Modificado medio de Eagle (DMEM) con 50 ml de suero bovino fetal inactivado por calor, 50 ml Nu-Serum IV, 5 ml antibiótico-antimicótico, y el hFGF, VEGF, hEGF, R3-IGF-1, y los componentes de heparina desde el kit comercial.
2. Preparar 500 ml de tampón FACS (0,5% de BSA y EDTA 2 mM en PBS); filtrado a través de un 0,22 micras taza del filtro estéril.
3. Esterilizar o desinfectar el tablero de la disección.
4. Esterilizar pasadores de disección, tijeras quirúrgicas, y disectores.

2. Aislamiento CE (Día 1, ~ 5 horas)

1. La eutanasia ratón con el dióxido de carbono u otros métodos ingenio compatibleel Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) políticas h.
   Nota: Múltiples tumores mamarios varían en tamaño (5 - 15 mm de diámetro) pueden desarrollar en un solo ratón modificado genéticamente como C3-TAG, asegúrese de recoger todos ellos para el aislamiento TEC. Si el uso de los tumores que se ortotópicamente injertan en los ratones, piscina de dos a tres 1 cm ^{3 tumores} para un solo aislamiento CE. Aquí usamos tumores mamarios como una demostración, pero el protocolo se puede modificar para otros tipos de tumores.
2. Desinfectar ratón por pulverización o limpiando el lado ventral del ratón con una amplia cantidad de 75% v / v de etanol.
3. Resecar tumores con un par de tijeras y disectores utilizando técnicas asépticas en una campana estéril o en un banco limpio.
   1. Extiende y el pin de las extremidades de los ratones en una tabla de disección. Haga una incisión en la línea media ventral con las tijeras sin necesidad de abrir el peritoneo. Diseccionar lateralmente entre la piel y el peritoneo hacia las glándulas mamarias donde se encuentran los tumores.No abra el peritoneo.
   2. Impuestos Especiales sólo el tejido tumoral de las glándulas mamarias, dejando de lado los márgenes mamarias normales. Recortar con cuidado los tejidos no tumorales, como la piel y los músculos, y coloque los tumores disecados en un tubo cónico que contiene 30 ml de LG-DMEM en hielo.
4. Traiga muestras tumorales a campana de cultivo de tejidos; lavar tejidos con estéril LG-DMEM 1 - 2 veces.
5. Tumores de transferencia del tubo cónico a un cultivo de tejidos placa de Petri estéril, añadir 2 ml de DMEM-LG en el plato, y picar con un par de tijeras estériles en pedazos <5 mm.
6. Añadir 5 ml de colagenasa (stock = 2 mg / ml en solución salina equilibrada de Hank, en lo sucesivo HBSS), 1 ml de dispasa (stock = 2,5 U / ml en HBSS) y 75 l de desoxirribonucleasa (stock = 1 mg / ml en PBS ) en la placa de Petri. Volumen total es ahora ~ 10 ml.
7. Transfiera la mezcla colagenasa / tejido de la placa de Petri a un tubo de tejido-disociador y ejecutar en un disociador de tejido durante 60 segundos dos veces (pre-establecido disociación prOGRAMA en el disociador: 1.270 rondas totales por corrida). Incubar con la luz agitando en un agitador durante 75 minutos a 37 ° C.
8. Filtrar digiere el tejido a través de un filtro de células de 100 micras sobre un tubo cónico de 50 ml. Filtro Enjuague con 5 ml de tampón FACS para lavar las células restantes. Giran a 280 xg durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el sedimento celular.
9. Diluir 1 ml de tampón de lisis RBC de stock (10x) en 9 ml de agua estéril. Lisar células rojas de la sangre con 10 ml de tampón de lisis (1x), e inmediatamente giran 5 min a 280 x g. Nota: Este paso se puede omitir si poco de sangre es visible.
10. Resuspender en 10 ml de tampón FACS. Mezclar 10 l de suspensión celular con 10 l de azul de tripano, y contar las células vivas utilizando un hemocitómetro.
11. Resuspender las células en ~ 10 ⁷ células / 100 l. Añadir 10 l de bloque de FcR por 100 l de suspensión celular, y se incuba en hielo durante 10 min.
12. Añadir el anticuerpo CD31 de rata anti-ratón conjugado con PE según. a la Tabla 1 incubar en hielo durante 10 - 15 min y el tubo de película de vez en cuando.
13. Añadir 10 ml de tampón FACS para el tubo y centrifugado a 280 xg durante 5 min. Retirar con cuidado el sobrenadante, y se lava el sedimento de células de nuevo con 5 ml de tampón FACS. Centrifugar para sedimentar las células. Aspirar el sobrenadante sin sedimento celular perturbador.
14. Añadir tampón y anti-PE FACS microperlas de acuerdo con la Tabla 2 Incubar en hielo durante 10 -. 15 min. Tubo de Flick de vez en cuando.
15. Añadir 10 ml de muestras de tampón FACS y centrifugado a 280 xg durante 5 min; lavar una vez con 5 ml de tampón FACS y se centrifuga de nuevo. Aspirar el sobrenadante sin perturbar pellet.
16. Traiga volumen a 300 l de tampón FACS. Gira a 35 micras de células colador tapado tubo 5 min a 280 x g. Utilice 2 tubos y un volumen mayor si es necesario.
17. Establecer Multistand magnético y columnas magnéticas en el capó, adjunte una columna para el separador y equilibrar la columna con 2 ml de tampón FACS.
18. Aspirate el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 0,5 - 1 ml de tampón FACS.
19. Pasar la suspensión celular a través de la columna magnética equilibrada.
20. Lavar la columna tres veces con 2 ml de tampón FACS, y recoger flujo a través (FT) en un tubo de 15 ml (fracción FT).
21. Tomar la columna fuera del separador y se eluye con 2 ml de tampón de FACS en otro tubo de 15 ml (fracción de eluato). Utilice émbolo para asegurar que todas las células están fuera de la columna. Repita la elución dos veces más con 2 ml de tampón FACS cada vez.
22. Haga girar el eluido a 280 xg durante 5 min.
23. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de los medios de comunicación de la CE.
24. Igualmente dividir la fracción de eluato (~ 6 ml) en platos recubiertos de gelatina 10 cm. Durante tres 1 cm ^{3 tumores,} placa de células eluye en al menos cuatro placas. Células Alternativamente, la placa eluyó a diferentes concentraciones en varias placas (por ejemplo., Sembrar 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml y 3 ml de eluido en cuatro placas) para asegurar que unt menos una placa está escasamente siembra con células eluidas. Compruebe que la confluencia de las células unidas se encuentra en ~ 1% al día siguiente (es decir, aproximadamente 1,0 - 2,0 x 10 ⁵ células unidas).
    Nota: Las células necesitan ser chapado escasa de modo que las colonias de la CE pueden formar sin estar contaminados por otros tipos de células.
25. Fracción FT placa en una placa de 10 cm para permitir células recuperan O / N. Compruebe que la placa es de 80 - 100% de confluentes al día siguiente. Congele por las células (-80 ° C) en 250 medios de congelación de células mu l en un criotubo y almacenarlas en nitrógeno líquido al día siguiente. Nota: fracción FT se puede utilizar para el aislamiento de células tumorales en una etapa posterior y / o como un control negativo para el análisis de la expresión génica CE de los clones aislados de la CE.
26. Cambie los medios de comunicación cada 2 - 3 días. Las colonias empiezan a formar después de 7 - 10 días. Colonias pequeñas de la CE pueden ser identificados ya en el día 3. Marque las colonias con un marcador de punta fina en el fondo del plato.
27. Raspe c inespecíficaells rodean las colonias identificadas con una punta pippet 200 l estéril.

3. Colonia Selección Anillos Usando Clonación

1. Cambie los medios de comunicación cada 2 - 3 días. Pureza CE se puede comprobar por las LDL (Dil-Ac-LDL) Además en unos 5-7 días. Añadir 50 l de LDL por 10 ml de medio CE y se incuba durante 3-4 horas antes de comprobar las células bajo el microscopio de fluorescencia.
   Nota: LDL Múltiple ⁺ clones de la CE se pudieron observar en ~ 7 días.
2. Comience cosechar colonias CE cuando alcanzan diámetros de 3 - 5 mm de tamaño. (Elija grandes colonias que están llenas de pequeñas de LDL ^{+ células} para obtener mejores resultados.)
3. Antes de la cosecha de la CE con los anillos de clonación, pre-capa de unos 6 y placas con 0,5% de gelatina. Aspirar gelatina, añadir 2 ml de medio CE a cada pocillo, y mantener las placas en una incubadora hasta que se necesite.
4. Raspe no comunitario en los bordes de las colonias para asegurarse de que no hay otros tipos de células serán atrapados dentro del anillo de la clonación.
5. Usando unmicroscopio de contraste de fase (4X o 10X objetivo), se rodeará con un marcador de punta fina en la parte inferior de la placa de cultivo de las áreas que contienen colonias de la CE.
6. Lavar la placa con 10 ml de PBS y dejar una capa muy delgada de PBS en la placa cuando la aspiración. (Importante: una pequeña cantidad (~ 0,5 ml) de PBS mantendrá células vivas durante el procedimiento de anillo clonación; también, adhesivo tisular necesita agua para unir.)
7. Elija un anillo de clonación de tamaño apropiado. Use un par de pinzas de disección para recoger un anillo, y con una punta de pipeta de 10 l aplicar uniformemente una pequeña cantidad de adhesivo tisular en el anillo de la clonación.
   Nota: utilice sólo la cantidad mínima (~ 0,2 l de un pequeño anillo) de adhesivo tisular en los anillos de clonación, y crea adhesivo tisular seguro se extiende de manera uniforme alrededor de la superficie del fondo para asegurar un buen sellado. Adhesivo tisular excesivo produce calor y forma películas que pueden matar a las células.
8. Coloque el anillo de la clonación sobre la colonia CE. Presione suavemente el anillo de clonación para pegar los ring en el plato. Asegúrese de que las colonias no se secan antes de pegar el anillo.
9. Inmediatamente pipeta 25 l de solución de desprendimiento celular enzimática en el anillo de clonación e incubar ~ 1 min o hasta que las células están débilmente unidos.
10. Células de pipeta en el anillo de clonación gota a gota en un pocillo de una placa de 6 pocillos que contienen los medios de comunicación de la CE pre-calentado. (Importante: No agitar la placa para dispersar las células; CE prefieren crecer en racimos apretados.) Lave el anillo de la clonación con 50 - 100 medios de comunicación de la CE mu l recoger tantas células como sea posible, y la transferencia de todos los lavados en el mismo de 6 pocillos .
11. Si algunas colonias en la placa de 10 cm son demasiado pequeños para cosechar, añadir 10 ml de medio fresco, deje que las colonias crecen durante unos cuantos días, y repita el procedimiento de clonación anillo nuevo.
12. Crecer colonias cosechados en placas de 6 pocillos hasta 80-100% de confluencia, y la transferencia de células de 3 pocillos de una placa de 6 pocillos, antes de expandirse en una placa de 10 cm de cultivo de tejidos. Raspe células contaminantes. Repetirotra ronda de procedimiento anillo de clonación (Pasos de 03.05 a 03.10) si es necesario. Mantenga células relativamente confluente (~ 60-70%) cuando se expande. CE puede dejar de crecer si chapado demasiado escasos.
13. Caracterizar CE por FACS, tinción, PCR, etc. Tenga en cuenta que Dil-Ac-LDL es fluorescente y puede interferir con PE u otros anticuerpos fluorescentes para FACS.

Resultados

CE representan solamente una fracción pequeña de la población total de células en la mayoría de los tejidos adultos ^11. Por tanto, es importante para digerir completamente el tejido recogido en una suspensión de una sola célula que asegura la liberación máxima de CE de la matriz extracelular (ECM) y los tejidos conectivos. En nuestra experiencia, la selección inmunomagnética CD31 mediada sólo proporciona fracciones enriquecidas de la CE, pero no puros; por lo tanto, un paso crucial es la eliminaci...

Discusión

Debido a las dificultades en la obtención de cultivos puros TEC primaria, muchos estudios in vitro TEC sustituto con las líneas de la CE disponibles comercialmente o CE primaria como la vena umbilical humana CE (HUVEC) ^13. Sin embargo, estas poblaciones de la CE de los tejidos normales sólo se pueden servir como sustituto de la TEC que difieren notablemente de sus homólogos normales. Por ejemplo, TEC son fenotípicamente y funcionalmente anormal in vivo y algunas de estas anomalías pued...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Sigma-Aldrich	A5955
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM)	Gibco	11885-084
EGM-2 Bullet Kit	Lonza	CC4176	Not all components used
Fetal bovine serum (Hyclone)	Thermo Scientific	SH30071.03	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Nu-Serum IV	Corning	CB-51004
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS)	Gibco	14175-095
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	14190-144
FACS buffer			0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter
75% v/v ethanol for disinfection
Anti-PE microbeads	Miltenyi Biotech	130-048-801
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5%	Gibco	15260-37
Cell freezing media (Bambanker)	Wako Chemicals	302-14681
Collagenase type II	Worthington Biochemical	LS004176	Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS
Deoxyribonuclease I (DNase)	Worthington Biochemical	LS002004	Make stock concentration 1 mg/ml in PBS
Dil-Ac-LDL	Biomedical Technologies	BT-902
EDTA, 0.5M, pH 8.0	Cellgro	46-034-CL
Enzymatic cell detachment solution (Accutase)	Sigma-Aldrich	A6964-100ML
Gelatin, 2% in water, tissue culture grade	Sigma-Aldrich	G1393-100ML	Dilute in PBS to make 0.5% gelatin solution
Mouse FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotech	130-092-575
Neutral protease (Dispase)	Worthington Biochemical	LS02104	Make stock concentration 2.5 U/ml in HBSS
PE-rat anti-mouse CD31 antibody	BD Pharmingen	553373
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse)	BD Pharmingen	555899
Sterile water
Trypan blue, 0.4 %	Life Technologies	15250-061
10 mm tissue culture dishes	Corning
15 ml conical tubes (sterile)	Corning
50 ml conical tubes (sterile)	Corning
6-well tissue culture plates	Corning
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes)	Miltenyi Biotech	130-093-237
Cell Separator  (MidiMACS)	Miltenyi Biotech	130-042-302
Cell strainer 100 μm	Corning	352360
Cloning rings (assorted sizes)	Bel-Art Products	378470000
Cryotubes	Thermo Scientific
Dissecting board			Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use
Dissecting forceps and scissors			Sterilize before use
Dissecting pins 2"			Sterilize before use
FACS tubes with 35 μm filter cap	Corning	352235
Filter cup (Stericup, 0.22 μm)	Millipore	SCGPU05RE
Fine-tip marker
Hemocytometer
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
Magnetic Multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Or a centrifuge with similar capacity for 15 ml and 50 ml conical tube centrifugation
Tissue culture hood
Tissue dissociator (gentleMACS)	Miltenyi Biotech	130-093-235	Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation
Liquid nitrogen freezer
Microplate or rotary shaker
Phase contrast light microscope