Ferromagnético Bare Metal stent para la captura de la célula endotelial y Retención

Resumen

Nuestros objetivos eran para diseñar, fabricar y probar los stents ferromagnéticos para la captura de las células endoteliales. Diez stents fueron probados para la fractura y 10 más stents se ensayaron para determinar el magnetismo retenido. Finalmente, 10 stents se probaron in vitro y 8 más stents fueron implantados en 4 cerdos para mostrar la captura de células y la retención.

Resumen

Se necesita endotelialización rápida de los stents cardiovasculares para reducir la trombosis del stent y evitar la terapia anti-plaquetaria que puede reducir el riesgo de hemorragia. La viabilidad de utilizar fuerzas magnéticas para capturar y retener células endoteliales excrecencia (EOC) marcadas con nanopartículas de óxido de hierro súper paramagnéticas (SPION) se ha demostrado previamente. Sin embargo, esta técnica requiere el desarrollo de un stent mecánicamente funcional a partir de un material magnético y biocompatible seguido de in-vitro e in-vivo de pruebas para demostrar la endotelización rápida. Hemos desarrollado un stent débilmente ferromagnética de acero inoxidable de 2.205 duplex utilizando el diseño asistido por ordenador (CAD) y su diseño se refinó aún más el uso de análisis de elementos finitos (FEA). El diseño final del stent exhibió una deformación principal por debajo del límite de fractura del material durante rizado mecánico y expansión. Cien stents fueron fabricados y un subconjunto de ellos se utilizó para ensayos mecánicos, retained mediciones del campo magnético, estudios in vitro de captura celular, y los estudios in vivo de implantación. Diez stents fueron probados para su despliegue para verificar si sostenidas que prensa y la expansión del ciclo sin fallo. Otros 10 stents se magnetizan usando un imán fuerte neodimio y se midió su campo magnético retenido. Los stents mostraron que el magnetismo retenido era suficiente para capturar marcado con SPION EOC en nuestros estudios in vitro. Captura EOC SPION marcado y la retención se verificó en modelos animales grandes implantando 1 stent magnetizado y 1 no magnetizado stent de control en cada uno de 4 cerdos. Las arterias con stent se explantaron después de 7 días y se analizaron histológicamente. Los stents débilmente magnéticas desarrolladas en este estudio fueron capaces de atraer y retener a las células endoteliales SPION marcado que pueden promover la curación rápida.

Introducción

Patients implanted with vascular stents manufactured from thrombogenic materials like stainless steel, cobalt chromium, and platinum chromium – both bare metal stents (BMS) and drug eluting stents (DES) – need anti-platelet therapy to prevent thrombus formation. BMS heal rapidly, but are subject to late stage restenosis due to incomplete healing. DES require long term anti-platelet therapy due to delayed healing. Anti-platelet therapy administered to avoid thrombosis as a result of incomplete or delayed healing leads to increased bleeding risk and may not be suitable for certain patients^1,2. An ideal stent will heal completely and quickly thus avoiding long-term anti-platelet therapy and late stage restenosis. This complete healing can only be achieved if the stent is rapidly coated with a monolayer of endothelial cells after implantation. Coating the stents with biocompatible materials such as gold or other biopolymers has been shown to improve thrombo-resistance, but none of these techniques achieved ideal blood compatibility as may be possible by coating with endothelial cells^3,4.

A stent can be coated with endothelial cells post implantation by attracting circulating progenitor cells. This self-seeding technique can be achieved by utilizing ligands and antibodies. But this technique is limited by the low number of circulating endothelial progenitor cells. A promising strategy is to deliver cells directly to the stent immediately following implantation during a short period of blood flow occlusion^3,5. This strategy requires a technique for rapidly capturing cells and retaining them on the stent even after restoring blood flow. We have developed a technique in which a magnetic stent is used to attract and retain magnetically-labeled endothelial cells delivered post implantation. To achieve this, a functional BMS with sufficient magnetic properties to capture and retain magnetically-labeled endothelial cells is required⁶.

In this paper, we discuss the methods for designing, manufacturing, and testing a 2205 stainless steel stent. The stents were designed using CAD and FEA. The manufactured stents were magnetized using a neodymium magnet and the retained magnetic field was measured using a magneto-resistance microsensor probe. We then tested the stents for magnetically-labeled cell capture in a culture dish during our in-vitro experiments. Finally, the stents were tested in-vivo by implanting magnetic and non-magnetic stents in 4 pigs and histologically analyzing the stented arteries.

Protocolo

Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el Comité de Utilización (IACUC) en la Clínica Mayo.

1. Diseño y análisis de un stent de acero inoxidable 2205

1. El diseño de un stent metálico utilizando CAD
   1. Hacer un cilindro hueco extruido seleccionando en función de 'jefe extruido / base "con el espesor de pared igual al espesor del puntal del stent.
   2. Diseñar un modelo de stent en un plano de boceto diferente tangente al cilindro extruido. Hacer la anchura del patrón plano para que coincida con la circunferencia del cilindro hueco extruido.
   3. Transfiera el patrón de diseño plano sobre el cilindro hueco utilizando la función de envoltura.
   4. Guarde la pieza en su formato original y también en formato ACIS a exportar para FEA.
2. El análisis de elementos finitos para los modelos de stent
   1. Importe la geometría sólida guardado en formato ACIS en el módulo de parte del software de FEA para más analyses.
   2. Modelo 2 cilindros analíticos coaxialmente al stent en el modelador de parte del software FEA. El cilindro exterior tiene un diámetro inicial mayor que el diámetro de la endoprótesis para simular el rizador y el cilindro interior tiene un diámetro inicial de 1 mm para simular un globo para la inflación.
   3. Doble click en la opción 'casos' árbol del modelador de montaje para montar lo anterior dijo piezas en posiciones relativas.
   4. Utilice el módulo de la malla del software FEA, especifique el tipo de elemento como 20-nodo de elemento hexaédrica con integración reducida, especifique el tamaño del elemento, y la malla del stent.
   5. Especificar pares de contacto rígidas sin fricción entre el stent y los dos cilindros, respectivamente, en las "propiedades de interacción" del árbol del modelo.
   6. Asigne el comportamiento tensión-deformación elasto-plástico de 2.205 de acero inoxidable para el modelo de stent.
   7. Definir las condiciones de contorno para engarzar en primer lugar, el cilindro exterior de 1 mm, que simula la cRimping del stent. Retire el cilindro exterior para simular la relajación del stent engarzado. Expandir el cilindro interior a 3 mm para simular la expansión y finalmente, retirar el cilindro interior para simular retroceso del stent.
   8. Definir los parámetros de simulación, incluyendo el número de procesadores y la cantidad de memoria RAM asignados en el ítem del árbol de modelo "Análisis" y ejecutar la simulación.
   9. Una vez que la simulación es completa, abrir el archivo resultado (filename.odb) y post-proceso de los resultados para estudiar las deformaciones principales y iterativamente mejorar el diseño del stent para lograr una cepa principal de 20%, que es menor que el límite fallo del material .

2. Fabricación de stent y pruebas para que prensa y Expansión

1. Fabricación de stent
   1. Obtener los tubos de acero inoxidable de 2205 por la perforación del arma y la precisión de barras de molienda stock de material en un mecanizado de precisión empresa como Acción Precision Products en Pioneer,OH.
   2. Transfiera los tubos de tierra de precisión y el diseño del modelo del stent plana a una empresa de corte stent como Laserage Technology Corporation en Waukegan, IL de corte por láser y electropulido.
   3. Pasivar la superficie de los stents electropulido sumergiendo en un ácido fuerte (50% HCl) durante 10 min seguido de una base (10% NaHCO ₃₎ durante otros 10 min. PRECAUCIÓN: manejar productos químicos con equipo de protección adecuado y bajo una campana de humos. Finalmente, lavar los stents con alcohol etílico y agua desionizada. Este proceso se llama decapado con ácido.
2. Prueba de stent fabricado para prensar y expansión
   1. Unir el stent sobre un globo tríptico utilizando una mano herramienta que prensa. Sostenga el stent y el globo tríptico en la herramienta que prensa. Presione el asa para deformar radialmente el stent se doble, en el globo.
   2. Inspeccione el stent engarzado con un microscopio para engaste uniforme y cualquier señal de fallo en la estructura debidoa la deformación plástica.
   3. Expandir al diámetro de 3 mm diseñado mediante la presurización del globo tríptico con agua. Examine los stents expandidos para fracturas microscópicas y expansión uniforme.

3. Caracterización de Stent para Campo Magnético Retenido

NOTA: imán cilíndrico de 2 pulgadas de diámetro y 1 pulgada de altura se utilizó en este estudio. Los polos del imán están alineados a lo largo del eje. La densidad de superficie de flujo magnético del imán es de aproximadamente 1 T.

1. Magnetizar los stents diametralmente o axialmente mediante un potente imán de neodimio. Sostenga el stent cerca del imán fuerte durante aproximadamente 1 min para la magnetización.
2. Sostenga el stent en una de las caras planas con su diámetro a lo largo de las líneas de campo magnético para ser magnetizados diametralmente o sostener el stent junto a la superficie cilíndrica con su eje a lo largo de las líneas de campo magnético para magnetizar axialmente. Fiel magnética Retenidod del stent se encontró que era estable durante al menos 24 horas, pero utilizar el stent tan pronto como sea posible después de la magnetización.
3. Montar los stents individualmente sobre mandriles de vidrio y luego montar los mandriles de vidrio en el mandril de precisión de la fijación de sondeo magnético. Microsensor sonda magnética puede ser posicionada precisamente cerca de la stent sin tocar la superficie usando el XYZ fases de montaje del dispositivo de fijación de sondeo magnética (Figura 4).
4. Medir la lectura de referencia del microsensor magnético lejos del stent y luego medir el campo magnético retenido en la superficie del stent mediante la colocación de la sonda utilizando las etapas XYZ de la fijación de sondeo magnético.

4. Estudios captura de células magnéticas

1. La obtención de células, etiquetado con SPION y tinción con colorante fluorescente
   1. Derivar las células endoteliales excrecencia (EOC) de sangre periférica porcina como se describe en ^5,7. Cultura en un matraz T-75 until aproximadamente el 80% de confluencia (5x10 ^{6 a} 8x10 ⁶ células).
   2. Sintetizar SPIONs como magnetita diámetro de 10 nm (Fe _{3 O 4)} núcleo rodeado por 50 nm de espesor de poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) shell como se describe en el ^8,9.
   3. Incubar la EOC derivada con SPION a una concentración de 200 g / ml de medio de cultivo celular durante 16 horas a 37 ^{° C}
   4. Aspirar el medio de cultivo celular suavemente. Lave suavemente las células mediante la adición de 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) al matraz, balanceo, y aspirar el PBS.
   5. Teñir las células con tinte fluorescente (CM-Dil) para la visualización durante los experimentos. Esto se realiza según las instrucciones del fabricante mediante la adición del colorante a 10 ml de medio de cultivo celular a una concentración de 5 l / ml y la incubación con las células durante 30 min a 37 ° C.
   6. Se lavan las células con PBS como en el paso 4.1.4 e incubar con 3 ml de solución de tripsina-EDTA 0,25% durante 5 min a 37 ° C alevantar las células del matraz.
   7. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml, con parte superior de PBS, y se centrifuga a 500 xg durante 5 min para formar un sedimento celular.
   8. Vuelva a suspender el sedimento celular en PBS a una concentración de 1-2x10 ⁶ células / ml y mezclar bien con la pipeta dentro y fuera del tubo cónico varias veces.
2. Los estudios in vitro de células
   1. Diseñar y fabricar (por ejemplo, la impresión 3D) en un accesorio sencillo para sujetar el stent justo por encima de la superficie de un cubreobjetos de vidrio.
   2. Desmagnetice un stent utilizando un degausser electromagnética o magnetizar un stent diametralmente o axialmente usando un imán fuerte neodimio.
   3. Pipetear la EOC SPION marcado suspendido en PBS en el plato que contiene los stents de control axialmente magnetizados o diametralmente magnetizadas o no magnetizadas. Imagen de los stents con EOC suspendido en PBS inmediatamente para la fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia invertida.

5. En vivo Los estudios en animales

1. La implantación del stent
   1. Dibuja sangre periférica de 4 cerdos Yorkshire sanos - un peso aproximado de 50 kg - 3 semanas antes de la implantación de stent, respectivamente, y la cultura EOC como se describe en ^5,7.
   2. Administrar la medicación antiplaquetaria comenzando 3 días antes de la cirugía (aspirina 325 mg y clopidogrel 75 mg al día).
   3. En el día de la implantación del stent, anestesiar a los cerdos con intramuscular Telazol, xilazina y atropina (5 / 2-3 / 0,05 mg / kg, respectivamente) como se indica en las directrices para el cuidado de los animales y el uso institucionales aplicables.
   4. Intubar y colocar el cerdo en la inhalación de 1-2,5% anestesia isoflurano.
   5. Afeitarse la región del cuello ventral del cerdo y llevar a cabo el procedimiento en condiciones estériles generales.
   6. Implante 1 magnetizado y 1 stent no magnetizado en la arteria coronaria derecha (CD) utilizando la técnica de cateterismo cardíaco normal.
      1. Catheterización de los animales debe ser realizado por un cardiólogo intervencionista entrenado. Acceder a la arteria carótida derecha con una vaina francés 9.
      2. Canular la arteria coronaria diana y se inyecta un medio de contraste yodado para obtener imágenes de fluoroscopia.
      3. Coloque un alambre guía estándar de 0,014 pulgadas coronaria en la arteria. Avance el balón y el stent usando este cable guía y desplegar el stent en un vaso de diámetro 3-3,5 mm.
   7. Ocluir el flujo de sangre dentro de la RCA proximal a los stents implantados usando un globo sobre el alambre y entregar aproximadamente 2x10 ⁶ EOC autólogo marcado con SPION suspendido en 4 ml de PBS a través del catéter central durante un período de 2 min.
   8. Restablecer el flujo sanguíneo a la RCA después de 2 min de la oclusión adicional.
   9. Traslado al animal a la sala de recuperación y vigilar de cerca al animal hasta que se haya recuperado la conciencia.
   10. Continuar para administrar medicamentos anti-plaquetas (aspirina 325 mg y clopidogrel 75 mg) después de la operación hasta el sacrificio.
2. Stent explante y la histología
   1. La eutanasia a los animales 7 días después de la cirugía por primera anestesiar al animal como se ha explicado anteriormente y luego administrar por vía intravenosa una dosis letal de pentobarbital sódico (100 mg / kg) según las pautas de cuidado de animales y uso institucional aplicables.
   2. Quirúrgicamente cosechar los segmentos arteriales con stent. Fijar las arterias explantadas en tampón de formalina al 10% durante un mínimo de 30 min. Deje las muestras en tampón de formol para su posterior análisis histológico.
   3. Externalizar la muestra fijada a las instalaciones capaces de realizar la histología con stents metálicos. Durante este tratamiento, las muestras se incrustan en metacrilato de metilo, seccionada, y se analizaron histológicamente usando técnica de tinción de Mallory con tinción de azul de Prusia para partículas de hierro.

Resultados

Diseño de stent iterativo basado en FEA (Figura 1) mostró un stent que puede engarzado y ampliar con una cepa principal de 20%, que es menor que la deformación última 30%. Que prensa y ensayo de expansión (Figura 2) no mostraron signos de fractura. Fotos del stent deformado mostraron buen acuerdo con deformaciones FEA calculados y también imágenes de microscopía no mostraron fracturas (Figura 3). Como era de esperar de las mediciones del campo magnético r...

Discusión

Hemos desarrollado un stent magnética que puede funcionar como un stent de metal desnudo y puede atraer a las células endoteliales SPION marcado. En estudios previos relacionados con stents magnéticos, los investigadores han utilizado níquel stents recubiertos comerciales y bobinas o mallas hechas de materiales magnéticos debido a la falta de disponibilidad de un stent ferromagnético ^5,10-14. Otros grupos también han utilizado la naturaleza paramagnética de stents de acero inoxidable 304-grado disponi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2205 Stainless steel	Carpenter Technology Corporation		Round bar stock material
Abaqus	Dassault systems		Software
Atropine			Prescription drug.
Clopidogrel			Commercial name: Plavix. Prescription drug.
CM-DiI	Life Technologies	V-22888	Molecular Probes, Eugene, OR
Endothelial growth medium-2	Lonza	CC-3162
Hand Held Crimping tool	Blockwise engineering	M1-RMC
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	MFCD00011324	CAUTION: wear proptective equipment and handle under fume hood
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care, Inc.
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	MFCD00003568
NdFeB magnet 2" Dia x 1" thick	Amazing magnets	D1000P	Axially magnetized disc magnet with poles on flat faces
Over-The-Wire trifold balloon			Any commercially available OTW trifold balloon can be used
Phosphate buffered saline	Life Technologies	10010-023	Commonly known as PBS
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma Aldrich	MFCD00003528
Sodium pentobarbital	Zoetis		Commercial Name: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi.  Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
SolidWorks	Dassault systems		Software
SpinTJ-020 micro sensor	MicroMagneitcs Sensible Solutions		Long probe STJ-020 microsensor
SPION	Mayo Clinic		Nanoparticles synthesized internally (Ref: Lee, S. J. et al. Nanoparticles of magnetic ferric oxides encapsulated with poly(D,L latide-co-glycolide) and their applications to magnetic resonance imaging contrast agent. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004))
Telazol	Zoetis		Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
Trypsin EDTA	Life Technologies	25200-056	Gibco, Grand Island, NY
Xylazine	Bayer Animal Health		Commercial name: Rompun. Controlled sunstance to be ordered only by a licensed veternarian