Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

Resumen

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Resumen

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H₂O₂ into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H₂O₂ compared to a no H₂O₂ control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H₂O₂. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Introducción

Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium that produces a variety of pigments including pyomelanin, a red-brown pigment that helps provide protection from oxidative stress^1-4 and binds a variety of compounds, including aminoglycoside antibiotics^5-7. Pyomelanin production is caused by a defect in the tyrosine catabolism pathway^4,8, either through deletions or mutations of the gene encoding homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA)^1,9 or through imbalances in the various enzymes in the pathway¹⁰. Homogentisate accumulates due to inactivation of HmgA, and is secreted and oxidized to form pyomelanin¹¹. Production of pyomelanin can be abolished or reduced in a dose dependent manner through treatment with the herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)¹², which inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) in the tyrosine catabolism pathway¹³. Hpd is required for the formation of homogentisate, and therefore pyomelanin¹¹.

We describe in detail three techniques that were important in our studies of NTBC treatment of pyomelanin producing strains of P. aeruginosa. These techniques include titration of NTBC to determine the concentrations that will abolish or reduce pyomelanin production in laboratory and clinical pyomelanin producing strains, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics when bacteria are treated with NTBC, and the resulting sensitivity to oxidative stress with NTBC treatment.

The titration assay we developed serves two purposes. First, the assay will allow the user to determine if NTBC can abolish or reduce pyomelanin production in the bacterium being studied and at which concentrations. This will allow the user to determine sensitivity to NTBC, since different strains of bacteria may have different sensitivities to this compound, as observed in P. aeruginosa¹². Second, the NTBC titration assay will allow the user to determine the appropriate concentration of NTBC to use in subsequent assays, such as antibiotic MIC and oxidative stress response assays, if the goal is to abolish or reduce pyomelanin production and determine the effects of pigment reduction.

The titration assay works because a visible difference in pyomelanin production can be seen in strains treated with NTBC and the differences in pyomelanin production are dose dependent¹². Additionally, this technique can be applied to the study of other compounds that may eliminate or enhance pigment production in bacteria.

Antibiotic MICs are used to determine the sensitivity of bacteria to antibiotics. There are several methods to determine MICs, including agar dilution plates and broth dilutions¹⁴. Broth dilutions can be performed in small test tubes or in a 96-well microtiter plate. The microtiter plate method of MIC determination described herein will allow the user to test a wide range of antibiotics using a minimum of resources. The assay provides reproducibility as well as flexibility in the number of antibiotics and strains tested by this method. Additionally, with the incorporation of NTBC in the assay, the user can determine if elimination or reduction of pyomelanin production alters antibiotic sensitivity in bacteria that produce pyomelanin.

Bacterial response to oxidative stress can be tested in several ways. The most common methods described are either viable counts of bacteria subjected to oxidative stress for a period of time¹, or oxidative stress disc diffusion assays¹⁵. These methods tend to use high concentrations of oxidative stressors to examine the effects of oxidative stress in bacteria and results can be quite variable between biological replicates. The viable count assay also tends to use more agar plates than the other methods. The spot plate assay we describe uses low concentrations of H₂O₂ and allows the user to test the oxidative stress response of multiple strains using a minimum of plates. The assay is also consistently reproducible between technical and biological replicates. As pyomelanin is involved in resistance to oxidative stress, the incorporation of NTBC in the assay allows the user to determine the effects of elimination of pyomelanin production on oxidative stress resistance.

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Protocolo

1. Preparación de medios de cultivo, antibióticos, y 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoil] -1,3-ciclohexanodiona (NTBC)

1. Hacer caldo LB (1% triptona, extracto de levadura 0,5%, 0,25% de NaCl en H ₂ O) y alícuota en volúmenes apropiados. Esterilizar en autoclave. Almacenar a temperatura ambiente.
2. Hacer 100 ml de LB agar (1% triptona, extracto de levadura 0,5%, 0,25% de NaCl, 1,5% de agar en H ₂ O) en matraces de 250 ml. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente. Asegúrese de que el agar se derrita antes de verter en placas.
   NOTA: Los frascos que contienen 100 ml de agar LB producirá 4 platos. La cantidad de agar LB puede ser alterado para que se corresponda con el número de placas necesarias para el ensayo.
3. Hacer PBS (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO ₄₎ ^16. Esterilizar en autoclave o filtración y se almacena a temperatura ambiente.
4. Preparar las soluciones madre de antibióticos para la gentamicina, kanamicina, und tobramicina.
   1. Preparar las concentraciones de valores antibióticos apropiados para P. aeruginosa cepas que contienen 100 mg / ml de gentamicina, 30 mg / ml de kanamicina, y 10 mg / ml de tobramicina. Disolver los antibióticos en el agua, esterilizar filtro (0,2 micras), y se almacena a 4 ° C. Alterar los antibióticos y concentraciones dependiendo de la bacteria estudiada.
5. Preparar las soluciones madre NTBC. Disolver 10 mg de NTBC en 400 l de DMSO. Esto produce una concentración de 75,9 mM NTBC. Tienda soluciones NTBC acciones a -20 ° C. Soluciones Descongelar a temperatura ambiente, según sea necesario.
   NOTA: Diferentes fuentes de NTBC tienen diferencias en la solubilidad. Determinar el vehículo apropiado en el que se disuelva el NTBC basado en las recomendaciones del fabricante y ajuste Paso 1.5 en consecuencia.

2. NTBC titulaciones de Cepas bacterianas

1. Establecer cultivos de una noche de las cepas a ensayar. Añadir 2 ml de LB tubo de ensayo de caldo de 16 x 150 mms (uno por cepa) y inoculan con 1 aislada colonia de cada cepa. Incubar durante la noche a 37 ° C con aireación en un rotador de cultivo de tejidos en una incubadora de aire.
2. El día siguiente, se preparan titulaciones de NTBC en caldo LB. Utilice un rango inicial de 0 a 900 mM NTBC desde diferentes cepas tienen diferencias en la sensibilidad a la NTBC.
   1. Añadir 1 ml de caldo LB a 4 a 5 tubos de ensayo (16 x 150 mm) por cepa.
   2. Añadir la solución madre NTBC (75,9 mM) a los tubos de ensayo (16 x 150 mm) en un intervalo de concentraciones. Ver Tabla 1 para las concentraciones NTBC y volúmenes de valores correspondientes a añadir a 1 ml de caldo LB.
3. Mida la OD ₆₀₀ de los cultivos de una noche. Lávese las culturas antes de tomar OD ₆₀₀ lecturas para eliminar pyomelanin presente en los medios de comunicación.
   1. Lávese las culturas mediante la centrifugación de 1 ml de la cultura en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante y las células sedimentadas vagamente conuna micropipeta y resuspender el sedimento celular sólida en 1 ml de LB.
4. Inocular los tubos de titulación a una DO ₆₀₀ 0,05. Calcular la cantidad de cultivo se lavó necesaria para inocular los tubos.
   NOTA: Utilice las culturas lavadas para inoculaciones desde pyomelanin no debe estar presente.
5. Incubar los tubos de titulación durante aproximadamente 24 horas a 37 ° C con aireación usando un cultivo de tejido de los rotadores en una incubadora de aire.
6. Fotografiar los tubos de valoración y comparación de la producción de pigmento dentro y entre las cepas para determinar la cantidad de NTBC utilizar para los ensayos de MIC y el estrés oxidativo. Utilice OD ₆₀₀ lecturas para determinar la cantidad de pyomelanin en la celda sobrenadante del cultivo libre y para determinar la densidad celular.
   NOTA: La relación de OD ₆₀₀ de pyomelanin en el sobrenadante del cultivo de células se puede calcular para cuantificar las diferencias en la producción pyomelanin después del tratamiento con NTBC.

3. antibióticos inhibi mínimoConcentración (MIC) Ensayo tory en placas de 96 pocillos

1. Establecer cultivos de una noche de las cepas a ensayar en LB con y sin NTBC.
   NOTA: Este protocolo se describe utilizando el nivel representativo de 300 M NTBC. El nivel apropiado de NTBC para ser utilizado se determina en el paso 2.6.
   1. Añadir 300 mM NTBC a 2 ml LB. Añadir un volumen equivalente de vehículo (DMSO) a 2 ml de LB para la condición no NTBC.
   2. El uso de palillos de dientes estériles, inocular tubos con una colonia aislada de bacterias. Habrá una cultura con NTBC y una cultura sin NTBC para cada cepa. Incubar durante la noche a 37 ° C con aireación usando un cultivo de tejido de los rotadores en una incubadora de aire.
2. Al día siguiente, hacer que las soluciones magistrales LB + DMSO LB + NTBC y para configurar el ensayo MIC. Añadir NTBC a una concentración de 600 mM como este se diluirá doble cuando se añade inóculo, produciendo una concentración final de 300 mM.
   1. Para probar un solo antibiótica de una cepa, añadir 600 M NTBC a 2 ml de LB y mezclar para que la solución principal NTBC. Añadir un volumen equivalente de vehículo (DMSO) a 2 ml de LB y se mezcla para hacer la solución ningún maestro NTBC. Utilice estas soluciones para crear soluciones madre de antibióticos, así como para la creación de la serie de dilución en placas de 96 pocillos.
      NOTA: Las formulaciones de solución maestros darán solución adicional para tener en cuenta los errores de pipeteo. Las soluciones magistrales se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo según sea necesario en función de la cantidad de antibióticos y cepas probadas.
3. Preparar las soluciones de antibióticos en las soluciones magistrales LB + NTBC o LB + DMSO.
   NOTA: La concentración de antibiótico en estas soluciones debería ser el doble de la concentración final deseada. Suficiente solución se debe hacer para transferir 100 l de cuatro pozos en una placa de 96 pocillos.
   1. Preparar gentamicina +/- NTBC solución madre a los 64 mg / ml. Para hacer esta solución, añadir 0,288 l de Stock gentamicina (100 mg / ml) para 450l LB + NTBC o solución maestro LB + DMSO.
      NOTA: La concentración máxima de gentamicina para P. aeruginosa PAO1 es 32 mg / ml.
   2. Haga la kanamicina +/- NTBC solución madre a 256 g / ml. Para que esta solución, añadir 3,84 l de kanamicina social (30 mg / ml) a 450 mu l LB + NTBC o LB + DMSO soluciones magistrales.
      NOTA: La concentración máxima de kanamicina para P. aeruginosa PAO1 es 128 g / ml.
   3. Preparar tobramicina +/- NTBC solución madre a 8 mg / ml. Para que esta solución, añadir 0,36 l de tobramicina social (10 mg / ml) a 450 mu l LB + NTBC o LB + DMSO soluciones magistrales.
      NOTA: Para P. aeruginosa PAO1, la concentración máxima de tobramicina es 4 mg / ml.
      NOTA: Los antibióticos y concentraciones se pueden ajustar para las bacterias a ensayar.
4. Añadir 100 l de cada solución de antibiótico 2x para cuatro pozos en una placa de 96 pocillos. Coloque estas soluciones en la fila A. Para example, gentamicina debe ser colocado en A1 a A4, kanamicina debe ser colocado en A5 a A8, y tobramicina debe ser colocado en A9 a través de A12. Ver Figura 1A para un diagrama de una placa de 96 pocillos de configurar.
   NOTA: Múltiples antibióticos pueden ser probados en un plato, pero sólo una cepa debe ser probado por placa para eliminar el potencial de contaminación cruzada de otras cepas.
5. Añadir 50 l de la solución maestro LB + NTBC o LB + DMSO a las filas B a H de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de que un plato es LB + NTBC y una placa es LB + DMSO. Ver Figura 1A.
   1. Utilice LB + NTBC para los antibióticos en LB + NTBC. Utilice LB + DMSO para los antibióticos en LB + DMSO.
6. Usando una micropipeta realizar dos diluciones seriadas dobles de los antibióticos mediante la transferencia de 50 l de la solución de la fila A a la fila B. Mezcle la solución, cambiar las puntas de pipeta y transferir 50 l de la solución de la línea B de la fila C. Repita el procedimiento para el remainifilas NG. Después de diluir la fila G, retirar 50 l de la solución de esa fila y descarte. Utilice la fila H como un control de antibióticos para el crecimiento bacteriano. Ver Figura 1B.
   NOTA: Cada Un pozo en filas a G ahora contiene 50 l de antibióticos en LB + NTBC o LB + DMSO a 2X la concentración final deseada. Fila H contiene LB + NTBC o LB + DMSO sin antibióticos.
7. Mida la OD ₆₀₀ de los cultivos de una noche. Lave todas las culturas antes de tomar OD ₆₀₀ lecturas para eliminar pyomelanin presente en los medios de comunicación.
   1. Lávese las culturas mediante la centrifugación de 1 ml de la cultura en una microcentrífuga a 16.000 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante con una micropipeta y resuspender el botón celular en 1 ml de LB.
8. Diluir los cultivos de una noche de 2.75x10 ⁵ UFC / ml en LB.
   NOTA: Supongamos que un OD ₆₀₀ unidad es el equivalente de 1x10 ⁹ UFC / ml para P. aeruginosa. OD / a conversiones ml CFU puede ser different en otras bacterias.
9. Añadir 50 l de cultivo bacteriano diluido al pocillo apropiado.
   NOTA: Los cultivos cultivados en NTBC deben añadirse a los pocillos que contienen NTBC y culturas crecido en DMSO deben añadirse a los pocillos que contienen DMSO. Ver Figura 1B.
   1. Añadir bacterias para tres pozos para cada cepa y la concentración de antibiótico. Añadir 50 l de LB a la cuarta bien para actuar como un control para la contaminación bacteriana. Ver Figura 1B.
   2. Utilice una micropipeta multicanal para inocular los pozos. Asegúrese de que la pipeta consejos son cerca de la parte inferior de los pozos cuando se añade inóculo para evitar la contaminación de los pozos vecinos.
      NOTA: La adición de cultivo bacteriano a los pozos diluirá las concentraciones de antibióticos y NTBC doble.
10. Cubrir las placas de 96 pocillos con parafilm y se incuba aproximadamente 24 horas a 37 ° C. Incubar las placas de 96 pocillos de forma estática, en una incubadora de aire.
11. Examinarlas placas para el crecimiento bacteriano en los pocillos. El MIC es la concentración más baja de antibiótico en el que no se observa crecimiento bacteriano para las tres repeticiones de cada cepa.
    1. Examine visualmente la placa para el crecimiento o leer mediante un conjunto lector de placas a OD _600.

Ensayo Placa 4. Punto de Estrés Oxidativo Respuesta

1. Establecer cultivos de una noche de las cepas a ensayar en LB con y sin NTBC como se describe en el paso 3.1.
2. Al día siguiente, se preparan placas de agar LB que contenían H ₂ O ₂ como un factor de estrés oxidativo. Una gama de H _{2 O} 2 concentraciones de 0 a 1 mm es un buen punto de partida.
   1. Derretir los frascos de agar LB. Frescos medios a aproximadamente 50 ° C a la temperatura ambiente.
   2. Añadir H _{2 O 2} directamente a los medios de comunicación enfriados a las concentraciones deseadas. Frascos del remolino para mezclar. Ver Tabla 2 para las concentraciones de H _{2 O 2}y los volúmenes de H _{2 O 2} concentrada para agregar. Estos valores se basan en 100 ml de LB agar.
   3. Vierta platos inmediatamente después de la adición de H _{2 O 2} y la llama de la superficie para eliminar las burbujas. El rendimiento es de 4 placas por cada 100 ml de agar LB. Marque las placas con la concentración de H _{2 O 2.}
   4. Colocar las placas descubiertos en una campana de flujo biológica con el ventilador funcionando durante 30 min para eliminar el exceso de humedad de las placas.
      NOTA: Utilice las placas el mismo día que se preparan. El no hacerlo puede resultar en datos inconsistentes.
      NOTA: los factores de estrés oxidativo como el paraquat pueden ser sustituidos por H ₂ O ₂ en este ensayo. Las concentraciones utilizadas para otros factores de estrés oxidativo puede ser diferente de los utilizados para H ₂ O _2.
3. Lavar y medir el OD ₆₀₀ de los cultivos de una noche como se describe en el paso 3.7.
4. Normalizar el _OD 600 de todo el cu nocheltures al valor más bajo para el conjunto de cepas están probando. P. aeruginosa en general, tiene un OD ₆₀₀ de aproximadamente 2,5 cuando se desarrolló durante la noche en LB + NTBC o LB + DMSO.
   1. Determinar el volumen de cultivo necesario para diluir la cultura al más bajo OD ₆₀₀ en un volumen total de 1 ml. Por ejemplo, si una cultura tiene una DO ₆₀₀ de 3 y el más bajo OD _{600 para el} conjunto de las cepas es 2.5, realice el siguiente cálculo: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. Se colocarán 0,833 ml de cultivo en un tubo de microcentrífuga.
   2. Calcular la cantidad de LB + NTBC (300 mM) o LB + DMSO necesario para llevar el volumen a 1 ml de cultivo. Para el ejemplo en el paso 4.4.1, la cantidad de LB + NTBC o LB + DMSO añade al cultivo sería 0,167 ml (1 ml de volumen total de 0.833 ml - Cultura). Hacer que las soluciones stock de LB + NTBC y LB + DMSO a utilizar para estas diluciones basado en el volumen necesario para diluir todas las cepas.
   3. Mezclar la cultura y LB + NTBC o LB + DMSO mediante agitación con vórtex.
5. Para mantener los cultivos en una concentración constante de NTBC o DMSO, realizar diluciones en serie de diez veces de los cultivos de una noche normalizados en PBS + NTBC o PBS + DMSO.
   1. Haga soluciones madre de PBS + NTBC y PBS + DMSO. Para un conjunto de diluciones de una cepa, mezclar 300 mM NTBC o un volumen equivalente de DMSO con PBS para dar un volumen total de 720 l. Escala estas poblaciones hacia arriba o abajo dependiendo del número de cepas se ponen a prueba.
   2. Tubos de microcentrífuga Etiqueta para 10 ^-1 a través de diluciones 10 ^-7 serie. Añadir 90 l de PBS + NTBC o PBS + DMSO a los tubos apropiados. Utilice PBS + NTBC para las cepas cultivadas en LB + NTBC y utilizar PBS + DMSO para las cepas cultivadas en LB + DMSO.
   3. Añadir 10 l de la cultura al tubo de dilución 10 ^-1 apropiado. Mezclar mediante agitación y la transferencia de 10 l de la dilución 10 ^-1 al tubo de dilución 10 ^-2. Repita hasta que todas las diluciones han sido performó. Cambie puntas de pipeta entre las diluciones.
6. Spot 5 l de la 10 ^-3 a través de 10 ^-7 diluciones en LB + H _{2 O 2 placas} por duplicado para cada cepa. Utilice una punta de pipeta si se colocan puntos de la mayoría diluir al menos diluido ⁽¹⁰ -7 a 10 ^-3). No incline o inclinar la placa hasta que el líquido se haya secado en la placa.
7. Incubar las placas durante 24-48 horas a 37 ° C (incubadora de aire), dependiendo de la cepa.
   NOTA: P. aeruginosa PAO1 tendrá buenas colonias de tamaño en LB después de 24 h de incubación. Incubar las cepas hasta que tienen colonias de aproximadamente el mismo tamaño que PAO1.
8. Fotografiar las placas utilizando una cámara CCD por encima de un transiluminador. Opcionalmente, editar las fotos para el contraste y la cosecha al mismo tamaño. Contar el número de colonias en cada punto para determinar cambios en la sensibilidad al estrés oxidativo.

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Resultados

Titulaciones NTBC

Las titulaciones NTBC se utilizaron para determinar si NTBC fue capaz de reducir la producción de pyomelanin en P. aeruginosa, y también identificar la concentración de NTBC que elimina o reduce la producción pyomelanin para uso en ensayos adicionales. Es posible que haya variaciones en los niveles de pyomelanin producido en diferentes repeticiones, pero las tendencias generales permanecer constante. El ensayo de valoración NTBC también podría ser m...

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Discusión

The NTBC titration method described in this protocol will allow the user to determine if NTBC can reduce or eliminate pyomelanin production in bacteria, and determine the concentration of NTBC required. The most critical step in the NTBC titration assay is determining the range of NTBC concentrations to use in the assay. Different strains of P. aeruginosa have different sensitivities to NTBC, and laboratory strains may be more sensitive to NTBC than clinical isolates¹² (Figure 2). The...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin	Gold Bio	G-400-100	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Soluble in H2O.  Filter sterilize.