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Resumen

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Resumen

Un reto fundamental en el cáncer de próstata (CaP) manejo clínico se plantea por la insuficiencia de los biomarcadores que actualmente se utilizan para la detección de la enfermedad, diagnóstico, pronóstico y tratamiento. En los últimos años, microRNAs (miRNAs) han surgido como biomarcadores alternativas prometedoras para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer de próstata. Sin embargo, el desarrollo de miRNAs como biomarcadores eficaces para el cáncer de próstata depende en gran medida su detección precisa en tejidos clínicos. miARN análisis en muestras clínicas de cáncer de próstata a menudo es un reto debido a la heterogeneidad del tumor, los errores de muestreo, la contaminación del estroma etc. El objetivo de este artículo es describir un flujo de trabajo simplificado para miARN analiza en FFPE archivado o especímenes clínicos sobre el cáncer de próstata fresco congelado usando una combinación de cuantitativa en tiempo real PCR (RT-PCR) e hibridación in situ (ISH). Dentro de este flujo de trabajo, optimizamos las metodologías existentes para la extracción de miRNA de FFPE y tissu próstata congeladoES y la expresión por análisis Taqman-sonda basada miARN RT-PCR. Además, se describe un método optimizado para ISH análisis de detección formiRNA en los tejidos de la próstata utilizando ácido nucleico cerrado (LNA) - sondas basadas. Nuestro protocolo miRNA ISH optimizado se puede aplicar a las diapositivas de cáncer de próstata de tejido o microarrays de tejidos de cáncer de próstata (TMA).

Introducción

El cáncer de próstata es un tumor maligno masculina comúnmente diagnosticado que es una de las principales causas de la mortalidad relacionada con el cáncer entre los hombres. En Estados Unidos, se estima que 220.800 nuevos casos y 27.540 muertes se reportaron en 2015 1.

El cáncer de próstata es una enfermedad heterogénea con enfermedad muy variable supuesto- tumores pueden ser indolente o muy agresivo. Un reto fundamental en el manejo clínico del cáncer de próstata es el que plantea la insuficiencia de los que actualmente se utilizan métodos / biomarcadores para la detección de enfermedades, el diagnóstico, el pronóstico y el tratamiento 2. Métodos de detección actuales incluyen antígeno (PSA) prostático específico y un examen rectal digital (DRE), seguido de las biopsias de próstata 3. Antígeno específico de próstata (PSA) es el biomarcador de cáncer de próstata más ampliamente utilizado que ha revolucionado significativamente la gestión clínica y la mejora de las tasas de supervivencia 4. Sin embargo, debido a las limitaciones inherentes de PSA incluyendo lack de especificidad, cribado basado en PSA ha llevado a más de diagnóstico y sobre el tratamiento de la enfermedad. En vista de esto, los intensos esfuerzos se dirigen hacia la búsqueda de alternativas biomarcadores de cáncer de próstata, en particular los que puede predecir la agresividad de la enfermedad y conducir mejores decisiones de tratamiento 4,5. En los últimos años, los microRNAs (miRNAs) han surgido como prometedores biomarcadores de cáncer de próstata alternos.

Los microARNs (miRNAs) constituyen una clase conservado evolutivamente de los pequeños RNAs no codificantes que suprimen la expresión de genes post-transcripcional a través de interacciones específicas de secuencia con los 3'-regiones no traducidas (UTRs) de mRNA objetivos afines. Se estima que> 60% de los mRNAs se conservan objetivos de miRNAs 6. genes miARN se encuentran en regiones intergénicas o dentro de intrones o exones de proteína / no proteico 7 genes de codificación. Estos genes son preferentemente transcritos por la ARN polimerasa II en primamiRNAs ry (pri-miRNAs, varias kilobases de largo) que bucle tallo en forma de estructuras secundarias forma de horquilla. Estos pri-miRNAs se procesan en miRNAs precursores (pre-miRNAs, 60-75 nucleótidos de largo) que se exportan al citoplasma y tratados posteriormente en miRNAs maduros (18-25 nucleótidos de largo) 08.10. miRNAs regulan procesos celulares clave, incluyendo la proliferación, el desarrollo, la diferenciación y la apoptosis 11. Los estudios sugieren una desregulación generalizada de los perfiles de expresión de miRNA en diversos tumores malignos humanos incluyendo el cáncer de próstata 12-15. los perfiles de expresión de genes miARN se han notificado a ser ampliamente desregulado en el cáncer de próstata primario y metastásico. Alterada la expresión de miRNA se han relacionado con la progresión del cáncer de próstata, la agresividad y la recurrencia destacando el potencial pronóstico de miRNAs 12,14,16-19. Un creciente cuerpo de evidencia indica que los miRNAs juegan importantes papeles mecanicistas en la iniciación del cáncer de próstata, el desarrollo, el progresoion y la metástasis. En general, los miRNAs están surgiendo alternativas como biomarcadores prometedores para el diagnóstico del cáncer de próstata y el pronóstico que pueden distinguir entre los tejidos y ayuda normales y cancerosas en la estratificación de los tumores de próstata 12. También, miRNAs son objetivos importantes para el desarrollo de terapias eficaces contra el cáncer de próstata 20.

Debido a su pequeño tamaño y resistencia a la actividad de RNasa endógena, miRNAs son biomarcadores estables que se pueden detectar fácilmente en tejidos fijados con formalina y 21 en las biopsias de próstata 22. Por otra parte, los perfiles de expresión de miRNAs se han comparado en los tejidos congelados y formol fija y se han encontrado para ser fuertemente correlacionada 21. Sin embargo, la expresión de los genes miARN perfiles en los tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata a menudo es un reto debido a la heterogeneidad del tumor, los errores de muestreo, la contaminación del estroma etc. El desarrollo de miRNAs como biomarcadores eficaces para el cáncer de próstata en gran medida relies en su detección precisa en tejidos clínicos. Aquí se describe un flujo de trabajo simplificado utilizado en nuestro laboratorio para la expresión de los genes miARN perfiles de FFPE archivado o especímenes clínicos sobre el cáncer de próstata congelados frescos. Empleamos una combinación de PCR cuantitativa en tiempo real e hibridación in situ para miRNA los análisis de muestras clínicas, con el primero produciendo más información cuantitativa y el segundo para la visualización de la expresión diferencial de los genes miARN potenciales biomarcadores en una variedad de tejidos. Dentro de este flujo de trabajo, optimizamos las metodologías existentes para la extracción de miARN de FFPE y tejidos de la próstata congelados, la expresión análisis por Taqman-sonda basada miARN RT-PCR y miARN en la técnica de hibridación in situ utilizando ácido nucleico bloqueado (LNA) a base de sondas 23. Sondas basados ​​en LNA ofrecen mayor sensibilidad y especificidad en comparación con el ADN o ARN-sondas basadas y permite la detección robusta de todas las secuencias de genes miARN, independientemente de su contenido de GC y también permiten la discriminaciónción de las familias miARN. Nuestro protocolo miRNA ISH optimizado se puede aplicar a las diapositivas de cáncer de próstata de tejido o microarrays de tejidos de cáncer de próstata (TMA), con este último ofrece el potencial para acelerar el descubrimiento de biomarcadores miRNA.

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Protocolo

Se obtuvieron fijado en formol, embebido en parafina (FFPE) o muestras de cáncer de próstata congelados frescos del SFVAMC. Las muestras procedían de pacientes con cáncer de próstata sometidos a prostatectomía radical en SFVAMC. Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por el Comité de la UCSF en Investigación en Seres Humanos. Alternativamente, los tejidos de cáncer de próstata microarrays se adquirieron de fuentes comerciales y se utilizan para miARN analiza por ISH. Se recogió información clínico-patológico y el seguimiento de los pacientes con cáncer de próstata analizados.

1. Muestras de Tejido

  1. Cortar muestras de tejido de cáncer de próstata en 10 micras secciones usando un microtomo y se tiñen con H & E siguiendo el protocolo del fabricante.
  2. Revisar diapositivas teñidas para la identificación de focos de cáncer de próstata, así como adyacente epitelio glandular normal.
    Nota: Un patólogo certificado por la junta debe revisar las diapositivas H & E manchadas y mark para el tumor y áreas normales. Utilice las diapositivas marcadas como guías en las secciones posteriores para miARN análisis del tumor vs áreas normales.

2. miARN análisis de expresión por PCR cuantitativa en tiempo real

Nota: Este flujo de trabajo incluye los siguientes pasos: microdisección de captura por láser, de aislamiento de ARN total (incluyendo miARN y ARNm), Dosificación de los miRNAs maduros utilizando los ensayos de expresión TaqMan microARN que se detallan en los siguientes apartados.

  1. La extracción de RNA
    1. Aislamiento de miRNA de cáncer de próstata FFPE tejidos
      1. Microdisección de captura por láser (LCM)
        Nota: Realice los pasos 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 en una campana de extracción química.
        1. Preparar diapositivas de tejidos (10 micras secciones) de LCM. Deparrafinize secciones de tejido por inmersión en xileno (2x), durante 10 minutos cada uno, a continuación, se rehidratan los tejidos mediante la incubación de los portaobjetos durante 5 min cada uno en etanol graduado (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) seguido por destilada agua(5 minutos).
        2. Después de la rehidratación, las secciones de la mancha con hematoxilina durante 30 segundos seguidos por el agua.
        3. Coloque los tejidos en etanol graduado (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 min cada uno) y xileno (5 min).
        4. Diapositivas secas en una campana de extracción y luego se coloca en el instrumento LCM para microdisección.
        5. Realizar microdisecciones con el Sistema de LCM de acuerdo con las instrucciones del fabricante 24. Uso patólogo marcado diapositivas como guías para la identificación de los focos de próstata cáncer, así como el tejido normal adyacente. Utilice el rayo láser a una 10-20 micras de diámetro impulsos con una potencia de un 70-90 mW.
        6. Zonas de captura de interés con pulsos de láser infrarrojo en tapas LCM. Combinar celdas de 2-5 tapas para la extracción de miARN por muestra. Para asegurar la integridad del ARN extraído, inmediatamente procesar células capturadas para la extracción de miRNA.
        7. Alternativamente, las células lisan en el tampón de extracción miRNA (de acuerdo con el protocolo del fabricante) y store lisados ​​a -80 ºC.
      2. miARN Extracción y análisis de LCM microdissected tejidos
        1. Extraer el ARN total a partir de tejidos FFPE microdissected utilizando un kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.
          Nota: El rendimiento de ARN de captura por láser miscrodissection es típicamente baja. Por lo tanto, el ARN se eluye en volúmenes bajos (20-30 l) y utiliza para perfiles de expresión mediante ensayos de expresión de microARN Taqman siguiendo las instrucciones del fabricante (también descrito en la sección 2.2). Optimización de ARN de entrada para la detección en tiempo real PCR de miRNAs maduros sugiere que 5 l del ARN eluido es óptima para cada reacción de transcripción inversa miRNA-específicos. Como un control endógeno, se utiliza RNU48 / RNU24. Para las reacciones de control, 2 l de la ARN eluido se utiliza para la reacción de transcripción inversa.
    2. Aislamiento de miRNA de cáncer de próstata Los tejidos congelados
      1. HomogeNiza tejidos de la próstata resecados congelados moliendo los tejidos en nitrógeno líquido utilizando un mortero. Transferencia de tejido homogeneizado a un tubo de microcentrífuga con una espátula enfriado. Mantener el mortero / mano de mortero y una espátula a la misma temperatura por inmersión en nitrógeno líquido tejido de manera homogeneizada se pueden transferir fácilmente.
      2. Añadir comercial isotiocianato de guanidina-fenol reactivo (1 ml / 0,1 g de tejido) para el tejido se homogeneiza y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min.
        Nota: los tejidos se homogeneizaron en reactivo isotiocianato de guanidina-fenol comercial se pueden almacenar a -80 ºC durante varios meses.
      3. Añadir cloroformo al homogeneizado (0,2 ml de cloroformo / ml) y agitar enérgicamente durante 30 segundos. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 3-5 min seguido de centrifugación a 10.000 xg durante 20 min a 4 ºC.
      4. Pasar la fase acuosa superior a un tubo de 1,5 ml RNasa libre estéril fresco.
      5. Añadir un volumen igual de alcohol isopropílico. Mezclar e incubar durante 10 millasn a temperatura ambiente seguido por centrifugación a 12.000 xg durante 20 min a 4 ºC para sedimentar el ARN.
      6. Aspirar el sobrenadante y lavar el precipitado de ARN con 1 ml de etanol al 70%. Centrifugar a 12000 xg durante 10 min a 4 ºC.
      7. Aspirar con cuidado el sobrenadante. Sedimentos de ARN en seco a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Disolver ARN en 50-100 agua libre de nucleasa l.
      8. Realizar cuantificación de ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop y determinar la integridad del ARN con una bioanalizador. Ajustar las concentraciones de ARN a 10 ng / l. Utilice 10 a 50 ng de ARN para la reacción de ADNc específica miRNA- seguida de análisis en tiempo real PCR (Sección 2.2).
  2. PCR cuantitativa en tiempo real para análisis de expresión de miRNA
    Nota: miRNAs maduros ensayo usando un protocolo de RT-PCR de dos etapas como se describe a continuación.
    1. Transcripción inversa (RT)
      1. Reverse transcribir de ADNc a partir de ARN usando un kit de transcripción inversa miRNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Utilice 10 a 50 ng de ARN total con miARN cebador específico del kit microARN Ensayos y RT. Utilice RNU48 / RNU24 / RNU6B como controles. Diluir cDNA 1: 5 a 1:10 (dependiendo de la abundancia de los genes miARN analizados) y su uso en la detección de PCR en tiempo real como se describe en el siguiente paso.
    2. PCR en tiempo real para la detección de miARN maduro
      1. Amplificar productos de PCR de muestras de cDNA usando los ensayos microARN con una mezcla maestra universal rápida de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalizar las muestras a RNU48 / RNU24 de control / RNU6B. Utilice el método comparativo Ct (ciclo umbral) para calcular los cambios relativos en la expresión génica en el rápido tiempo real PCR System. Analizar cada muestra por triplicado.

Los análisis 3. miARN expresión por hibridación in situ (ISH)

  1. Pre-tratamiento de los tejidos
    1. Cortar 5 micras secciones de bloques de tejido de cáncer de próstata FFPE utilizando un micrótomo.
    2. Fix cortes de tejido mediante la incubación de los portaobjetos a 56 ° C durante 1 hora.
      Nota: Los portaobjetos se pueden almacenar a temperatura ambiente durante varias semanas para los análisis de miRNA.
    3. Deparrafinize los tejidos por inmersión de los portaobjetos con xileno (2 x), durante 15 min cada uno.
    4. Rehidratar los tejidos mediante la incubación de los portaobjetos durante 5 min cada uno en etanol graduado (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) seguido de agua destilada (5 min).
    5. Fijar los portaobjetos con 4% de paraformaldehído en PBS a temperatura ambiente durante 20 min.
    6. Lavar los portaobjetos con PBS (2x) a temperatura ambiente durante 5 min cada uno.
    7. Tratar los portaobjetos con 10 mg / ml de proteinasa K a 37 ºC durante 10 min en tampón de proteinasa K precalentado (Tris-HCL 5 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl 1 mM).
    8. Después del tratamiento con proteinasa-K, enjuague los portaobjetos con 0,2% de glicina en PBS durante 30 seg.
    9. Lavado de los portaobjetos en PBS (1x) a temperatura ambiente durante 5 min.
    10. Fijar las diapositivas con paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min.
    11. Enjuague con diapositivasPBS durante 5 min.
  2. La hibridación
    1. Pre-hibridar los portaobjetos con solución de pre-hibridación para 4.3 horas a 55 ºC en una cámara húmeda. Use toallitas de laboratorio de tejido empapado en formamida al 50% / 50% de 5x SSC para mantener la cámara húmeda.
    2. Utilice 5 'sondas marcadas con digoxigenina a una concentración de un 20-50 nM en tampón de hibridación. Diluir sonda-miRNA específico (20-50 nM) y sonda de control U6 ARN nuclear pequeño (20 nm), se calienta a 90 ° C durante 4 minutos, colóquelo en el hielo, y añadir al hielo frío tampón de hibridación (2.4 ng / l ).
    3. Retire la solución de pre-hibridación, añadir solución de hibridación (sonda + tampón de hibridación, 100 l por diapositiva), incubar durante 12 a 16 horas a temperatura de hibridación-sonda específica (temperatura de hibridación = sonda de 21 Tm ºC). Realizar hibridaciones en una cámara humidificada (50% de formamida / 50% 5x SSC).
  3. Pasos de lavado
    1. Lavar los portaobjetos con 2x SSC durante 10 minutos a 45 ºC.
    2. Lavar tse desliza con SSC 1,5x durante 10 minutos a 45 ºC.
    3. Lavar los portaobjetos con SSC 0,2x (2x) a 37 ºC durante 20 minutos cada uno.
    4. Incubar los portaobjetos con solución de bloqueo 1x durante 1-2 horas a temperatura ambiente
  4. Detección
    1. Incubar los portaobjetos con 1: 100 PBS diluido anticuerpo anti-digoxigenina AP-conjugado de 1-4 horas o durante la noche a 4 ºC.
    2. Lavar los portaobjetos con PBS (3x) a temperatura ambiente durante 10 min cada uno.
    3. Se lavan los portas (2x) con fosfatasa alcalina tampón (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, NaCl 100 mM, 0,1% de Tween-20) a TA durante 5 min cada uno.
    4. Incubar las diapositivas de sustrato BM púrpura AP en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hasta 20 horas.
    5. Enjuagar los portaobjetos con PBS que contenía 0,1% de Tween-20 y de lavado (2x) en agua.
    6. Montar las diapositivas utilizando un medio de montaje acuoso y examinar con un microscopio.

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Resultados

Perfiles de expresión de miR-203 en muestras clínicas de cáncer de próstata primario LCM por RT-PCR análisis (Figura 1)

Análisis de RT-PCR de la expresión relativa de miR-203 en LCM tejidos de cáncer de próstata primario y las regiones normales adyacentes emparejados se llevó a cabo como se describe en Saini et al. 15 RNU48 se utilizó como control. La siguiente tabla resume la relativa expresión de miR-203 en los tejidos tumorales de cáncer d...

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Discusión

En este artículo se describe un flujo de trabajo simplificado para la expresión de los genes miARN perfiles de FFPE archivado o tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata congelados frescos. En el cáncer de próstata, varios estudios sugieren un papel importante de microRNAs en cáncer de próstata iniciación, progresión y metástasis. Sin embargo, los resultados en conflicto a menudo se obtuvieron en un miRNA específico 22 desde la extracción y análisis de miRNA métodos difieren ampliamente. En...

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Divulgaciones

The authors have no financial disclosures.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Roger Erickson por su apoyo y asistencia en la preparación del manuscrito.

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud

(Número de Grant RO1CA177984; RO1CA138642), el proyecto de programa de VA sobre el cáncer de próstata (BX001604).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
MicrotomeLeica Biosystems RM2255
Arcturus Autopix for LCMArcturus/ Life TechnologiesLCM1621/LCM1110Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. 
CapSure Macro LCM CapsLife TechnologiesLCM0211
miRNeasy FFPE Kit Qiagen217504
7500 Fast Real-time PCR System Applied Biosystems/ Life Technologies4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit Applied Biosystems/ Life Technologies4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix Applied Biosystems/ Life Technologies4352042
DIG labeled LNA probe for U6Exiqon99002-01
BM Purple AP substrateRoche11442074001
Pre-hybridization solution BiochainK2191050-1
Hybridization solution BiochainK2191050-2
Blocking solution BiochainK2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibodyBiochainK2191050-7
Aqueous mounting media Vector Laboratories H-5501  
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) Life Technologies15596-018
Harris hematoxylinStatlabSL200
Eosin StatlabSL201 

Referencias

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