Identificación de los pares quinasa-sustrato Usando selección de alto rendimiento

Resumen

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Resumen

Hemos desarrollado una plataforma de cribado para identificar proteínas quinasas humanos dedicados para sustratos fosforilados que pueden utilizarse para dilucidar nuevas vías de transducción de señales. Nuestro enfoque ofrece el uso de una biblioteca de proteínas quinasas humana marcada con GST purificada y un sustrato de proteína recombinante de interés. Hemos utilizado esta tecnología para identificar MAP / microtúbulos afinidad de regulación de quinasa 2 (MARK2) como la quinasa para un sitio regulada por glucosa en CREB-regulado transcripcional Coactivador 2 (CRTC2), una proteína necesaria para la proliferación de células beta, así como la la familia de tirosina quinasas de Axl como reguladores de la metástasis de las células por la fosforilación de la proteína adaptador de ELMO. Se describe esta tecnología y discutimos cómo puede ayudar a establecer un mapa completo de cómo las células responden a estímulos ambientales.

Introducción

Proteína modificaciones post-traduccionales (PTMs) son esenciales para la comunicación intracelular. Tal vez el mejor estudiado de todos PTM es la fosforilación, catalizada por proteínas quinasas, que regulan una gran variedad de funciones de proteínas, incluyendo su actividad bioquímica, localización subcelular, conformación, y la estabilidad. La identificación de sitios de fosforilación en las proteínas diana se puede lograr mediante mapeo de fosfopéptidos trípticos o mediante técnicas proteómicas ahora estándar usando muestras enriquecidas para los péptidos fosforilados ^1,2. Aunque se espera que tres cuartas partes del proteoma expresado ser fosforilados ³ y un identificaron 200.000 sitios de fosforilación ^5, con estimaciones de hasta 1 millón ^6, muchos de éstos no tienen asignada la biología, la vía de señalización, o la proteína quinasa.

Mientras que la identificación de sitios fosforilados es relativamente sencillo, una comparativamente mayor reto esidentificar la quinasa cognado (s) que se dirige a estos sitios, un proceso que nos referimos como mapeo de quinasa: sustrato pares. Varios enfoques para la identificación de quinasa: sustrato pares se han descrito, ya sea comenzando con una quinasa de interés y en busca de sus sustratos o comenzar con un sustrato de interés y tratando de encontrar una quinasa de modificación experimentalmente ^7-11 o computacionalmente ^12. Para identificar quinasas para un sustrato fosforilado conocido, la bioinformática se pueden utilizar para identificar las proteínas que contienen una secuencia corta conservada de aminoácidos que flanquean el residuo fosforilado (el sitio consenso), así como la identificación de quinasas que forman un complejo con el sustrato precipitable. Sin embargo, estos métodos requieren mucho tiempo ya menudo no cumplen con éxito.

Hemos desarrollado un enfoque funcional sistemático para identificar rápidamente quinasas que pueden phosphorylate un sustrato dado ^13. El ensayo de la pantalla produce una excelente específicadad, con una selección muy claro para los posibles quinasas afines. Dada la centralidad de la fosforilación de la señalización biológica, la pantalla es útil para el descubrimiento de rutas de señalización prácticamente todos los teléfonos ^14-16. La pantalla implica la realización de un ensayo de quinasa a gran escala con una biblioteca de proteínas quinasas humanas. Las quinasas han sido etiquetadas con glutatión bacteriana S-proteína transferasa (GST) y se purificó a partir de extractos de células de mamíferos, lo que significa que las enzimas recombinantes - a diferencia de los preparados a partir de bacterias - se generan en presencia de las proteínas quinasas aguas arriba a menudo requeridos para la enzimas recombinantes que tienen actividad in vitro. De hecho, mientras que la actividad quinasa de serina, treonina y tirosina requiere para la activación de la quinasa aguas abajo están presentes en la levadura ^10, el genoma de la levadura codifica 122 proteínas quinasas, lo que indica que el kinome de mamífero, con más de 500 genes ^17, ha llegado a ser significativamente más compleja con el fin de regulate La procesos únicos para los organismos de orden superior. Por otra parte, el efecto de diferentes estímulos relevantes a la biología celular y la enfermedad humana (por ejemplo, moléculas pequeñas, factores de crecimiento, hormonas, etc.) se puede utilizar para modular la actividad de quinasa ^14,15 en un contexto apropiado.

Protocolo

1. Preparación de los reactivos, platos, y Células

1. Hacer 500 ml de tampón de lisis: 25 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 5 mM beta-glicerofosfato, 5% de glicerol. Almacenar a 4 ° C. Inmediatamente antes de usar, añadir ditiotreitol 1 mM (DTT), 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), vanadato de sodio y 1 mM. Después de este paso, PMSF no se requiere en cualquier tampón de enjuague.
2. Hacer 20 ml de 10x tampón de quinasa: mM Tris 200 pH 7,5, 50 mM de beta-glicerofosfato (FW 216), vanadato de sodio 2 mM. Alícuota en 1 ml tubos y almacenar a -20 ° C. Inmediatamente antes de usar, añadir DTT 5 mM.
3. Hacer 20 ml de tampón M-ATP 10x: 300 M de adenosina trifosfato (ATP), 66 mM _MgCl2, 33 mM MnCl $ _2. alícuota de 1 ml tubos y almacenar a -20 ° C.
4. Hacer 100 ml de sulfato de sodio dodecil 2x (SDS) tampón de lisis: 1,5 g de base Tris, 20 ml de glicerol, 30 ml _de H 2 O. Disolver y ajustar el pH a 6,8 con HCl. Añadir 40ml 10% SDS, ajustar el volumen a 100 ml. Añadir 25 mg de azul de bromofenol.
5. Spot 4 l de 25 ng / l de plásmido de expresión de mamífero que codifican un GST-quinasa por pocillo en ¹⁴ conjuntos de placas de 96 pocillos y placas de etiquetas en consecuencia. Seal y congelación placas a -20 ° C hasta su uso.
6. 1-2 días antes de la transfección, las células de cultivo HEK293T en medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM) + 10% de suero fetal bovino (FBS) y antibióticos en una incubadora a 37 ° suplementado con CO ₂ (5% final). Pasaje con tripsina y no permiten que la acción se convierta en> 80% de confluencia durante la expansión. Se requiere un mínimo de 6 x 10 ⁷ células para la pantalla (aproximadamente 3 x 15 cm de platos de células HEK293T en 80% de confluencia).

2. La transfección

Nota: Consulte la Figura 1 para un diagrama de flujo de protocolo entero.

1. Si las placas que contienen plásmidos quinasa han sido congelados, descongelar a temperatura ambiente unnd centrifugar a 1900 xg durante 3 min para recoger cualquier humedad en el fondo de los pozos.
2. Mezclar 8,6 ml de medio de suero reducido (por ejemplo, OPTI-MEM) con 312,7 l de reactivo de transfección a base de lípidos. Deje reposar durante 5 minutos.
3. Añadir 10 l de medio de suero reducido a cada pocillo usando un dispensador de líquido automatizado equipado con un pequeño volumen de casete.
4. Añadir 10 l por pocillo de la mezcla de reactivo de medio con suero / transfección reducida desde el paso 2.2 utilizando un dispensador de líquido automatizado equipado con un pequeño volumen de casete. Deje reposar durante 20 a 45 min.
5. Resuspender las células 293T en 7,5 x 10 ⁵ células / ml en 80 ml ​​de DMEM completo. Añadir 100 l de suspensión celular (es decir, 7,5 x 10 ⁴ células) por pocillo usando un dispensador de líquido automatizado equipado con un casete de volumen estándar.
6. Compruebe pozos bajo el microscopio para la distribución uniforme de células y volver a la incubadora durante 24 horas.

3. desplegable GST-quinasa

1. Haga fResh: 4 mM solución de pervanadato mediante la mezcla de 60 l de 0,2 M de vanadato de sodio con 540 l de H ₂ O. En una segunda mezcla de tubo de 2,7 l de peróxido de 30% y 1,4 ml de PBS. Añadir las dos soluciones juntos y deje reposar durante 15 minutos antes de su uso.
2. Con una pipeta multicanal (no utilizar un dispensador de líquido automatizado, ya que crea mucha turbulencia en el pozo) prescindir de 2 l de 0,25 M _CaCl2 en cada pocillo, seguido de 2,5 l de la pervanadato preparada en el paso 3.1. Incubar cada placa a 37 ° C durante 10 min y luego se coloca en hielo.
3. Prepare 35 ml de tampón de lisis mediante la adición de la TDT, PMSF, y vanadato de sodio, como se indica en la Sección 1 (Preparación de los reactivos).
4. Mantener las placas en hielo, retire medio de cada pocillo usando un aspirador de vacío. Inmediatamente añadir 50 l / pocillo de tampón de lisis de hielo frío usando un dispensador de líquido automatizado equipado con un casete estándar. Deje reposar 30 minutos en hielo para lisar (opcional: puede parar aquí si es necesario mediante plat selladocorreo y almacenamiento a -80 ° C. Para continuar, placas de deshielo en el hielo).
5. Placas giran a 1.900 g durante 3 min a 4 ° C.
6. Raspar las células de cada pocillo usando una pipeta multicanal y transferir todos los contenidos etiquetados apropiadamente a placas de 96 pocillos de fondo en V. Placas giran a 1900 xg durante 10 min a 4 ° C.
7. Durante el centrifugado, llenar placas revestidos con glutatión (uno para cada placa de 96 pocillos) con 100 l / pocillo de tampón de lisis de hielo frío (sin PMSF) como un enjuague. Mantenga las placas de hielo.
8. Retire las placas de fondo en V de la centrífuga. Uno a la vez, invertir las placas de glutatión sobre un fregadero para sacudir el tampón de lisis y mancha en una toalla de papel. Transferencia de tampón de lisis de las placas de fondo en V a las placas de glutatión por la inclinación de la placa y con una pipeta multicanal, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento en la parte inferior. Tapar y dejar las placas en hielo durante un mínimo de 2 horas para unirse.
9. Cerca del final de la etapa de unión 2 hr, preparar una estación de trabajo radiactividad, asegurando tque las medidas de seguridad necesarias están en su lugar para el trabajo radiactivo. Horno de hibridación Se establece en 30 ° C.
10. Preparar 200 ml de tampón de lisis mediante la adición de DTT y sodio vanadato como se indica en la Sección 1. PMSF no se requiere en esta etapa.
11. Invertir las placas de glutatión sobre un fregadero para sacudir el tampón de lisis y secar sobre una toalla de papel. Enjuague pozos 3 veces con 100 l de tampón de lisis (sin PMSF). No deje que los pozos se sientan en seco - mantenerlos en enjuague hasta que esté listo para continuar.
12. Prepare 55 ml de tampón de quinasa 1x (KB) diluyendo el 10x y añadiendo la TDT, como se indica en la Sección 1. Placas de enjuague una vez con 50 l de 1x KB utilizando un dispensador de líquido automático equipado con un cassette de volumen estándar. Deja 1x KB en los pozos hasta que la solución A es listo:
    1. Preparar la solución A mediante la adición de 500 a 530 g del sustrato de interés, 500 g de proteína básica de la mielina (MBP), 2,65 ml de 10x KB, 13.25 l de 1 M DTT, y H ₂ O hasta 15,9 ml.
13. Uno a la vez, invertir las placas sobre un fregadero para eliminar enjuague 1x KB, seque sobre una toalla de papel, y de inmediato añadir 30 l de solución A mediante un distribuidor de líquido automático equipado con un pequeño casete volumen. Mantenga las placas de hielo.
14. Preparar la solución B en el área de trabajo radiactividad añadiendo 2,5 ml de 10x M-ATP, ³² P ATP 500 Ci gamma, _y H 2 O a 10 ml.
    1. Añadir 20 l de solución B por pocillo usando una pipeta repetidora que ayuda en la mezcla debido a la fuerza de eyección. Cubrir e incubar en horno de hibridación 30 ° C durante 30 min.
15. Después de 30 minutos, la transferencia de las placas de nuevo a hielo. Añadir 50 l de tampón de lisis 2x SDS a cada pocillo usando una pipeta multicanal. Puede proceder en este punto con el siguiente paso, o sellar las placas con papel de aluminio y guardar a -20 ° C hasta el momento conveniente.

4. Correr, tinción y Geles de secado

Nota: Todo el trabajo debe realizarse en un área Designated la radiactividad.

1. Encienda el horno de hibridación y se puso a 85 ° C. Descongelar las placas a temperatura ambiente. Una vez que el horno ha alcanzado la temperatura, placas de transferencia al horno y se incuba durante 10 minutos para desnaturalizar las muestras.
2. Cargar 26 pocillos geles prefabricados con 15 l de cada reacción utilizando una pipeta multicanal para llenar varios pozos a la vez. Se debe tener cuidado de que todos los consejos se alinean con las correspondientes así antes de añadir las muestras. Ejecute gel a 150 V. No deje que el tinte de seguimiento (línea azul) se escurra de la parte inferior del gel, ya que contiene la ATP no incorporado.
3. Desmontar los geles y cortar el ATP no incorporado (línea azul), utilizando un bisturí o borde recto ya que sobreexponer las películas. Coloca los geles en contenedores etiquetados y cubrir con tinción de Coomassie durante 15 min.
4. Retire la tinción de Coomassie, brevemente enjuagar los geles con agua y añadir destain solución. Destain los geles hasta que las proteínas son claramente visibles. Una banda de MBP y una banda para el sustrato debeser visible para cada muestra.
5. Para secar los geles:
   1. Cortar una hoja grande de papel de filtro y colocarlo en la secadora.
   2. Moje una hoja de celofán en agua destilada hasta que esté suave y libre de arrugas, y colocarlo en la parte superior del papel.
   3. Coloque los geles en la parte superior de la hoja de celofán, haciendo una nota de la orden de los geles. Moje una segunda hoja de celofán y colocar en la parte superior de los geles.
   4. Estirar todas las burbujas (un rodillo sellado placa funciona bien para esto) para una superficie agradable uniforme. Cierre la tapa, encienda el vacío, y secar los geles durante 3 horas a 80 ° C.
6. Una vez geles están secos, los exponen a una película XAR utilizando una pantalla de intensificar la señal. Envuelva la cinta con papel film o una bolsa de plástico y selle con cinta para mantener fuera a las heladas. Guarde el casete a -80 ° C durante la noche.

5. Desarrollar XAR Films

1. Al día siguiente, eliminar el casete del congelador y dejar descongelar a temperatura ambiente. Desarrollar la película enun cuarto oscuro usando un procesador de película de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   Nota: Examine las películas para pruebas de pares quinasa-sustrato. Una segunda exposición más larga también puede ser útil para detectar eventos de fosforilación más débiles.

Resultados

Los resultados representativos de una pantalla se muestran en la Figura 2. 180 quinasas fueron seleccionados utilizando un sustrato peptídico marcada con GST correspondiente a los aa 268-283 de CRTC2 así como la proteína básica de la mielina sustrato clásico ensayo de quinasa (MBP). Sólo dos quinasas, MARK2 y MARK3 la quinasa altamente relacionados con el péptido CRTC2 fosforilados. MBP se incluye como un control interno en todos los ensayos, ya que contiene muchos residuos fosforilables y funcio...

Discusión

Desde las publicaciones originales que describen el enfoque ^14,15, la biblioteca original de 180 GST-quinasas se ha ampliado a 420 miembros, o ~ 80% de la kinome proteína humana. Con la biblioteca ampliada, el protocolo como se describe toma 4-5 días y después de 1-4 días para desarrollar películas (según se considere necesario), lo que podría ser acortada mediante el uso de phosphorimaging y mejora de la señal digital. Hay varios pasos clave en las que se debe tener cuidado (Ver Figura 1

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysis buffer	Made in house		See Protocol step 1.1
10x kinase buffer	Made in house		See Protocol step 1.2
10x M-ATP	Made in house		See Protocol step 1.3
Human kinase plasmids	Orfeome, Invitrogen, Origene		GST-tagged in house
96 well plates	Fisher Scientific	CS003595
293T cells	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.
CO2 incubator	Sanyo	MCO-17AIC
15 cm cell culture dishes	Fisher Scientific	877224
Reduced serum medium	Invitrogen	22600-050
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen	11668-019
Automated liquid dispenser	Thermo Scientific	5840300
Small cassette attachment	Thermo Scientific	24073295
Standard cassette attachment	Thermo Scientific	14072670
4 mM pervanadate	Made in house		See Protocol step 3.1
0.25 M CaCl2	Made in house
Multichannel pipette (20-200 μl)	Labnet	p4812-200
Multichannel pipette (1-10 μl)	Thermo Scientific	4661040
V-bottom 6-well plates	Evergreen Scientific	290-8116-01V
Glutathione coated 96-well plates	Fisher Scientific	PI-15240
Hybridization oven	Biostad	350355
GST tagged substrate	Made in house
Myelin Basic Protein (MBP)	Sigma	M1891
Repeater pipette (1 ml)	Eppendorf	22266209
32P gamma-ATP	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100 ml)	Made in house		See Protocol step 1.4
26-well precast TGX gels	BioRad	567-1045	gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest
Coomassie stain	Made in house		0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol
Coomassie destain	Made in house		10% acetic acid, 20% methanol
Labeled gel containers	Made in house		Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel
Whatman filter paper	Fisher Scientific	57144
Cellophane sheets (2)	BioRad	165-0963
Gel dryer	Labconco	4330150
Double emulsion autoradiography film	VWR	IB1651454
Film cassette	Fisher Scientific	FBAC-1417
Intensifying screen	Fisher Scientific	FBIS-1417
Plate sealing rubber roller	Sigma	R1275