Evaluación de perigenital Sensibilidad y Prostática mástil activación celular en un modelo de ratón de la separación materna neonatal

Resumen

Estamos midiendo la sensibilidad y la activación de las células mástil mecánica perigenital en la próstata de macho C57BL / 6 ratones que se sometieron a un paradigma principios de estrés de la vida - la separación materna neonatal, con el fin de inducir un modelo preclínico de síndrome de dolor pélvico / crónica prostatitis crónica.

Resumen

La prostatitis crónica / síndrome de dolor pélvico crónico (CP / CPPS) tiene una prevalencia de vida del 14% y es el diagnóstico urológico más común para los hombres menores de 50, sin embargo, es el trastorno de dolor pélvico crónico menos comprendido y estudiado. Un subconjunto significativo de pacientes con dolor pélvico crónico reporte haber experimentado estrés de la vida temprana o abuso, lo que puede afectar notablemente el funcionamiento y la regulación del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA). Activación de los mastocitos, que se ha demostrado ser aumentado tanto en orina y expresó secreciones prostáticas de pacientes CP / CPPS, está parcialmente regulada por la activación aguas abajo del eje HPA. Separación materna neonatal (SNM) se ha utilizado durante más de dos décadas a estudiar los resultados del estrés de la vida temprana en modelos de roedores, incluyendo cambios en el eje HPA y la sensibilidad visceral. Aquí le ofrecemos un protocolo detallado para el uso de NMS como un modelo preclínico de CP / CPPS en machos C57BL / 6 ratones. Se describe la metodologíapara la realización de NMS, la evaluación de la alodinia mecánica perigenital, y evidencia histológica de activación de los mastocitos. También proporcionamos evidencia de que el estrés psicológico temprana puede tener efectos a largo plazo sobre el sistema urogenital masculina en ratones.

Introducción

El dolor pélvico crónico no es en sí una enfermedad, sino más bien un término asociado con el dolor continuo espontáneo y / o evocado que sufren los pacientes con diagnóstico de síndrome de intestino irritable (SII), cistitis / síndrome de vejiga dolorosa intersticial (IC / PBS), la vulvodinia, o el síndrome de dolor pélvico prostatitis crónica / crónica (CP / CPPS). Estos síndromes son a menudo comórbida y comparten muchas características en que no tienen ninguna patología asociada o etiología subyacente identificado, aunque la disfunción en el sistema inmunológico, sistema nervioso central, sistema nervioso periférico y se ha demostrado que contribuyen al mantenimiento y la progresión de estos trastornos ^{1 -3.} Los pacientes con dolor pélvico crónico son más propensos a presentar síntomas de adicional, trastornos de dolor funcionales y trastornos del estado de ánimo, incluyendo la ansiedad, la depresión y el trastorno de pánico ^4-6, que se ha asociado con el funcionamiento alterado de la hipotálamo no relacionados con pélvico- pituitarioadrenal (HPA) ^7-10. La exposición al estrés de la vida temprana o trauma es un factor de riesgo importante para el desarrollo de anomalías HPA y asociados síndromes de dolor crónico ^10,11 y, como tal, un subconjunto significativo de pacientes con trastornos de dolor pélvico funcionales reportan haber experimentado eventos adversos de la infancia como el abuso o negligencia ^12-14.

Modelos de roedores de la separación materna neonatal (SMN), que consiste en la eliminación de las crías de su presa por un período determinado de tiempo durante el período predestete, se han utilizado durante las últimas dos décadas a estudiar los resultados del estrés de la vida temprana. En general, NMS se ha demostrado que aumenta la activación del eje HPA, y comportamientos similares a la ansiedad resultantes, afectando directamente la expresión génica en el hipotálamo, así como la interrupción de la regulación aguas abajo de las estructuras límbicas ^15-18. La interrupción de funcionamiento adecuado del eje HPA se ha demostrado que contribuyen a una mayor colorrectal ^19-22 Y vaginal ¹⁶ sensibilidad representada por los modelos NMS roedores, pero a pesar de una amplia caracterización de los efectos a largo plazo de la inflamación de la vejiga después del parto ^23-25, el impacto del estrés primeros años de vida ha pasado casi sin estudiar en los órganos urogenitales. Por lo tanto, el siguiente estudio describe cómo realizar NMS en ratones y posteriormente evaluar la sensibilidad mecánica perigenital y la infiltración de mastocitos / activación en la próstata para validar el uso de ratones NMS masculinos como un modelo preclínico para CP / CPPS.

De todos los trastornos de dolor pélvico crónico diagnosticados, CP / CPPS es tal vez el síndrome de menos bien reconocida y caracterizada, a pesar de tener una prevalencia de aproximadamente el 14% ²⁶ y los costos anuales de pacientes estimados en $ 4,400 (el doble que el de la lumbalgia o reumatoide artritis ^27). Los pacientes con CP / CPPS informe dolor en el perineo, el recto, próstata, pene, testículos, y / o el abdomen ^28, experimentan una altagrado gher de estrés psicológico que los pacientes de control ^29, y por lo general se presentan con síntomas de o son diagnosticados con el dolor o el estado de ánimo trastornos pélvicos crónicos comórbidas ^5,29-31. Infección recurrente, el epitelio que gotea, inflamación neurogénica, y autoinmunidad han sido conjeturado como posibles causas subyacentes de la CP / CPPS ^2,32,33, así como la activación de los mastocitos y degranulación ^34. Las secreciones prostáticas expresadas a partir de los hombres con CP / CPPS habían aumentado los niveles de triptasa de mastocitos y factor de crecimiento nervioso (NGF) ^34, y un estudio posterior confirmado que la triptasa y carboxipeptidasa A (CPA3), un marcador de la activación de los mastocitos, también se incrementaron en el orina de pacientes CP / CPPS ^35. El papel potencial de los mastocitos en el inicio y mantenimiento de la CP / CPPS ha sido un foco importante de la investigación con animales en este síndrome hasta el momento. El modelo de roedor más comúnmente empleada utilizado para estudiar CP / CPPS es una prostatitis autoinmune experimental (EAP) modelo de generaciónnerada por inyección subcutánea de antígeno de próstata en adyuvante completo de Freund, lo que resulta en variados grados de inflamación prostática dependiendo de la especie y cepa utilizada ^34,36-39. Infiltración de células de mástil y la activación / desgranulación se ha demostrado que aumenta después de la inducción de la PEA ^34,35,40. Los ratones transgénicos deficientes en cualquiera de los mastocitos ³⁴ o el receptor de triptasa PAR2 ³⁵ no desarrollan la sensibilidad táctica prostática siguiente EAP, a diferencia de los ratones de tipo salvaje de EAP. Si bien este modelo preclínico replica muchas de las características del CP humana / CPPS, el protocolo de inducción no es indicativo de la condición humana, que tiene una etiología diversa y muchas veces no implica inflamación directa, infección o lesión de la próstata.

La influencia del estrés de la vida temprana en el desarrollo de CP / CPPS en los seres humanos en gran medida ha ido sin investigar; Sin embargo, un estudio realizado por Hu, et al. ^41, demostró que men que reportaron una historia de la infancia física, emocional y / o abuso sexual fueron significativamente más propensos a experimentar síntomas sugestivos de CP / CPPS. Además, demostraron que tanto el dolor y las puntuaciones urinarios se incrementaron en los pacientes con antecedentes de abuso físico y emocional. Hemos demostrado anteriormente que el mismo paradigma NMS en hembra C57BL / 6 ratones produce hipersensibilidad vaginal y la expresión génica anormal tanto en la vagina y la vejiga sugestivo de HPA disfuncional eje de salida ^16. Esta evidencia combinada con la alta prevalencia de pacientes CP / CPPS que presentan otras comorbilidades ^42, incluyendo IC / PBS y los trastornos del estado de ánimo, que más claramente han demostrado estar relacionado con la exposición al estrés de la vida temprana ^12-14, proporciona la justificación para el uso de un modelo NMS para investigar CP / CPPS en ratones.

Protocolo

Todos los experimentos descritos en este protocolo se ajustan a las directrices del NIH de conformidad con las directrices especificadas por la Universidad de Kansas Medical Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

1. Separación Materno Neonatal (SMN)

1. Monitorear las presas embarazadas diaria para los nacimientos de basura.
   Nota: El día de la camada nace se considera P0.
2. En P1, retire la presa de la jaula y coloque en un recipiente secundario limpio.
3. Frote un puñado de ropa de cama entre manos limpias enguantada para mantener la esencia de la jaula.
4. Añadir una profundidad de 1-2 cm de la ropa de cama jaula en un lugar limpio, debidamente etiquetado 2 vaso de precipitados L vidrio. Añadir aproximadamente la mitad de cualquier material adicional de enriquecimiento de ropa de cama que está presente en la jaula de alojamiento, por ejemplo, papel de la arruga nestlet, al vaso de precipitados de vidrio.
5. Colocar suavemente todos los cachorros de una sola camada, de forma individual, en el mismo vaso de precipitados.
6. Inmediatamente coloqueel vaso de precipitados en una incubadora a cabo en 33 ^{° C} y 50% de humedad durante 180 min.
7. Retire la presa desde el recipiente secundario y su regreso a la jaula. Devuelva la jaula a su ubicación vivienda adecuada dentro del vivero.
8. Repita este procedimiento para cada camada de someterse NMS, utilizando guantes limpios y contenedores secundarios para cada camada / presa.
9. Al final del período de separación de 180 min, devolver las camadas a sus jaulas en el mismo orden en que fueron retirados.
10. Recuperar la jaula de la primera camada que fue separado al principio del día. Retire la presa de la jaula y coloque en un recipiente secundario limpio.
11. Retire el primer vaso de la incubadora y frotar un puñado de ropa de cama entre las manos enguantadas limpias para mantener el olor de la jaula durante la manipulación de los cachorros.
12. Mueva suavemente los cachorros, de forma individual, desde el vaso a la jaula.
13. Vuelva cualquier enriquecimiento y la ropa de cama que queda en el vaso de precipitados ala jaula.
14. Vuelva la presa del recipiente secundario a la jaula y devolverlo a su ubicación vivienda adecuada dentro del vivero.
15. Enjuague el vaso con agua y devolverla a la incubadora. Utilice el mismo vaso para cada camada durante todo el procedimiento de separación.
16. Repita este procedimiento para cada camada de someterse NMS en el mismo orden en que se colocaron en la incubadora.
17. Repita este procedimiento para cada sometido camada NMS todos los días a través de P21.
18. Destete cachorros NMS e ingenuos en P22 colocando camada del mismo sexo juntos en jaulas limpias completos con los alimentos y el agua. Cachorros Naïve deben nacer y alojados en las mismas condiciones que los ratones NMS, pero se someten a ninguna manipulación adicional fuera de las tareas normales de cría de animales.

2. perigenital Sensibilidad mecánica

1. Configuración Aparato von Frey
   1. Llevar los ratones a la sala de pruebas y permitir que se aclimaten a 30min mientras permanecen en sus jaulas.
   2. Preparar la zona de pruebas mediante la colocación de una almohadilla inferior absorbente debajo de una mesa de alambre de malla superior elevada (79 cm x 28 cm) que proporciona espacio suficiente para permitir que el investigador para acercarse desde la parte inferior sin sobresaltando los ratones, aproximadamente 55 cm de altura.
   3. Coloque hasta 12 ratones, en forma individual, bajo, cámaras de plástico perforadas claras (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) en la parte superior de la tabla de malla de alambre. Coloque un objeto pesado en la parte superior de las cámaras para evitar que los ratones se escape.
   4. Aclimatar los ratones durante 30 minutos adicionales en la pantalla antes de la evaluación umbral de retirada.
2. Evaluación perigenital sensibilidad mecánica
   1. Lleve a cabo el método de arriba-abajo utilizando un conjunto estándar de graduadas monofilamentos de von Frey ^43. Utilice los siguientes monofilamentos: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g, y 4,74 g.
      1. Sostenga la base del 3,22 g de monofilamento y exponer el mono retraídafilamento.
         Nota: Algunos modelos pueden no tener un monofilamento retraída.
      2. Situar la sonda para que el monofilamento se orienta en sentido vertical y cuando el ratón está alerta, inmóvil, y su peso corporal se distribuye en partes iguales entre las patas traseras aplicarlo ya sea a la izquierda oa la derecha del escroto, evitando la línea media, hasta un ligero curva se observa en el filamento.
      3. Mantenga el monofilamento en su lugar durante 10 segundos o hasta que el animal muestra una respuesta positiva.
         Nota: Una respuesta positiva se considera que es un tirón rápido o saltar en respuesta a la aplicación de monofilamento o lamer o morder el comportamiento dirigido hacia el monofilamento. Si se mueve el ratón durante la aplicación monofilamento 10 seg sin mostrar estas conductas, el monofilamento deben ser reexaminados después de un período de descanso de 1 minuto de longitud mínima. Si un ratón ni se mueve ni presenta cualquiera de los anteriores comportamientos enumerados durante la aplicación de monofilamento de 10 seg, se considera una respuesta negativa.
      4. Registre la respuesta, ya sea positiva o negativa, en un cuaderno de laboratorio o portátil y repita este procedimiento en todos los ratones restantes utilizando el 3,22 g de monofilamento.
      5. Prueba de todos los ratones de nuevo utilizando la siguiente monofilamento apropiado. Nota: Si el ratón exhibió una respuesta negativa a la 3,22 g de monofilamento, se aplica la 3,61 g de monofilamento de la misma manera y registrar la respuesta. Si el ratón mostró una respuesta positiva a la 3,22 g de monofilamento, aplicar el 2.83 g monofilamento y registrar la respuesta.
   2. Continúe probando cada ratón utilizando la siguiente monofilamento mayor o menor, según el caso, durante 4 aplicaciones adicionales después de que se observó la primera respuesta positiva.
   3. Ratones Regreso a jaulas.
   4. Utilice el valor de la final de monofilamento de von Frey aplicada en la serie de ensayo en unidades logarítmicas para calcular un umbral de retirada del 50% g como se describe en Chaplan et al. ^43.

título ". Acidificados azul de toluidina Mástil tinción celular> 3

1. Procesamiento de tejidos
   1. Diseccionar tejido prostático ⁴⁴ de los ratones que han sido intracardially perfundidos con helada paraformaldehído al 4% ^45. Postfix el tejido en paraformaldehído al 4% durante 1 hora a RT y luego cryoprotect en 30% de sacarosa en 1x PBS a 4 ° CO / N.
   2. Preparar una pequeña (30 ml) Baño de heptano y colocarlo en hielo seco.
   3. Enjuague el tejido de la próstata en 1x PBS y seque utilizando un trabajo liviano limpie.
   4. Introduce el tejido de la próstata en el heptano frío hasta que se congela.
   5. Inmediatamente coloque el tejido prostático congelado en un criomolde contiene medios de montaje y lugar en hielo seco hasta congelado.
   6. Tienda criomoldes a -20 ° C.
   7. Transversalmente cortar el tejido de la próstata en 7 cryosections micras de espesor usando un criostato.
   8. Coloque 8 - 12 cryosections no de serie que abarcan la longitud del tejido, en portaobjetos de microscopio cargados positivamente.
   9. Tienda terminó diapositivas a -20 ° C hasta su posterior procesamiento.
2. Preparación Acidificados azul de toluidina
   1. Añadir 1 g de azul de toluidina O a 100 ml de etanol 70% y agitar hasta en solución para preparar una solución madre 1%. La solución madre se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de tres semanas.
   2. Añadir 1 g de NaCl a 100 ml de agua en un vaso de precipitados colocado en la parte superior de una placa de agitación.
   3. Ajustar el pH de la solución de NaCl usando HCl 12 M hasta un intervalo de pH de 0,5 - 1.0 se logra.
   4. Preparar la solución de trabajo de azul de toluidina 0,25% combinando 8 ml de la solución madre de azul de toluidina y 32 ml de la solución de NaCl 1%. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para asegurar la incorporación total de la solución madre azul de toluidina y mezclar utilizando un vórtice. La solución de trabajo debe estar recién hecho y se desecha después de usar.
3. La tinción de próstata criosecciones
   1. Retire las transparencias para ser procesados ​​del congelador y deje que se equilibre a la temperatura ambiente durante aproximadamente 30 men.
   2. Lavar las secciones de tejido por inmersión individualmente las diapositivas durante aproximadamente 1 seg en un tubo cónico de 50 ml que contiene un volumen suficiente de 1x PBS para asegurar que las secciones de tejido de deslizamiento montado serán completamente sumergidos. Permitir que las diapositivas se sequen al aire sobre una toalla de papel.
   3. Colocar los portaobjetos en un tarro de tinción de vidrio que contiene suficiente solución de trabajo azul de toluidina 0,25% para asegurar que los cortes de tejido de diapositivas montadas serán completamente sumergidos y se incuban durante 10 - 15 min, mientras que en una mecedora plataforma fijado en 15 rpm.
   4. Diapositivas Dip en 1x PBS durante aproximadamente 1 segundo para lavar el exceso de azul de toluidina.
   5. Colocar los portaobjetos en una caja de portaobjetos o un estante de tal manera que las diapositivas están en sus lados para permitir el drenaje.
   6. Secar los portaobjetos en un horno a 37 ° C durante un mínimo de 2 horas o O / N a temperatura ambiente.
   7. Deshidratar diapositivas rápidamente usando el alcohol, lo que permite a las diapositivas completamente seco entre las exposiciones de alcohol. Diapositivas en seco por el drenaje en una toalla de papel unnd espaldas de limpieza y bordes con un trabajo ligero limpie.
      1. Sumergir los portaobjetos en EtOH al 95% durante aproximadamente 1 segundo y deje que se seque completamente. Repita este procedimiento 1 - 10 veces hasta que el tejido se seca más azul que violeta.
      2. Sumergir los portaobjetos en EtOH al 100% durante aproximadamente 1 segundo y deje que se seque completamente. Repita este procedimiento 1 - 10 veces hasta que el tejido es oscuro al azul medio, pero no de color púrpura.
   8. Fijar la mancha incubando las diapositivas de 100% xileno durante 3 min. Deje que se seque.
   9. Cubreobjetos las diapositivas con glicerol, PBS, o medio de montaje permanente a base de xileno. Escurrir el exceso de medios de comunicación y almacenar a temperatura ambiente.
4. Las células cebadas Cuantificación
   1. Visualice las secciones de tejido teñidas de azul de toluidina al 20X de aumento utilizando microscopía de luz (Figura 2).
   2. Cuente el número total de los mastocitos presentes en la zona visualizada y diferenciar entre los mastocitos no degranulados y degranulados. 40X magnífication puede ser necesario para confirmar el estado de granulación en algunos mastocitos.
      Nota: Los mastocitos no degranulados exhiben metacromasia densa con ninguna o leve contorno nuclear y / o sin extrusión granular alrededor de la celda. Mastocitos desgranulados exhibir menos intensa metacromasia y tener un esquema claro obvio del núcleo y / o gránulos libres en el citoplasma y el exterior del borde de la celda.
   3. Continuar para evaluar el número total de los mastocitos no degranulados y degranulados en la totalidad de la sección de tejido actual. Repita este procedimiento en al menos 7 secciones separadas adicionales, que abarca la longitud de cada tejido.
   4. Calcular el porcentaje de degranulated (DG) a las células cebadas totales para cada tejido / ratón de acuerdo a la siguiente ecuación: (mastocitos dg / Total de mastocitos) x 100.

Resultados

Los ratones que han sido sometidos a NMS mostró evidencia de comportamiento indicativos de CP / CPPS. Cuando se prueba con una serie graduada de monofilamentos de von Frey, ratones NMS 8 semanas de edad (n = 4) que se muestra la alodinia mecánica perigenital en comparación con homólogos no tratados (n = 5, Figura 2). Esto se evidencia como una reducción significativa (p <0,01; prueba t de Student) en el umbral de retirada mecánica que provocó una respuesta de comportamiento positivo, ...

Discusión

Este protocolo proporciona la metodología para el uso de estrés neonatal, en forma de NMS, para inducir sintomatología indicativa de CP / CPPS en ratones machos adultos. Como adultos, los ratones muestran NMS alodinia mecánica perigenital significativa, así como pruebas de desgranulación de los mastocitos en el tejido prostático. El uso de NMS es un nuevo enfoque para el desarrollo de un modelo preclínico de CP / CPPS en que replica el estrés de la vida temprana que a menudo se informó por los pacientes con do...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant C57BL/6 female mice	Charles River	027	Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2 L glass beaker(s)	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic	VWR International	414005-124	The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)	Stoelting	58011	The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats)	IITC	435	Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)	IITC	410	Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane	Sigma-Aldrich	246654	Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold	VWR International	4557	To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes	BioExpress	C-3394	Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover	Fisher Scientific	08-815	Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological)	Fisher Scientific	X3P	Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place	VWR International	82003	Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box	Fisher Scientific	22-363-400	These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1	VWR International	48393-106	A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope	Nikon		The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.