En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6

Resumen

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

Resumen

Células dendríticas plasmacitoides (PDC) son potentes interferón de tipo I (células productoras de IFN-I) que se activan en respuesta a la infección o durante las respuestas inflamatorias. Por desgracia, el estudio de la función PDC se ve obstaculizada por su baja frecuencia en los órganos linfoides, y los métodos existentes para la generación in vitro DC favorecen predominantemente la producción de los CDC sobre PDC. Aquí presentamos un enfoque único para generar eficientemente PDC de progenitores linfoides comunes (CLPS) in vitro. Específicamente, el protocolo descrito detalles cómo purificar CLPs desde la médula ósea y generar PDC por cocultivo con AC-6 células alimentadoras gamma-irradiado en presencia de ligando de Flt3. Una característica única de este sistema de cultivo es que los CLPs migran por debajo de las células AC-6 y se convierten en células de adoquines en la zona de formación de, un paso crítico para la expansión de PDC. Morfológicamente distintos países en desarrollo, a saber, PDC y CDC, se generaron después de aproximadamente 2 semanas con una composición de 70-90% PDC en condiciones óptimas. Típicamente, el número de PDC generados por este método es más o menos 100 veces del número de CLPs sembradas. Por lo tanto, este es un sistema novedoso con el que para generar robustamente el gran número de PDC necesarias para facilitar estudios adicionales en el desarrollo y la función de estas células.

Introducción

Las células dendríticas (DC) son células presentadoras de antígeno profesionales que desempeñan un papel importante en el control de las respuestas inmunitarias ^1. Mientras que los países en desarrollo son heterogéneos, que se pueden clasificar en dos poblaciones, convencional DC (CDC) y los DC plasmocitoides (PDC) ^2,3. Además de los órganos linfoides, CDCs y PDC también se encuentran en tejidos incluyendo pulmón, intestino, piel y ^2. La morfología de los CDC y PDC difiere, con CDC expositoras proyecciones dendríticas como y la forma de PDC son como células más plasma. Además, el marcador DC ratón común, CD11c, está más altamente expresado en CDC que en PDC. Por otra parte, CDC puede ser dividida en CD11b ⁺ CD24 ^- CDC y CD11b ^- CD24 ⁺ CDC, los cuales expresan mayores niveles de MHC de clase II y moléculas coestimuladoras que hacen PDC ^2. PDC maduros, por otro lado, se ha demostrado para expresar selectivamente Siglec-H y BST2 ^4. Functionally, CDCs son mejores células presentadoras de antígenos que son PDC; sin embargo, PDC pueden producir una gran cantidad de interferón de tipo I sobre la infección por el virus o la estimulación inflamatoria ^5.

Ambos CDC y PDC son de corta duración, y por lo tanto, deben ser constantemente repuestos de progenitores dentro de la médula ósea ^(MO) 6,7. La transferencia adoptiva de células progenitoras mieloides comunes (CMPS) y progenitores linfoides comunes (CLPS) en ratones letalmente irradiados demuestra que CDCs y PDC pueden ser generados a partir de ambos linajes ^8-10. Sin embargo, no es un subconjunto de PDC que expresan RAG1 / 2 y poseen segmentos DJ reordenados el locus IgH en ^11,12. Estas células también comparten similitudes moleculares con linfocitos B, incluyendo la expresión del marcador B220, los receptores de ácido nucleico de detección (TLR7 / TLR9), y factores de transcripción (SPIB y BCL11A) ^13, todas las características que se cree firmas del linaje linfoide. Por lo tanto, CLPs pueden ser buenas opciones para la generación in vitro de PDC, debido a la similitud linaje.

Si bien la frecuencia de ambos CDCs y PDC en humanos y ratones es muy baja ^6, países en desarrollo, en particular los CDC, se puede generar in vitro a partir BM o progenitores en presencia de citoquinas, tales como GM-CSF ^11,14 o ligando Flt3 (FL ) utilizando sistemas de alimentación libre de ^11,15,16. Desafortunadamente, sin embargo, no es posible producir un gran número de PDC in vitro utilizando FL ^11,15,16. Anteriormente hemos demostrado que la PDC se pueden generar de manera eficiente in vitro a partir CLPs utilizando el sistema de alimentación AC-6 ^17. La ventaja de usar la línea celular estromal AC-6 en el sistema de cultivo es que proporciona contacto célula-célula y la secreción de citocinas que soportan la generación de un gran número de PDC de CLPs. Aunque la producción con este sistema es bastante robusto, i se requiere la replicación cuidadosa de los procedimientos descritos a continuaciónorden n para asegurar la generación eficiente de PDC.

Protocolo

C57BL / 6 ratones de tipo salvaje se compraron desde el Centro Nacional de Animales de Laboratorio (NLAC), Taiwán. Todos los ratones fueron criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos. Protocolos y procedimientos de uso de animales fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Nacional de Taiwán Colegio de Medicina (Número de Permiso: 20120075). Además, los investigadores hicieron todo lo posible para reducir el potencial de dolor, sufrimiento o angustia en los animales, mientras que la realización de experimentos. Todos los procedimientos descritos se llevaron a cabo a temperatura ambiente, mientras que el uso de guantes.

1. Preparación de 6-CA células Feeder

Nota: El AC-6,21 (AC-6 en corto) línea celular estromal ¹⁸ (proporcionado por Weissman I., Universidad de Stanford) debe mantenerse en RPMI suplementado con suero inactivado por calor 15% bovino fetal (FBS). Para servir como células alimentadoras, AC-6-γ células son irradiadas con 3000 rad (30 Gy) un día antes de que el co-cultivo para evitar su proliferación. Nota ªAC-6 células tienden a perder su capacidad de diferenciación de apoyo si se deja de hacinamiento durante el mantenimiento, o si su número pasaje es más de 20.

1. Wash AC-6 células una vez con 1 ml de fosfato solución salina tamponada de Dulbecco (DPBS) y quitar DPBS por aspiración. Tratar AC-6 células con 0,8 ml de solución de tripsina (0,05% de tripsina y EDTA 0,5 mM en DPBS) durante 3-5 min ^a 37 ° C, 5% de CO ₂ y luego se detiene la reacción mediante la dilución con 10 volúmenes de medio de cultivo a hacer suspensión de células individuales.
2. Semilla AC-6 células en 5.9x10 ^{4 células} / pocillo en placas de 12 pocillos y se incuban ^a 37 ° C, 5% de CO ₂ O / N.
   Nota: La densidad del AC-6 células es muy importante ya que una menor densidad favorecerá la generación de los CDC. La siembra a una densidad de 5.9x10 ^{4 células} / pocillo permitirán AC-6 para llegar a la confluencia al día siguiente, que es óptima para la derivación de PDC de CLPs.
3. Irradiar AC-6 células a 3000 rad (30 Gy) utilizando γ-irradiador.
   Nota: La dosis utilizada para irradiar AC-6 está optimizado para evitar que las células proliferen y, sin embargo mantenerlos viables tiempo suficiente para proporcionar las citoquinas y contacto célula-célula necesarios para la diferenciación de los países en desarrollo de CLPs.
4. Aspirar medio y reemplazar con 1 ml de RPMI completo (RPMI con inactivado por calor 10% de FBS, 50 mg / ml de gentamicina y 50 mM β-mercaptoetanol).

2. Las células Isolate BM a partir de ratones

1. Sacrificar los ratones por _asfixia con CO2 y dislocación cervical. Coloque los ratones en una bandeja de disección y esterilizar con etanol al 70%. Hacer una incisión en la mitad del abdomen y retirar la piel de la parte distal del ratón incluyendo la piel que cubre las extremidades inferiores.
2. Diseccionar los ratones en una campana semi-estéril. Para liberar el fémur y la tibia, cortar el fémur arriba y tibias por debajo de la articulación de la rodilla. Separar los músculos de los huesos utilizando tijeras y colocar los huesos en una placa de Petri de 6 cm que contiene 5 ml de RPMI completo.
3. Mover a una campana de cultivo estéril. Llene una jeringa de 3 ml conectada a una aguja 27G con RPMI completo. Cortar los dos extremos de los huesos con unas tijeras, e inserte la aguja 27G para limpiar la médula de los huesos inyectando suavemente RPMI completo una vez desde cada extremo.
4. Preparar una suspensión de células por pipeteo suave de las células arriba y abajo de 3-5 veces en la placa de cultivo utilizando la jeringa sin la aguja.
5. Centrifugar las células durante 5 min a 500 xg y decantar el sobrenadante.
6. Lisar células rojas de la sangre con 1 ml de tampón ACK (150 mM NH ₄ Cl, 10 mM _KHCO3, EDTA 0,1 mM) incubando durante 1 min y detener la reacción diluyendo con 10 volúmenes de RPMI completo. Permitir que las células en reposo durante 5 minutos con el fin de precipitar por grupos de células muertas y restos de tejido por la gravedad.
   Nota: No se pare más de 5 minutos ya que esto dará lugar a la pérdida de células debido a la sedimentación de células viables.
7. Lentamente decantar el sobrenadante que contiene células a un nuevo tubo de escombros dejandoatrás en tubo original.
8. Centrifugar durante 5 minutos a 500 xg para sedimentar las células, a continuación, retirar y desechar el sobrenadante.
9. Resuspender las células totales BM (típicamente 4-6 x 10 ⁷ BM células se obtienen de un ratón) en 100 l de tampón FACS (PBS 1x + 2% de FBS + 1 mM EDTA).

3. FACS análisis y clasificación de CLPs

1. Añadir anti-CD16 / 32 (clon de hibridoma sobrenadante 2.4G2, 50 l / reacción ó 1-2 g / reacción) en las células en tampón FACS (paso 2.9) durante 1-2 min con el fin de bloquear los receptores de Fc.
   Nota: Anti-CD16 / 32 también se denomina bloque de Fc, que se añade para evitar la unión no específica de anticuerpos a células que expresan receptores de Fc, incluyendo los granulocitos, monocitos y linfocitos B.
2. Simultáneamente teñir las células con los siguientes anticuerpos marcados con colorante fluorescentes (por 4x10 ⁷ células) durante 15 min en hielo, evitando la luz ambiente. Anticuerpos: marcadores de linaje PE-conjugados (0,2 g cada uno) incluyendo anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119), y anti-MHC-II (RMIN-4), 0,2 g anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 g anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 g anti-M-CSFR-APC (AFS98), y 0,2 g anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
3. Lavar las células con 3 ml de tampón FACS, y centrifugar durante 5 min a 500 x g.
4. Resuspender las células en 300 L de tampón FACS y celdas de filtración a través de un filtro de células 40 M.
5. Lave el tubo con un tampón adicional 100 l FACS para recuperar las células restantes y filtrar en un tubo estéril FACS de clasificación utilizando el mismo filtro de células.
6. Realizar análisis de citometría de flujo inmediatamente después de la tinción utilizando filtros y tensiones adecuadas para la detección de señales. Utilice 488 nm láser para detectar los anticuerpos marcados con PerCP-Cy5.5 FITC,, 561 nm láser para detectar el PE y los anticuerpos PE-Cy7 labelded y 633 nm laser para detectar el anticuerpo marcado con APC.
7. Clasificar CLPs de acuerdo con los siguientes marcadores lin ^- c-kit ^int Sca-1 ^int M-CSFR ^- IL-7Rα ⁺ (como manchado en el paso 3.2) utilizando un clasificador de células. Recoger las células clasificadas en un tubo de 15 ml que contiene 8 ml de RPMI completo como un colchón.
8. Registre el número absoluto de células clasificadas como se muestra por el clasificador de células al final de la carrera. Típicamente, 5x10 ⁴ CLPs se pueden obtener de la BM de un ratón.

4. cocultivo CLPs y AC-6

1. Centrifugar las células clasificadas desde el paso 3.7 durante 10 minutos a 500 x g, separar el sobrenadante y resuspender el botón celular suficiente RPMI completo para obtener una densidad celular alrededor de 5x10 ⁴ células / ml. Seed 500 células / pocillo en la placa de 12 pocillos que contiene células alimentadoras preparados en el paso 1.4.
2. Añadir 100 ng / ml FL ¹⁹ (hu-Flt3L-Ig generado en la casa usando un sistema de expresión proporcionado por M. Manz, UniversiHospital de Ty Zürich, Suiza) y se incuba a 37 ^{° C,} 5% de CO ₂ con el monitoreo visual periódica del desarrollo DC bajo un microscopio.
   Nota: disponible comercialmente FL humana recombinante o el ratón FL se pueden utilizar como un sustituto para hu-Flt3L-Ig para apoyar el desarrollo DC.
3. Recoger las células en el sobrenadante a 12 días y lavar los pocillos una vez con 0,5 ml de medio RPMI completar la combinación de los sobrenadantes resultantes. Añadir 0,5 ml de medio fresco y desechar las células adherentes con un raspador de células.
4. Combinar el medio que contiene células de ambas partes y centrifugar durante 5 min a 500 x g.
5. Sobrenadante y resuspender las células en tampón FACS Decantar 50 l. Añadir 50 l anti-CD16 / 32 hibridoma sobrenadante y se incuba durante 1-2 minutos para bloquear los receptores Fc.
6. Enumerar y manchar todas las células con los siguientes anticuerpos (0,05 g cada uno) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC y anti-B220-PE.
7. Lavar y centrifugar las células como describird en el paso 3.3.
8. Resuspender las células en 100 l de tampón FACS, puerta de CD11c ⁺ y analizar para el CDC (CD11c ⁺ CD11b ⁺ B220 ^{-) y} PDC (CD11c ⁺ CD11b ^- B220 ^{+) 17.}

Resultados

Un total de 4-6x10 ⁷ células BM normalmente están aislados de los fémures y tibias de un solo 6/8 semanas de edad, de tipo salvaje C57BL / 6 mouse. Para resolver CLPs, células totales BM se tiñeron con anticuerpos conjugados con PE contra marcadores de linaje (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, Ter119, y MHC-II), anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC y anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analizados y ordenados con un clasificador de células. La estrategia de clasificación de CLP...

Discusión

Aquí se describe un sistema de cultivo in vitro para la generación de DCs robusta, y PDC, en particular, a partir de un pequeño número de CLPs. La singularidad de este sistema de cultivo se debe a la utilización de AC-6 células, una línea celular estromal, como alimentadores. Este enfoque ha sido demostrado para proporcionar no sólo las citoquinas, tales como IL-7, SCF, M-CSF y FL ^20, sino también el contacto célula-célula ²¹ necesario para apoyar el desarrollo DC. AC-6 células...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5	Biolegend	108408	linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136	Biolegend	108708	linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70	Biolegend	101208	linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3	Biolegend	115508	linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2	Biolegend	103208	linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2	Biolegend	100308	linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7	Biolegend	100707	linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4	Biolegend	107608	linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119	Biolegend	116208	linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51	eBioscience	12-0900-83	linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98	Biolegend	135510	FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8	Biolegend	105824	FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7	Biolegend	108106	FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34	Biolegend	135014	FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418	Biolegend	117328	FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70	Biolegend	101206	FACS
FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
FACS sorting tube	BD Biosciences	352054
FlowJo	FlowJo LLC		Flow analysis sofrware