Un sistema de puntuación rápida fenotípica Neurológica para la Evaluación de progresión de la enfermedad en el SOD1-G93A modelo de ratón de la ELA

Resumen

This video protocol describes a sensitive, reliable, and quick method for evaluating the neuromuscular deficits in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.

Resumen

The SOD1-G93A transgenic mouse is the most widely used animal model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). At ALS TDI we developed a phenotypic screening protocol, demonstrated in video herein, which reliably assesses the neuromuscular function of SOD1-G93A mice in a quick manner. This protocol encompasses a simple neurological scoring system (NeuroScore) designed to assess hindlimb function. NeuroScore is focused on hindlimb function because hindlimb deficits are the earliest reported neurological sign of disease in SOD1-G93A mice. The protocol developed by ALS TDI provides an unbiased assessment of onset of paresis (slight or partial paralysis), progression and severity of paralysis and it is sensitive enough to identify drug-induced changes in disease progression. In this report, the combination of a detailed manuscript with video minimizes scoring ambiguities and inter-experimenter variability thus allowing for the protocol to be adopted by other laboratories and enabling comparisons between studies taking place at different settings. We believe that this video protocol can serve as an excellent training tool for present and future ALS researchers.

Introducción

Desde su desarrollo a mediados de la década de 1990 el modelo de ratón transgénico SOD1-G93A ha sido el modelo animal más utilizado de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) ^1. Este modelo de ratón transgénico fue modificado genéticamente para sobreexpresar una forma mutante del gen de la superóxido dismutasa Cu / Zn humana 1 (SOD1) que alberga la glicina asociado-ALS a la mutación de alanina en el aminoácido 93 (G93A). La mutación G93A es una de muchas mutaciones en el gen SOD1 que colectivamente maquillaje aproximadamente un quinto de los casos de ELA familiar ^2.

El modelo de SOD1-G93A se ha convertido en un caballo de batalla de la investigación para el desarrollo de drogas ALS porque además de su vínculo genético obvio para la ELA, que recapitula muchas de las características patológicas de la ELA en los seres humanos, como la pérdida de las neuronas motoras, debilidad muscular progresiva y atrofia, con eventual parálisis y muerte ^3. Aunque, como es a menudo el caso con modelos de animales transgénicos, hay una bi inherenteological la variabilidad asociada con los ratones SOD1 G93A-. Scott et al. han determinado que son necesarios cohortes de al menos 24 ratones basura emparejados con equilibrio de género en el diseño de los estudios fármaco-eficacia para superar el ruido creado por la variabilidad biológica ^4. El gran número de animales necesarios en estos estudios en combinación con el avance de la enfermedad agresiva y la necesidad de un seguimiento diario prohíbe el uso de técnicas elaboradas, que consumen mucho tiempo y potencialmente estresantes para medir la fuerza y la función neuromuscular (por ejemplo, la electromiografía, la fuerza de prensión, rotorod , etc.). En su lugar, se destaca la necesidad de un instrumento de cribado en vivo que evalúa de forma fiable la función neuromuscular de los ratones SOD1-G93A de una manera rápida.

En ALS TDI se desarrolló un protocolo que permite la evaluación fiable de la función neuromuscular de los ratones SOD1 G93A-en menos de 30 seg por ratón en promedio. Este encompa protocoloSSES evaluación diaria de la función de las extremidades posteriores utilizando un sistema simple neurológica puntuación (NeuroScore) que se describe en este informe en la prensa y en vídeo. NeuroScore se centra en la función de las extremidades posteriores debido a déficits miembros posteriores son los primeros informó signo neurológico de la enfermedad en ratones SOD1-G93A ^5,6. Además, el protocolo desarrollado por ALS TDI proporciona una evaluación imparcial de inicio de la paresia (parálisis ligera o parcial), la progresión y la gravedad de la parálisis y es lo suficientemente sensible para identificar los cambios inducidos por fármacos en progresión de la enfermedad.

Protocolo

Todos los experimentos se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos descritos por los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales y fueron aprobadas por el cuidado de animales institucional y el empleo de ALS TDI (IACUC).

1. Los animales, Vivienda y Diseño del estudio

Nota: La colonia de ratones SOD1-G93A se deriva de la alta copia B6SJLTgN (SOD1G93A) cepa 1Gur producido originalmente por Gurney et al ^7.. La colonia se mantiene actualmente por cruzar transgénicos machos C57BL / 6-SJL con el tipo salvaje C57BL / 6 hembras F1-SJL. Los animales F1 se generan mediante el cruce de machos con hembras SJL B6. Los ratones son enviadas a ALS TDI semanal en 35-45 días de edad.

1. Permita que los ratones por lo menos una semana para aclimatarse a la instalación para animales (12 horas de luz / oscuridad ciclo a una temperatura de 18-23 ° C y 40-60% de humedad) antes de asignar a un estudio.
2. Casa SOD1-G93A masculina mice un ratón por jaula, ya que el grupo ocupa los hombres tienden a luchar. Casa ratones hembra SOD1-G93A hasta dos por jaula. Proporcionar enriquecimiento ambiental, en la forma de chozas de plástico. Proporcionar alimentos y agua a voluntad, a menos que los ratones son parte de un estudio que requiere la administración de fármacos en el agua potable / alimentos. En estos casos, la ración y registro de alimentos y agua.
3. Comienza un estudio fármaco-eficacia alrededor del día 50 años de edad e incluyen 64 ratones equilibrio de género basura emparejados (32 por cohorte). Por último, asegúrese de que los investigadores que realizan los estudios están cegados a las condiciones experimentales.
   Nota: Se recomienda que un estudio típico de drogas-eficacia comienza en día 50 años de edad, sin embargo en base al tipo de intervención terapéutica podría ser preferible para iniciar el estudio anterior o posterior.
   Nota: Un estudio con 32 ratones por cohorte está diseñado para detectar drogas efectos específicos de género. Si no se requieren comparaciones específicas de género, 24 ratones por cohorte debería ser suficiente para detectar drogas-efectos globales.

2. Peso Corporal

1. Pesos corporales de registro para todos los ratones en los estudios diarios con una precisión de una décima parte de un gramo. Nota: El peso corporal es un indicador sensible de la progresión de la enfermedad y de cualquier malestar que pudiera derivarse de un tratamiento crónico de drogas.
2. Pesos corporales mouse varían considerablemente durante el transcurso de un día, siendo mayor en las mañanas, por lo que registran alrededor de la misma hora todos los días.

3. Sistema de Puntuación Neurológica (NeuroScore)

1. Evaluar resultados neurológicos (NS) para cada ratón diaria al observar el ratón bajo las tres condiciones siguientes realizan secuencialmente: a) el ratón se suspende por la cola, b) se permite que el ratón para caminar, y después de la aparición de la parálisis c) el ratón se coloca en su lado.
   1. Para el ensayo de suspensión por la cola, mantenga el ratón aproximadamente 1,5 "de la base de la cola sobre la parte superior de alambre de su jaula hogar durante 1-2 seg, lejos de la cuenca alimentos, mientras que observing las extremidades posteriores. Repita la prueba de suspensión de 3 veces y registrar el resultado más consistente.
   2. Para la prueba de marcha, coloque el ratón sobre una superficie limpia que proporciona algo de tracción y una distancia de 25 cm (por ejemplo., Una toalla de papel pegado abajo para evitar el deslizamiento). Deje que el ratón para caminar un total de 75 cm (3 veces la longitud de la toalla de papel), mientras que la observación de su marcha.
   3. Para la prueba de "reflejo de enderezamiento", coloque el puntero del ratón sobre su lado izquierdo o derecho y el uso de un cronómetro medir el tiempo que tarda en derecho en sí mismo sin ayuda de ambos lados. Sólo se requiere un ensayo de esta prueba: Nota.
2. Determinar el NS de cada miembro posterior (izquierda o derecha) de forma independiente en una escala de 0 a 4. Nota: Por ejemplo, una puntuación de 0, 1 indica que el miembro posterior izquierdo NS es 0, mientras que el miembro posterior derecho NS es 1.
3. Asignar puntuaciones neurológicas (0-4) corresponden a la siguiente serie de observaciones (resumen proporcionados en la Tabla 1):
   1. Asignar NS 0 (pre-sintomática) si se observa lo siguiente: Cuando el ratón se suspende por la cola, el miembro posterior presenta un ensanchamiento normal, es decir, que quede totalmente extendido fuera de la línea media lateral y se mantiene en esta posición durante 2 segundos o más tiempo. Cuando se permite que el ratón para caminar, se observa la marcha normal.
   2. Asignar NS 1 (Primeros síntomas) si se observa lo siguiente: Cuando el ratón se suspende por la cola, el miembro posterior presenta un ensanchamiento anormal, es decir, se derrumbó o parcialmente se derrumbó hacia la línea media lateral o tiembla durante la suspensión de la cola o se retrae / abrochado. Cuando se permite que el ratón para caminar, se observa la marcha normal o ligeramente lento.
   3. Asignar NS 2 (El inicio de la parálisis) si se observa lo siguiente: Cuando el ratón se suspende por la cola, el miembro posterior es parcial o completamente colapsado, que no se extiende mucho. (Hay que aún puede haber movimiento de la articulación). Cuando se permite que el ratón para caminar, el miembro posterior se utiliza para mot hacia adelanteion Sin embargo los dedos se doblen hacia abajo al menos dos veces durante una 90 cm caminar o cualquier parte del pie está arrastrando a lo largo de fondo de la jaula / mesa. Cuando el ratón se coloca en su lado izquierdo y derecho, es capaz de enderezarse en 10 s de ambos lados.
   4. Asignar NS 3 (parálisis) si se observa lo siguiente: Cuando el ratón se suspende por la cola, hay una parálisis rígida en el miembro posterior o movimiento de la articulación mínima. Cuando se permite que el ratón para caminar hay movimiento hacia adelante sin embargo, el miembro posterior NO está siendo utilizado para el movimiento hacia adelante. Cuando el ratón se coloca en su lado izquierdo y derecho, es capaz de enderezarse en 10 s de ambos lados. Nota: En raras ocasiones, después del inicio de la parálisis, la humedad de la orina puede aparecer en las extremidades posteriores. Izquierda humedad orina no tratada puede dar lugar a la orina "quemadura" y lesiones en la piel. Tratar a la humedad de la orina por el recorte del pelo, aplicar agua caliente empapa para eliminar la orina, y secar suavemente seco. Si las lesiones cutáneas están presentes aplicar antibioungüento tic.
   5. Asignar NS 4 (Protectora de Animales de punto final) si se observa lo siguiente: Cuando el ratón se suspende por la cola, hay una parálisis rígida en las extremidades posteriores. Cuando se permite que el ratón para caminar, no hay movimiento hacia adelante. Cuando el ratón se coloca en su lado izquierdo y derecho que no es capaz de enderezarse en 10 s de un lado SEA. Es decir, la ausencia del reflejo de enderezamiento.

4. Entrada de datos y análisis

1. Durante el curso de un estudio de la eficacia del fármaco, introduzca los datos recogidos para cada ratón en un Sistema de Gestión de Información de Laboratorio (LIMS) o en una hoja de cálculo de software disponible comercialmente.
   Nota: El software LIMS desarrollada TDI ELA es un repositorio central para todos los datos recogidos en estudios internos, por lo que estos datos de fácil acceso a través del tiempo para los investigadores ALS TDI. LIMS rastrea cualquier ratón individual, con su identificador único, de vuelta a su linaje, el peso corporal o la puntuación neurológica en todas las jornadas de estudio,e incluye cualquier otra observación observadas durante su vida útil. LIMS en última instancia genera una hoja de cálculo que se utiliza para los análisis posteriores.
2. Tras la realización de un estudio de medicamentos de eficacia, es decir, cuando todos los ratones alcanzan el punto final humano, software de uso de hojas de cálculo (véase la Tabla de Materiales) para calcular el NS combinado para cada ratón, para cada día promediando la extremidad posterior izquierda y derecha NS . A continuación, calcular la edad mediana en cada NS para cada ratón y el número de días cada ratón pasa a un NS particular.
3. Analizar los cambios globales en NS a través del tiempo mediante la importación de los datos desde el software de hoja de cálculo para el software estadístico (véase la Tabla de Materiales). Coloque estos datos mediante un modelo de regresión logística ordinal que estima el NS esperado, con mediana de edad al NS y tratamiento de drogas como los efectos en la regresión. Utilizando la prueba de chi cuadrado de log-rank estimar la probabilidad de efecto probabilidad y determinar si el efecto del tratamiento de drogas en NS progresión es estadísticamente significativa (véase el Archivo Código Suplementario para obtener instrucciones paso a paso).
   Nota: Un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.
   Nota: Este método de análisis estadístico respeta la naturaleza ordinal de los datos NS y la naturaleza variable de las trayectorias NS para ratones individuales. Se prefiere debido a trayectorias individuales NS pueden ser marcadamente diferente que resulta en NS promedios de grupos de tiempo asociada a que no son suficientemente reflectante de respuestas NS. Además, en algunos casos NS pueden fluctuar, especialmente cuando en el rango de cero a uno.
4. Por último, el software de uso de gráficos (ver la Tabla de Materiales) para generar "ordinal esperado NS vs Mediana Edad en NS" gráficos para los animales tratados con el fármaco y de control (Figura 2; véase Código Suplementario de archivos para obtener instrucciones paso a paso). Utilice estos gráficos para estimar convenientemente cambios entre los grupos tratados con el fármaco y de control mediante la interpolación del eje y la edad media de inicio de la enfermedad (i.e., NS 2) en el eje x.
   Nota: La diferencia en la edad mediana entre los dos grupos representa un cambio inducido por fármacos y se trata como una medida práctica de la magnitud del efecto.
   Nota: se desplaza hacia la derecha en el NS frente a la curva mediana de edad esperada indican frenado la progresión de la enfermedad sintomática. Por el contrario, los cambios hacia la izquierda en el NS frente a la curva mediana de edad esperada indican aceleran la progresión de la enfermedad sintomática.

Resultados

Los datos de la puntuación neurológica de 90 hombres y 94 no tratados ratones SOD1-G93A femenina estudiaron en ALS TDI fueron evaluados durante 2014. Los resultados muestran que los ratones machos tienen típicamente una progresión de la enfermedad más agresiva que los ratones hembra, como se evidencia por una mayor proporción de su vida útil en NS 1 en comparación con las mujeres. NS NS 2 y 3 se producen con prácticamente la misma frecuencia a través de géneros. NS 0 fue excluido del análisis porque se consi...

Discusión

En este informe, se describe un protocolo de vídeo rápida y simple que, si se aplica correctamente, es capaz de evaluar de forma fiable la progresión de la enfermedad en ratones SOD1-G93A y la identificación de los cambios inducidos por las drogas. Mientras que diferentes grupos han desarrollado sistemas de puntuación fenotípicas de ratones SOD1-G93A ^8-10, que a menudo no proporcionan suficientes detalles sobre el procedimiento y no son adecuados para la replicación. Como resultado, los sistemas de pun...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur strain	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME	002726	Strain of mice used in this study
Breeders	Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA		Colony maintainance
Scale	Navigator OHAUS, Parsippany, NJ	Model N14120	Used to weigh mice
Nutra-GelH	Bio-Serv, Flemington, NJ	#S4798	Wet food provided to sick mice
Irradiated Lab Animal Diet	Harlan, Indianapolis, IN	2918-111914M	Chow diet
Lab-grade Sani-chips	Harlan Teklad, Indianapolis, IN	7090	Bedding
JMPH	SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC	v10.0.2	Statistical software
Microsoft Excel	Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA	Excel 2013 (v 15.0)	Spreadsheet software
GraphPad Prism 5	GraphPad software Inc., La Jolla, CA	v5.4	Graphing software
Mouse Huts	Bio-Serv, Flemington, NJ	K3272	For environmental enrichment