Un método general para evaluar los efectos de estimulación cerebral profunda en Intravenosa metanfetamina Auto-Administración

Resumen

This article describes the delivery of intracranial electrical stimulation that is temporally and spatially separate from the drug-use environment for the treatment of IV methamphetamine dependence.

Resumen

Substance use disorders, particularly to methamphetamine, are devastating, relapsing diseases that disproportionally affect young people. There is a need for novel, effective and practical treatment strategies that are validated in animal models. Neuromodulation, including deep brain stimulation (DBS) therapy, refers to the use of electricity to influence pathological neuronal activity and has shown promise for psychiatric disorders, including drug dependence. DBS in clinical practice involves the continuous delivery of stimulation into brain structures using an implantable pacemaker-like system that is programmed externally by a physician to alleviate symptoms. This treatment will be limited in methamphetamine users due to challenging psychosocial situations. Electrical treatments that can be delivered intermittently, non-invasively and remotely from the drug-use setting will be more realistic. This article describes the delivery of intracranial electrical stimulation that is temporally and spatially separate from the drug-use environment for the treatment of IV methamphetamine dependence. Methamphetamine dependence is rapidly developed in rodents using an operant paradigm of intravenous (IV) self-administration that incorporates a period of extended access to drug and demonstrates both escalation of use and high motivation to obtain drug.

Introducción

La metanfetamina es un psicoestimulante que produce una euforia intensa y prolongada debido a un aumento agudo en monoaminas sinápticas, en particular la dopamina. Dependencia de metanfetamina es un problema de salud epidemia con un estimado de 25 a 34 millones de usuarios a nivel mundial y no ^1,2 tratamiento probado. Hay una necesidad sustancial de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para la dependencia de la metanfetamina. La estimulación cerebral profunda (DBS) es un procedimiento neuroquirúrgico que utiliza un "marcapasos" cerebro para normalizar los patrones de disparo neuronal perturbadoras que se producen en determinadas enfermedades, incluyendo la enfermedad de Parkinson, la distonía y el temblor esencial ^3. Informes de casos humanos recientes sugieren que DBS también puede ser un tratamiento eficaz para la dependencia del alcohol y de drogas, pero la evidencia preclínica con respecto a los psicoestimulantes (por ejemplo., Cocaína, metanfetamina) se limita ^4-8.

Continua la estimulación cerebral profunda, ya que es currently practica, requiere la cooperación excepcional de la paciente y su / su familia. Cuidado de heridas meticulosa e higiene personal son necesarios para proteger el hardware marcapasos subyacente, que es susceptible a la infección incluso en pacientes que no usan drogas intravenosas con bacteriemia resultante. Seguimiento regular del dispositivo DBS también es necesario dado el diseño de lazo abierto del sistema; médicos con experiencia alteran la configuración de DBS moderna para disminuir síntomas diana durante citas en la clínica de rutina ^3. Este paradigma de tratamiento se limitará en los consumidores de cocaína y metanfetamina debido a sus situaciones psicosociales difíciles. Varios estudios de roedores han imitado este paradigma poco práctico mediante el examen de los efectos de DBS cuando la terapia se suministra de forma continua durante los procedimientos de auto-administración de cocaína en el entorno de uso de drogas ^9-11.

No invasiva técnicas discontinuos que no requieren hardware mora, como transcranealLa estimulación magnética (TMS), puede ser una mejor opción para el tratamiento de los trastornos por consumo de sustancias ^12. TMS se entrega de forma no invasiva usando un headcoil externa para generar campos eléctricos en un objetivo particular del cerebro durante todos los días, tratamientos intermitentes. La reciente llegada de la bobina H o "profundo" TMS permite estructuras cerebrales más profundas para ser estimulados, además de sitios corticales, ampliando su uso potencial ^13,14. Ambos tratamientos se entregan de forma discontinua durante una serie de sesiones en un ambiente diferente al de uso primario de drogas y han demostrado ser prometedores en los dos ensayos en humanos y roedores para la dependencia de drogas ^13,15-17. La ventana para el tratamiento de pacientes dependientes de la metanfetamina probablemente será durante los períodos de sobriedad, como la rehabilitación impuesta judicialmente, no durante los atracones de calle cuando pueden experimentar un comportamiento violento o errática ^18. Como tal, el objetivo de este artículo es describir la entrega de estimulación eléctrica que es temporaly espacialmente separada de la entorno de uso de la droga, que se aproxima más estrechamente lo que es posible en los seres humanos, para el tratamiento de dependencia de la metanfetamina IV.

Protocolo

Todos los procedimientos son aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo LSUHSC Institucional y se llevaron a cabo de acuerdo con los NIH "Principios de cuidado de los animales de laboratorio."

1. Roedor Aclimatación y la restricción alimentaria

1. Usar ratas Wistar adultas que son 3 meses de edad en el inicio del experimento. Ratas Casa individualmente en jaulas equipadas con una unidad de flujo laminar y el filtro de aire en un centro de cuidado de los animales de la temperatura y humedad controladas, acreditado por AAALAC sobre un invertido luz de 12 h / oscuridad ciclo (luces apagadas a las 0600 horas).
2. Proporcionar agua y comida para roedores estándar libremente hasta que el peso corporal es de aproximadamente 380 a 400 g. Posteriormente, las ratas-restringir alimentos y mantener a 85 a 90% de sus pesos corporales-alimentación libre durante las sesiones experimentales para facilitar la adquisición y el mantenimiento de la respuesta a la metanfetamina.
3. Maneje roedores en la habitación jaula todos los días de la llegada en todo el experimentalsesiones con el fin de registrar el peso corporal y ajustar la asignación diaria de alimentos.
4. Una vez que se alcanzan pesos objetivo, se preparan para implantar quirúrgicamente cada rata con un catéter yugular mora crónica y electrodos estimulantes intracraneales.

2. vena yugular Cateterismo

1. Preparación del catéter
   1. Preparar una longitud de 13 cm de tubo de silastic con un diámetro interior de 0.012 x 0.025 ', crear una bola de silicona de 4 cm de un extremo de la tubería utilizando tubo de silicona extra y electrocauterio, y dejar secar al aire.
   2. Sumergir el otro extremo de la tubería en un disolvente a base de limoneno derivada de cítricos durante unos pocos minutos y dejar que se expanda. Conectar el tubo expandido a una guía de acero inoxidable cánula doblada en un ángulo recto.
   3. Anclar la base doblada de la guía de acero inoxidable cánula a un "cuadrado de malla biocompatible con cemento acrílico dental 1.
   4. Lave el catéter dentro y por fuera con etanol y finales destiladar. Inyectar aire a través del tubo para eliminar las gotas de líquido residual. Deje secar O / N.
2. Técnica estéril
   1. Realizar todas las cirugías en un quirófano animales dedicada utilizando técnicas quirúrgicas asépticas. Esterilizar los instrumentos e implantes utilizando un autoclave y se preparará un área estéril mediante la colocación de papel resistente al agua sobre la mesa o cubierta con una toalla estéril (s).
   2. Use guantes estériles y mantener todos los instrumentos, implantes y gasa quirúrgica en el área estéril durante el procedimiento. Limpie cada instrumento con un algodón con alcohol, seguido de 20 segundos en un esterilizador de cuentas entre los procedimientos que se llevan a cabo múltiples cirugías.
3. Anestesia
   1. Trate previamente ratas con atropina (sulfato) (0,04 mg / kg, SQ) seguido por pentobarbital (20 - 50 mg / kg, ip) para lograr la anestesia.
   2. Inyectar animales con suspensión de penicilina G procaína estéril (75.000 unidades, IM) y un agente analgésico (carprofeno, 5-10 mg / kg, sc o mer-oprofen, 2 - 5 mg / kg, sc) inmediatamente antes de la cirugía para disminuir las infecciones perioperatorias y dolor, respectivamente.
   3. Consultar la anestesia adecuada mediante la entrega de una pizca dedo del pie moderada para el animal y, si no se produce respuesta, a continuación, proceder. Aplicar lubricante ocular tanto a los ojos.
4. Sitio Quirúrgico Preparación
   1. Afeitarse un parche dorsal cm 2 x 2 en la espalda de la rata justo posterior a una línea que conecta los omóplatos. Afeitarse un parche 1 x 1 cm en la región ventral del cuello justo entre el hueso de la mandíbula y el esternón.
   2. Limpie las áreas afeitadas con almohadillas con alcohol, seguido de solución de betadine. Coloque rata en una toalla estéril y permitir que el betadine se seque antes de continuar.
5. Catéter de implantación
   1. Hacer una incisión paralela a una línea que conecta los omóplatos en la región medioescapular en la espalda con un cuchillo de 10 cuchillas. Utilice una pinza hemostática para separar la piel del tejido conectivo subyacente para crear un plano para lamalla de base de catéter. Regar el área con solución salina estéril y cubrir con una gasa estéril antes de encender la rata sobre su espalda.
   2. Haga una incisión diagonal entre el hueso de la mandíbula derecha y el esternón con un cuchillo de 10 cuchillas. Utilice una pinza hemostática para separar la piel del tejido conectivo subyacente para localizar la vena yugular. Nota: La vena yugular aparece blanco / plata y brillante y es mayor en las ratas machos que en las hembras.
   3. Coloque una espátula por debajo de la vena, atar una sutura de seda 4-0 suavemente alrededor de la parte superior (parte proximal) de la vena expuesta y empujar la vena de nuevo en el cuello.
   4. Separar los tejidos conectivos para crear un bolsillo superficial bajo la piel del cuello inferolateral pero por encima del músculo. Empuje un trocar esterilizada de la incisión en el cuello a la incisión medioescapular por un túnel detrás del brazo y hacia arriba. Ejecutar el catéter de la parte posterior del cuello mediante la inserción de una guía rígida de alambre hacia arriba a través del trocar desde el extremo del cuello y en el catéter distal. Tire de lael cable guía hacia atrás a través de la incisión en el cuello y el catéter distal unida seguirá.
   5. Aislar la vena yugular derecha sobre una espátula tirando hacia arriba de la sutura proximal colocado previamente. Utilice una bola tijeras para hacer un pequeño corte parcial en el lado superior de la vena.
   6. Inserte un fórceps curvos en la incisión vena para abrirlo. Mantener las pinzas aparte, pero en su lugar, pasar la punta del catéter en las puntas de las pinzas entre y dentro de la vena cerca de 2 - 3 cm de donde va a terminar fuera de la aurícula derecha.
   7. Asegure el catéter atando una sutura de seda 4-0 alrededor de la vena distal. Ate los extremos proximal y distal suturas juntos en un nudo "caja" para añadir estabilidad.
   8. Catéter Lavar con solución salina estéril heparinizada y retroceder de sangre para confirmar la implantación exitosa. Recorte las suturas 1 - 2 mm por encima de los nudos y meter el catéter proximal restante bajo la piel del cuello. cerrar con una sutura / método apropiado de su elección. Si no ABSORSe utilizan suturas bable o grapas, deben ser removidos en 10-14 días bajo anestesia general. Cubra la incisión con ungüento antibiótico usando un aplicador con punta de algodón estéril.
   9. Anclar el conjunto de catéter / cánula guía / malla distal al tejido volver subcutánea utilizando suturas absorbibles en dos de las esquinas opuestas de la base de malla. Cierre de la incisión hacia atrás alrededor de la cánula guía utilizando interrumpidas, suturas no absorbibles invertida. Cubra la incisión con ungüento antibiótico usando un aplicador con punta de algodón estéril.
6. Cuidado Postoperatorio
   1. Enjuague el catéter con solución salina estéril 0,9% heparinizada utilizando una jeringa de 3 ml y colocar un obturador en la cánula guía para evitar la obstrucción.
   2. Enjuague catéter de cada rata en una base diaria para mantener la permeabilidad.
   3. Inmediatamente después del procedimiento, coloque la rata en su jaula sobre una almohadilla térmica en el área quirúrgica y observar hasta que la conciencia y espontáneo movimiento de retorno.
   4. Volver a la rata recuperado a la sala de colonia y permitir cinco a siete días para pasar antes de la cirugía intracraneal. Pesar, manejar, y evaluar su estado general diaria, incluyendo la comprobación de la infección y la evaluación de los niveles de comportamiento animal, aspecto y actividad.
   5. Consulte con el veterinario Recursos Animales en caso de problemas y siga las pautas de tratamiento recomendadas. Inyectar animales con un agente analgésico (carprofeno, 5 - 10 mg / kg, sc o ketoprofeno, 2 - 5 mg / kg, sc) para tratar el dolor perioperatorio, según sea necesario.

3. Colocación de electrodos intracraneales

1. Preparación quirúrgica
   1. Realizar todas las cirugías en condiciones estériles, como se describe en el apartado 2.2.
2. Anestesia
   1. Coloque animal en una cámara de inducción de anestesia y proporcionar isoflurance flujo de gas en la cámara a 1.000 - 2.000 ml / min con el vaporizador fijado en 5%.
   2. Una vez que los animales es reclinada, retirar del cámara de unnd puesto en cono de la nariz en acolchada plataforma operativa estereotáctica. Cambie el flujo de gas desde la cámara al cono de la nariz y ejecutar de gas con vaporizador fijado en 2-3%.
   3. Ajuste vaporizador según sea necesario para mantener respiraciones estables y no respuesta a la estimulación durante la cirugía.
   4. Inyectar rata con penicilina G procaína suspensión estéril (75.000 unidades, im) y un agente analgésico (buprenorfina 0.05 a 0.5 mg / kg sc) inmediatamente antes de la cirugía para disminuir las infecciones perioperatorias y dolor, respectivamente.
   5. Consultar la anestesia adecuada mediante la entrega de una pizca dedo del pie moderada para el animal y, si no se produce respuesta, a continuación, proceder. Aplicar lubricante ocular tanto a los ojos.
3. Sitio Quirúrgico Preparación
   1. Afeitarse la parte superior de la cabeza de la rata y colocar la rata en los bares del oído para mantener su cabeza inmóvil durante el procedimiento. Limpie la zona afeitada con almohadillas con alcohol, seguido de solución de betadine. Deje que el betadine se seque antes de continuar.
4. Electrodo Implantación
   1. Sujete el cuero cabelludo entre y ligeramente anterior a las orejas con unas pinzas y usar las tijeras para cortar a través de la base. Este manuveur eliminará un área de 1,5 x 1 cm de piel sobre la mitad de cráneo.
   2. Use una hoja 10 para hacer una incisión circunferencial a través del pericráneo hasta el cráneo y unas pinzas curvas para raspar y quitar el pericráneo. Regar el área con solución salina estéril, aplique el exceso de sangre y solución salina con una gasa, y permitir que el cráneo se seque por completo por lo que las referencias óseas, incluyendo el bregma, se puede ver claramente.
   3. Para la cirugía bilateral, montar dos electrodos de platino-iridio bipolares, uno en cada porta-electrodos a cada lado de la plataforma operativa estereotáctica. Mueva el primer electrodo en posición de ~ 1 mm por encima del bregma y anote las coordenadas estereotáxica para el anterior-posterior (AP) y (ML) posiciones, que se mostrarán en la pantalla digital lateral medial. En realidad no toque la punta del electrodo al skull porque ya no el electrodo función. Repita este procedimiento para el otro electrodo.
   4. Calcular la AP final y ML coordenadas basa en la estructura diana de interés. Mueva el electrodo a esta posición con la punta justo por encima del cráneo para obtener el dorsoventral inicial (DV) de coordenadas en la pantalla digital. Calcular la profundidad DV final en base a la estructura diana de interés.
      Nota: El núcleo accumbens shell fue atacado en este ejemplo, dada su implicación conocida en la conducta consumatoria drogas ⁸ utilizando el siguiente estereotáxica coordenadas respecto al bregma:
      AP entrada de coordenadas = [visualizado digitalmente coordinar a bregma] + 1.6
      Entrada ML coordenada = [visualiza digitalmente coordinar al bregma] ± 2,4 para la derecha / izquierda
      Profundidad DV = [visualiza digitalmente coordinar a superficie del cráneo en la entrada AP / ML] - 8,5
   5. Marque la posición de entrada proyectada de cada electrodo sobre la superficie del cráneo con un ma permanenterker. No golpee ni toque la punta del electrodo durante esta maniobra.
   6. Utilice una fresa redonda recubierta bola de diamante para perforar un agujero de 1,4 mm en cada marca. Tenga cuidado de no hundir a través del cráneo en la bóveda intracraneal con el taladro de alta velocidad. Utilice un fórceps curvos para perforar la duramadre una vez que el cráneo se ha perforado de distancia.
   7. Utilice una fresa redonda de diamante recubierto pelota para perforar agujeros de 0,7 mm en otros cuatro lugares detrás de las entradas de electrodos para la colocación de tornillos cráneo. Utilice un destornillador manual para colocar cuatro tornillos de acero inoxidable 3.2 (longitud) 0,8 mm (diámetro) x en el cráneo, dos a cada lado de la línea media. Estrechamente asegurar estos tornillos hasta aproximadamente la mitad de su longitud en el cráneo, ya que son la principal infraestructura que sostenga la tapa craneal en el lugar durante las próximas semanas y meses.
   8. Inserte con cuidado el primer electrodo a través de su trepanado en el cerebro a la profundidad DV calculada girando manualmente el mando que gestiona la coordenada Z deel soporte del electrodo. Gire el mando a una velocidad aproximadamente igual a 1/2 de vuelta por segundo para evitar un daño injustificado a la punta del electrodo. Asegúrese de que la punta del electrodo no toque el borde óseo de la trepanado al entrar en el cerebro.
   9. Asegure el primer electrodo utilizando pegamento en capas sobre el trepanado y los tornillos posteriores, seguido de cemento dental. Una vez que esta construcción se ha secado por completo, retire el electrodo de su soporte. Repita la inserción y el proceso de cementación para el segundo electrodo. Aplique cemento dental hasta el borde de la piel, pero no se superponen con la piel porque esto afloja el tapón de cemento craneal a largo plazo.
5. Cuidado Postoperatorio
   1. Coloque dos tapas de polvo sobre los pedestales de los electrodos para evitar la obstrucción.
   2. Inmediatamente después del procedimiento, coloque la rata en su jaula sobre una almohadilla térmica en el área quirúrgica y observar hasta que la conciencia y espontáneo movimiento de retorno.
   3. Volver a la rata recuperado a the sala de colonia y permiten cinco días que pasar antes de comenzar el experimento. Pesar, manejar, y evaluar el estado general de las ratas diariamente, incluyendo la comprobación de la infección y la evaluación de los niveles de comportamiento animal, aspecto y actividad.
   4. Consulte con el veterinario Recursos Animales en caso de problemas y siga las pautas de tratamiento recomendadas. Inyectar animales con un agente analgésico (buprenorfina 0.05 a 1 mg / kg sc) para tratar el dolor perioperatorio, según sea necesario. Hemorragia intracraneal puede ser más frecuente con el uso de medicamentos para el dolor no esteroideos (carprofeno, 5-10 mg / kg, sc o ketoprofeno, 2-5 mg / kg, sc) a fin de utilizar la buprenorfina perioperatorio de cirugía intracraneal.

4. Aparato operante

1. Utilice plástico y acero inoxidable cámaras de acondicionamiento operante contenida dentro de los recintos de atenuación de sonido para ejecutar los experimentos de comportamiento.
2. Equipa cada recinto con un extractor de aire para suministrar ventilación y noi blancosí para enmascarar los sonidos extraños.
3. Utilice un ordenador personal y un sistema de interfaz de software de comportamiento para programar los procedimientos y recoger los datos experimentales.
4. Configuración general
   1. Equipar cada cámara experimental con dos palancas de respuesta montados en una pared de la cámara con una luz de estímulo situado por encima de cada palanca. Designar una de las palancas de la palanca "activa" para que el resultado es una consecuencia programada cuando se presiona.
   2. Programar una luz estímulo situada justo encima de la palanca de respuesta activa para iluminar durante cada sesión operante, lo que indica la disponibilidad de drogas.
   3. Tener una respuesta en el resultado palanca activa en una entrega de infusión de metanfetamina (0,05 mg / kg / infusión en 100 l NaCl al 0,9%) durante 2,8 seg acompañado por la luz de la casa en la pared opuesta sucediendo durante 5 segundos y la luz de estímulo va OFF durante un tiempo muerto de 30 segundos.
   4. Cuente las respuestas en la palanca activa pero no deben tener conse programadaconsecuencias durante el período de tiempo de espera de 30 segundos. Para finalizar, las respuestas en la palanca inactiva pero no debería tener consecuencias programadas.

5. intravenosa (IV) La metanfetamina Auto-Administración Procedimiento

1. Preparativos generales
   1. Cargar ratas en las cámaras operantes tan rápida y tranquilamente como sea posible para minimizar los artefactos de comportamiento. Adjuntar una correa resorte de acero inoxidable a la cánula guía en la espalda del roedor y un eslabón giratorio de fluido a prueba de fugas suspendida encima de la cámara operante.
   2. Asegurar la integridad de la tubería de conexión de la pieza giratoria a la jeringa de drogas 20 ml en una bomba accionada por motor situado fuera del recinto de atenuación de sonido. Para ello, empuje el tubo de conexión de plástico al menos ¼ de pulgada en la punta giratoria de metal y la punta de la aguja de la jeringa de drogas hasta que no se deslice con tracción moderada. Counter-equilibrar el montaje giratorio y la correa para permitir el m relativamente sin restriccionesovement del animal.
   3. Realizar sesiones operantes aproximadamente a la misma hora todos los días de lunes a viernes.
2. Adquisición
   1. Con el fin de facilitar la rápida adquisición de metanfetamina IV autoadministración, las ratas se ejecutan en sesiones diarias de 6 h durante cuatro a cinco días consecutivos.
   2. Llevar a cabo estas sesiones en una relación fija cronograma FR-1 + 30 seg de reinforcementduring el que las ratas reciben una perfusión de metanfetamina IV para cada presión en la palanca activa seguido de un 30 seg de tiempo de espera (por ejemplo, no hay señal o la recompensa se ​​producen consecuencias presionando de cualquiera de las palancas). Nota: Este acceso prolongado e inicial "fácil" se traducirá en la mayoría de los roedores que adquieren la droga significativa teniendo un comportamiento en menos de o igual a una semana (Figura 3).
3. Mantenimiento
   1. Durante la segunda semana de entrenamiento, las ratas correr en sesiones diarias de 2 h de lunes a viernes para mantener y perfeccionar metam IVautoadministración anfetamina.
   2. Sesiones de Conducta en una relación fija FR-1 + 30 seg horario de tiempo de espera de refuerzos.
   3. Documento estable, intenso responder cuando el número total de presentaciones de metanfetamina a través de cada sesión varía menos de 10% durante tres sesiones consecutivas (Figura 4) y el número acumulado de infusiones a través de la primera 30-min es mayor que el número acumulado de infusiones durante la segundo 30-min (Figura 5). Nota: Este criterio asegura que las ratas desarrollan un patrón de carga del fármaco al principio de la sesión que indica la conducta adictiva ¹⁹ y el uso no simplemente casual.
4. Post-Sesión
   1. Al final de cada sesión, desconecte la correa de la parte posterior del roedor. Lave el catéter con 0,1 ml de solución salina al 0,9% que contiene 800 UI de estreptoquinasa para prevenir los coágulos sanguíneos. Inserte un obturador en cada cánula guía para evitar la obstrucción antes de devolver el rats a las jaulas.
   2. Prueba de la permeabilidad de los catéteres inmediatamente después del final de cada sesión experimental los miércoles durante todo el curso del experimento.
      1. Preparar una jeringa de 3 cc, con una aguja de 22 G, que contiene solución salina heparinizada bacteriostática para probar la permeabilidad del catéter. Conecte un extremo de un pedazo largo de 4 a 6 pulgadas de tubo de plástico de la aguja y el otro extremo al poste metálico del conjunto de catéter-cánula sobre el lomo del animal.
      2. Infundir 0,1 a 0,2 ml de solución salina para asegurar un flujo claro y tire del émbolo de la jeringa hacia atrás. Si el catéter es patente, lo que debería tanto al ras con facilidad y retroceder en la sangre que será visible en el tubo. Soltar el émbolo y infundir otros 0,2 ml para eliminar toda la sangre a través del catéter.
      3. Si la sangre no se puede retirar, luego retire la jeringa de 3 cc y el tubo del poste de metal.
      4. Preparar una jeringa de 1 cc, con una aguja de 22 G, que contiene sodio metohexital, una acción rápidaanestésico, a una mayor permeabilidad del catéter prueba. Conecte un extremo de un pedazo largo de 4 a 6 pulgadas de tubo de plástico de la aguja y el otro extremo al poste metálico del conjunto de catéter-cánula sobre el lomo del animal.
      5. Infundir 1,5 mg y rápidamente retirar la jeringa de 1 cc y el tubo del poste de metal en el lomo del animal. Vuelva a conectar la jeringa de 3 cc llena con solución salina heparinizada bacteriostática e infundir 0.1 - 0.2 ml. Si el animal pierde el tono muscular a menos de 3 segundos, a continuación, el catéter es patente y funcional.
5. Ver el Archivo Suplementario "Errores Comunes" para una sección trampas que aborda las reacciones adversas a la metanfetamina, la falta de adquisición metanfetamina auto-administración, y la dificultad de extracción de rata.

6. Estimulación Cerebral Aparato

1. Utilice 10 a 12 cajas de plexiglás (12 x 18 x 18 in) (An) para ejecutar los experimentos de DBS. Cubra cada caja en el exterior con opaca tiesoel papel que cubre la parte posterior y los lados de la caja para evitar que las ratas puedan ver o interactuar con los demás. Deje el panel frontal clara al descubierto lo que el examinador puede ver los animales durante las sesiones de estimulación.
2. Cubrir la parte superior de las cajas con un panel semi-permeable que evita que las ratas se escape al tiempo que permite el flujo de aire. Utilice este panel para apoyar los conmutadores que se encuentran por encima de cada caja para facilitar la conexión eléctrica entre el casquillo de la cabeza de roedores y el sistema de estimulación.
3. Utilice un sistema de estimulación que puede entregar corriente constante a varios animales simultáneas para los experimentos de DBS. Utilice un sistema que consiste en una interfaz programable de señal digital de procesador / comunicaciones del usuario, un estimulador, un paquete de baterías estimulador, una caja de distribución de canales, y el software que lo acompaña (Ver Hoja de Materiales).
4. Utilice cables de medida de longitud para conectar puertos del canal del estimulador al pedestal electrónica superiores de cada commutato. Nota: La longitud necesaria dependerá de cada laboratorio. Estos cables se encuentran fuera de la zona de los animales y no tienen que ser cubiertos en la primavera de acero inoxidable.
5. Conecte el pedestal electrónica inferior del colector al pedestal electrodo implantado en la tapa de la cabeza del roedor usando 16-en los cables cubiertos de resorte de acero inoxidable. Asegúrese de que los cables son lo suficientemente largos para permitir la libre circulación de todas las áreas del recinto sin tensión significativa en la tapa de la cabeza. Nota: Un cable que termina más o menos donde la cabeza de la rata sería al estar de pie en los cuatro pies suele ser adecuada.
6. Estimulación Cerebral Programación
   1. Utilice un ordenador y la programación de software personal para programar los parámetros de estimulación (por ejemplo, la forma de onda, frecuencia, ancho de pulso, retardo entre estímulos, la amplitud de corriente) y recoger los datos experimentales.
   2. El uso de un lenguaje de programación visual, especificó que funciona cada dispositivo llevará a cabo para satisfacer las expepuntos finales mentales y que los datos se almacenan y / o proyectadas para la visualización en tiempo real. Los comandos que se ejecutan este proyecto en particular se demuestran en la Figura 1.
   3. Especificar la frecuencia deseada, ancho de pulso, y la amplitud en el panel de control visual (Figura 2) antes del inicio del experimento. Los parámetros típicos para la estimulación de alta frecuencia en las ratas son similares a los utilizados en la estimulación profunda del cerebro humano clínico: frecuencia de 130 Hz to180, ancho de pulso de 60 a 90 mseg, y la amplitud de corriente de 100-250 mu ^4,8-10. Nota: Un menor corriente se utiliza en los roedores debido a su reducido tamaño en comparación con el de los primates.

7. Procedimiento de Estimulación Cerebral Profunda

1. Para cargar las ratas en las cajas, conecte el cable de resorte de acero inoxidable desde el colector a cada pedestal electrodo en la tapa de la cabeza. Prueba de la impedancia de cada electrodo mediante la ejecución de 5 mu de corriente a una frecuenciade 1000 Hz durante 2 seg.
   1. Si la impedancia es igual o inferior a 125 KOhm, a continuación, proceder con el experimento debido a que el electrodo es capaz de entregar la estimulación terapéutica. Si la impedancia es mayor que 125 KOhm, considerar la eliminación del animal a partir del experimento porque la alta resistencia del electrodo puede truncar la corriente a niveles potencialmente sub-terapéuticas.
2. Ejecute las ratas a través de una o dos sesiones simuladas de habituación durante el cual se adjuntan al cable (s) de electrodo, pero no recibir ningún tratamiento activo. Pruebas Mock eliminará cualquier efectos en el comportamiento no específicos. Inmediatamente después de cada sesión de simulacro, el transporte de las ratas a las cajas operantes para el diario de sesiones de 2 horas de metanfetamina IV autoadministración.
3. Ratas contra el equilibrio en dos grupos, una estimulación activa y una cohorte simulada estimulación para que el consumo de drogas de base no es significativamente diferente entre los grupos.
4. Realizar sesión diaria DBSs en la cohorte de roedores durante 5 días durante los cuales reciben ya sea activa la estimulación eléctrica del cerebro o sin estimulación durante 3 horas dependiendo de su asignación a los grupos. Inmediatamente después de cada sesión de DBS, ratas de transporte a las cajas operantes para el diario de sesiones de 2 horas de metanfetamina IV autoadministración.
   1. Observar animales cuidadosamente durante al menos una parte de cada sesión de DBS para asegurarse de que la estimulación no está causando alteraciones claras en el comportamiento animal. Si se producen conductas anormales durante / después de la estimulación, tenga cuidado para documentar estas observaciones. Nota: Los autores no han observado alteraciones o cambios en la ingesta de alimentos / agua de comportamiento significativos durante el experimento descrito en este artículo.
5. Alterar la duración del tratamiento DBS, los parámetros eléctricos, y el tiempo entre la sesión de DBS y la sesión operante como sea necesario dependiendo de la hipótesis.

Resultados

Después de la colocación de un catéter yugular IV y electrodos de DBS intracraneales, los roedores pueden ser entrenados con éxito para autoadministrarse metanfetamina IV después de un breve período de recuperación. La Figura 3 muestra que las ratas se adquieran y escalar metanfetamina autoadministración después de 2 días de extendido el acceso a fármaco con un promedio de 168 ± 12 infusiones por sesión por día 4.

Las ratas se mueven entonces a un horario de 2 horas al día de entrenamiento operante por dos razones: 1) para prevenir la toxicidad metanfetamina y alteraciones graves de conducta con el acceso persistente, prolongado y 2) para establecer una tasa relativamente estable de la respuesta que puede ser manipulado por diversos intervenciones terapéuticas. La Figura 4 muestra que el número medio de infusiones totales por sesión de acceso corta más de la segunda semana es 75 ± 8 y varía generalmente por menos de 10% del día a día. Figura 5 demuestra que las ratas develop una mayor motivación para tomar la droga, como se muestra por la aparición de un patrón de "carga frontal" de la ingesta por día 6 de la formación, en comparación con el día 1. Una vez que esto se desarrolla, el efecto se mantiene en gran medida durante las sesiones posteriores (datos no mostrados) .

Figura 6 muestra que DBS bilateral entregado en el medio ambiente no farmacológico dado lugar a una marcada disminución de la metanfetamina operante IV auto-administración en tres de cinco días en comparación con el grupo de tratamiento simulado estimulado. El núcleo accumbens shell fue blanco dada su implicación conocida en la conducta consumatoria drogas ⁸ utilizando el siguiente estereotáxica coordenadas respecto al bregma (AP + 1.6, DV - 8,5, ML ± 2,4). Parámetros de estimulación y la duración se basa libremente en la experiencia previa publicada con DBS para el tratamiento de la enfermedad psiquiátrica ^8,20,21 pero se pueden ajustar en función de las necesidades del experimentador. Las barras de error son moderados y no todos los días reaimportancia ch indicando el rango de respuestas que se pueden ver en las evaluaciones de comportamiento a pesar de un efecto del tratamiento clara. Aumentar el número de ratas por experimento puede ayudar a compensar esta variabilidad natural. 11 animales fueron utilizados inicialmente para este experimento. Un animal fue sacrificado por la mala alimentación después de la operación, se excluyó un animal debido a las convulsiones, y un animal fue excluido debido a la DBS electrodo mal funcionamiento que nos deja con un total de 8 animales (N = 4 Sham; N = 4 DBS activo). En general a partir de aproximadamente 10 - 12 ratas para cada experimento permitirá su finalización con éxito.

Figura 1. Visual Programming Language. El investigador utiliza un lenguaje de programación visual, como el ejemplo que se muestra aquí, para diseñar un programa que puede ofrecer la estimulación cerebral a múltiples ánimals simultáneamente en los parámetros introducidos por el usuario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Panel de Control Visual. Antes del comienzo del experimento, el investigador especifica la frecuencia deseada, ancho de pulso, y la amplitud en el lado izquierdo de un panel de control visual. Aquí parámetros de estimulación son: intensidad de corriente de 200 mu; Ancho de pulso de 61 ms; frecuencia de pulso 130 Hz. Una vez iniciada la estimulación, la forma de onda para el suministro de corriente activa se muestra a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Adquisición de IV metanfetamina Auto-Administración. Operante total responder de datos (360 min) se analizaron mediante un ANOVA de medidas repetidas con la sesión diaria definida como la medida repetida. Todos los análisis que eran p <0,05 se consideraron significativos. Los datos son la media ± error estándar. Total de infusiones de metanfetamina durante las sesiones diarias operantes 6-hr durante los primeros cuatro días de entrenamiento operante. + P <0,05 en comparación con las sesiones 1 y 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 4.Datos de mantenimiento de la IV metanfetamina Auto-Administración. Operantes total responder (120 min) se analizaron mediante un ANOVA de medidas repetidas con la sesión diaria definida como la medida repetida. Todos los análisis que eran p <0,05 se consideraron significativos. Los datos son la media ± error estándar. Total de infusiones de metanfetamina durante las sesiones diarias operante de 2 horas más de la segunda semana de entrenamiento operante, lo que demuestra el consumo de drogas comportamiento estable pero intenso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Desarrollo de la motivación para tomar la droga. Operante que respondieron se sumó cada 15 minutos durante la primera hora y se analizaron los datos utilizando una repetida-measures ANOVA con cada cuadrante 15-min se define como la medida repetida. Todos los análisis que eran p <0,05 se consideraron significativos. Los datos son la media ± error estándar. Un patrón de "carga frontal" no está presente en el día 1 del entrenamiento operante sino que se desarrolla en la segunda semana, lo que indica una fuerte motivación para tomar drogas. + P <0,05 en comparación con el 30, 45 y 60 min, ++ P <0,05 en comparación con los 45 y 60 minutos, +++ P <0,05 en comparación con los 60 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Efectos de DBS en IV metanfetamina Auto-Administración. Operante total responder en la primera hora de datos (60 min) se analizaron mediante un ANOVA mixto con un between la variable objeto de tratamiento (DBS vs Sham) y una medida repetida de sesión diaria. Todos los análisis que eran p <0,05 se consideraron significativos. Los datos son la media ± error estándar. Estimulación cerebral profunda pre-operante Bilateral redujo significativamente el número de infusiones de metanfetamina sobre el primero 60 min de operante de responder en días de tratamiento 3, 4 y 7. + P <0,05 en comparación con el grupo de tratamiento simulado y la línea de base de responder. Respondiendo regresado a los niveles basales después del tratamiento diario terminado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Aunque los mecanismos exactos de la estimulación cerebral profunda no se caracterizaron completamente, la eficacia DBS tanto para el motor y los trastornos psiquiátricos puede resultar de una interacción dinámica entre la terapia eléctrica y el funcionamiento de varias regiones del cerebro subcortical y cortical con el tiempo ^6,22-26. Mientras que los métodos no contingentes de entrega metanfetamina a roedores están bien ^{descritos-27,28,} estos métodos son los más apropiados para las investigaciones discretas de farmacocinética de drogas y efectos neuroquímicos ^27-29. Operante autoadministración de drogas IV, mediante la incorporación de un elemento de motivación para las drogas, es ideal para el estudio de cómo las terapias eléctricas como DBS interactúan con comportamientos patológicos en el tiempo. Los procedimientos que describimos examinan los efectos de DBS en un entorno en el uso de metanfetamina contingente en un entorno diferente.

Hay tres pasos clave en nuestra metanfetamina IV auto-administparadigma de la ración: 1) La inducción de la adquisición rápida y la escalada de la ingesta de drogas durante las sesiones de acceso largas, 2) El mantenimiento de una alta tasa estable del consumo de drogas durante las sesiones de acceso corta posteriores y 3) Desarrollo de un modelo de carga frontal de consumo de drogas. Este paradigma se puede lograr en un 2 a 3 semanas plazo con 10 - 12 ratas por experimento, que es tanto rentable y ideal para probar los efectos de DBS dado la vida útil potencialmente limitado de tapas de cabeza en roedores utilizando psicoestimulantes. Este procedimiento, al igual que otros paradigmas que incorporan un período de tiempo de acceso ^19,30,31 simula razonablemente algunos aspectos de los trastornos por consumo de sustancias; que demuestra tanto la escalada de uso y alta motivación para obtener droga con principios de sesión "de carga de drogas", que son aspectos importantes de la dependencia humana frente al uso recreativo ^19,30. Los roedores que tienen acceso a largo exposición a la metanfetamina IV también demuestran déficits cognitivos ³², Respuestas distintas a tratamiento farmacológico ^{33, 34 y} farmacocinética neuroquímico cambia ³⁵ que son más similares a los seres humanos que sufren de trastorno crónico consumo de metanfetamina que los roedores con una exposición única de acceso corto.

Del mismo modo hay tres pasos clave en nuestro profundo procedimiento de estimulación cerebral: 1) La habituación al medio ambiente DBS, incluyendo la conexión de sujeción de cabeza, por una o dos sesiones "falsas", 2) Daily, entrega intermitente de estimulación activa utilizando un sistema comercial, y 3) la desconexión DBS y el transporte posterior a la configuración de drogas. Este paradigma está diseñado para imitar el proceso de terapias no invasivas como TMS en lugar de la de DBS continua tradicional. Totalmente implantado, sistemas DBS programables como los utilizados para los trastornos del movimiento común ^{3 será} marginalmente factible en pacientes que sufren de la dependencia psico-estimulante por varias razones antes mencionadas. Intermittent estrategias de tratamiento eléctricas que no implican cirugía de alto riesgo y la atención posterior, como la EMT, puede ser mejor adaptadas a esta población de pacientes. Los métodos que hemos descrito permitirá a los investigadores a desarrollar y refinar las estrategias de tratamiento que pueden modificar el comportamiento relacionado con las drogas cuando se esté suministrando fuera del entorno de drogas en un plazo de tiempo limitado. Hay pruebas de que la estimulación eléctrica intracraneal transitoria que sigue el modelo de los déficits neurofisiológicos específicos ²³ o combinado con farmacoterapia sistémica ³⁶ ejercen duraderos efectos positivos en los comportamientos psiquiátricos y relacionados con las drogas durante varias semanas después de que el tratamiento ha cesado.

Las necesidades de la técnica quirúrgica excelente inicial y para el cuidado continuo de múltiples sitios quirúrgicos durante intensa del consumo de drogas son las principales limitaciones de esta metodología. Si bien el catéter IV o los electrodos de DBS se convierten en no operativa y / o infectadas, la rata debesalir del estudio. Catéter yugular y electrodos intracraneales colocaciones bajo estricta técnica estéril se aprenden mejor de los investigadores con experiencia antes de iniciar estos procedimientos de forma independiente.

Este procedimiento es susceptible de varias modificaciones y futuras investigaciones, incluyendo el examen de:. 1) parámetros alternativos de estimulación (por ejemplo, - forma de onda de estimulación, ancho de pulso, frecuencia, amplitud), 2) otros objetivos potenciales cerebrales terapéuticos (por ejemplo, - núcleo accumbens. núcleo, medial prefrontal cortex, mesencéfalo, habénula), 3) diferentes patrones de entrega DBS (por ejemplo, -. la entrega diaria DBS, entrega semanal DBS, DBS en varios intervalos anteriores a sesiones operantes, DBS antes de la adquisición), y, tal vez más interesantes, 4) combinaciones de corta duración DBS y agentes farmacéuticos que imitan la estimulación optogenética de vías selectivas y ejercen perdurable modificaciones conductuales ^36.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rodent operant chambers	Med Associates, Inc	ENV-008CT	Med Associates Inc. PO Box 319 St. Albans, Vermont 05478 USA Phone: (802) 527-2343
Kopf Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Kopf Instruments	Model 940	Kopf Phone: 1-877-352-3275 Fax: 1-818-352-3275 Email: sales@kopfinstruments.net
Z-Series 3-DSP Bioamp Processor	Tucker Davis Technologies	RZ5D	Tucker-Davis Technologies 11930 Research Circle Alachua, FL 32615 USA Ph: 386-462-9622 www.tdt.com
Z-Series 32-Channel Stimulator	Tucker Davis Technologies	IZ2-32	Software is accompanied by a manual that discusses how to program experiments using the OpenEx platform, which can be accessed here: http://www.tdt.com/files/manuals/OpenEx_User_Guide.pdf
48 Volt LI-ION Battery Pack for IZ2 Stimulator	Tucker Davis Technologies	LZ48-200
32-Channel Splitter Box for PZ5	Tucker Davis Technologies	S-BOX_PZ5
OpenEx Ext Software Package for Multi-Channel Neural Recording	Tucker Davis Technologies	OpenEx
Platinum-iridium stimulating electrodes	Plastics One Inc	MS303/8-B/SPC ELECT PT 2C TW .005"	Plastics One Inc P.O.Box 21465, S.W. Roanoke, VA 24018, PH 540-772-7950
2-channel cables between stimulator and commutator	Plastics One Inc	305-441/2 W/ Spring
2-channel cables between commutator and electrode pedestal	Plastics One Inc	305-305 W/ Spring
4-channel commutators	Plastics One Inc	SL2+2C and SL2+SC/SB