Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

Resumen

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Resumen

Los cultivos organotípicos permiten la reconstitución de un entorno 3D crítico para contacto célula-célula y célula-matriz interacciones que imita la función y la fisiología de sus homólogos de tejidos in vivo. Esto se ejemplifica con cultivos de piel organotípicos que recapitula fielmente la diferenciación epidérmica y el programa de la estratificación. Queratinocitos epidérmicos humanos primarios son genéticamente manipulable mediante retrovirus donde los genes pueden ser fácilmente sobreexpresan o derribados. Estos queratinocitos modificados genéticamente se pueden utilizar para regenerar la epidermis humana en cultivos de piel organotípicos proporcionan un poderoso modelo para estudiar vías genéticas de crecimiento epidérmico de impacto, la diferenciación y la progresión de la enfermedad. Los protocolos presentados aquí describen métodos para preparar dermis humana desvitalizados, así como para manipular genéticamente los queratinocitos humanos primarios a fin de generar cultivos de piel organotípicos. La piel humana regenerada se puede utilizar en downstream aplicaciones tales como perfiles de expresión génica, la inmunotinción y inmunoprecipitaciones cromatina seguido de secuenciación de alto rendimiento. Por lo tanto, la generación de estos cultivos de piel organotípicos modificados genéticamente permitirá la determinación de los genes que son críticos para el mantenimiento de la homeostasis de la piel.

Introducción

La epidermis humana es un epitelio estratificado que se conecta a la dermis subyacente a través de una matriz extracelular conocida como la epidermis terraza, plancha membrana basal no sólo sirve como una barrera impermeable para evitar la pérdida de humedad, sino también como una primera línea de defensa para proteger la cuerpo de sustancias extrañas y tóxicos ^1. La capa basal, que es la capa más profunda de la epidermis, contiene las células madre epidérmicas y progenitoras que dan lugar a la progenie diferenciada que forman el resto de la epidermis ^2. Como las células progenitoras se diferencian epidérmicas que migran hacia arriba para formar la primera capa de células diferenciadas conocida como la capa espinosa ^3. En la capa espinosa, las células se convierten en la expresión de las queratinas 1 y 10, que a continuación proporciona la fuerza para soportar el estrés físico para las capas diferenciadas de la epidermis. Como las células de la capa espinosas diferenciar aún más, se mueven hacia arriba en la epidermis a FORm la capa granular, que se caracteriza por la formación de gránulos de queratohialina y laminares, así como proteínas estructurales que se ensamblan por debajo de la membrana plasmática. Como las células proceden en el proceso de diferenciación, las proteínas por debajo de la membrana plasmática son cruz vinculadas entre sí, mientras que los gránulos lamelares son extruidos a partir de las células para formar un lípido barrera rica llama el estrato córneo ^4.

Enfermedades que implican alteraciones en crecimiento epidérmico y el impacto diferenciación ~ 20% de la población ^5. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de este proceso es de gran importancia. Desde manifestación de muchas de estas enfermedades está supeditada a la célula-célula o célula-matriz de contacto, cultivos organotípicos donde la epidermis humana se reconstituye en un entorno 3D se han creado ^6-10. Estos métodos implican típicamente el uso de queratinocitos primarios o transformadas sembradas sobre la matriz extracelular tales como humano desvitalizadodermis, Matrigel, o colágeno.

Para entender los mecanismos de regulación de genes que son importantes en crecimiento epidérmico y la diferenciación, los queratinocitos se pueden manipular genéticamente a través de vectores retrovirales para derribar o sobreexpresar genes en cultivo 2D y luego reconstituirse en 3D. Estos métodos se han utilizado ampliamente para caracterizar genes implicados en la madre epidérmicas y células progenitoras auto-renovación y diferenciación, así como la progresión a neoplasia ^11-21. Aquí, se proporciona un protocolo en profundidad sobre cómo alterar la expresión de genes en cultivos organotípicos epidérmicas a través del uso de los retrovirus.

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Protocolo

El protocolo de la piel humana se realizó de acuerdo con las directrices de la Universidad de California, Comité de Ética de Investigación de San Diego. La piel humana se puede obtener a partir de muestras quirúrgicas desechadas o comprado a los bancos de la piel (banco de piel aparece en la Tabla de materiales / Equipo). La ubicación donde la piel se deriva de o la edad del donante no es crítico para el experimento, siempre y cuando las proteínas de la membrana basal (colágeno / laminina) en la dermis no se degradan.

1. Preparación de desvitalizados Dermis Humanos

1. Tras la recepción de la piel humana, colocar el tejido en la campana de cultivo de tejido para descongelar (~ 3-5 min). Dependiendo del tamaño de la piel, colocar el tejido descongelado en un tubo estéril desechable de 50 ml o 125 ml cónica botella. El tamaño típico de la piel desde el banco de piel es de 0,75 pies cuadrados.
2. Llene el recipiente de 75% de su capacidad con penicilina y estreptomicina 4x (penicilina / estreptomicina) en 1x PBS. Agitar vigorosamente durante5 min y deseche el líquido. Repita este paso 3 veces más.
3. Después del último lavado, transferir el tejido a un nuevo tubo / botella y añadir 4x fresco pen / strep / PBS para llenar 75% del contenedor. Incubar esta mezcla en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C durante 2 semanas para permitir la separación de la dermis de la epidermis.
4. En condiciones estériles, el uso de fórceps para despegar la epidermis de la dermis. La dermis es completamente blanco, mientras que la epidermis tendrán coloración en función de la carrera del donante (Figura 1A). Deseche la epidermis, según el protocolo de la institución para hacer frente a los tejidos humanos.
5. Coloque la dermis en un tubo o botella y lavarlo en 4x pen / strep diluido en PBS 1x con agitación vigorosa (5 min lavados por 4 veces). Después del último lavado, transferir la dermis a un nuevo tubo / botella en 4x pen / strep diluido en PBS 1x y se almacena a 4 ° C hasta su utilización. Dermis pueden almacenarse a 4 ° C durante un máximo de un año.

2. Modificar genéticamente primaria queratinocitos humanos

NOTA: Use las células phoenix anfotrópicos cultivadas en medio DMEM completo [DMEM + 10% de suero bovino fetal (FBS) + penicilina / estreptomicina] para producir virus para infectar los queratinocitos humanos primarios. Genes de empaquetamiento virales que codifican proteínas tales como gag-pol y el sobre se integran de manera estable en el genoma de la célula phoenix que permite la producción de virus cuando se transfecta con un vector retroviral. Células Phoenix se pueden transfectar con una alta eficiencia permitiendo para alta producción de título viral. Virus producido a partir de esta línea de envasado también puede infectar una gran variedad de células de mamífero incluyendo humanos.

1. Día 1: El día antes de la transfección, las células Phoenix semillas en una placa de 6 pocillos a una densidad de 800.000 células por pocillo en medio DMEM completo.
2. Día 2: El día de la transfección, utilice 3 g de vectores retrovirales por pocillo. Alícuota 3 g de vector retroviral en un tubo de 1,5 ml. Use una mezcla de 100 μ; l DMEM más de 6 l de reactivo de transfección por cada 3 g de vector. Mezclar 6 l de reactivo de transfección con 100 l DMEM en un tubo de 1,5 ml. (Los vectores retrovirales que se utilizan se enumeran en la tabla de equipos / materiales).
   1. Incubar durante 5 min y añadir la mezcla de 106 l en el tubo de pre-alícuota que contiene el 3 g de vector retroviral. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Añadir gota a gota toda esta mezcla a cada pocillo de las células Phoenix.
3. Día 3: El día después de la transfección, retire el medio de las células Phoenix y añadir 2 ml de medio DMEM fresca completa. El mismo día, la semilla queratinocitos humanos primarios en placas de 6 pocillos a una densidad de 75.000 células por pocillo. Mantener los queratinocitos en un medio de suero de queratinocitos libre (KCSFM) con antibióticos (penicilina / estreptomicina).
   NOTA: los queratinocitos humanos primarios fueron adquiridos. Las células se pueden comprar en una variedad de proveedores (que aparece en la tabla de materiales / Equipo).
4. Día 4: Harconferir los medios de comunicación de las células transfectadas phoenix, que ahora contiene partículas virales. Pase los medios de comunicación a través de un filtro de 0,45 micras con una jeringa (para eliminar cualquier célula phoenix contaminantes) y coloque 2 ml en los queratinocitos (chapados a 75.000 células / pocillo el día anterior: véase el paso 2.3). Añadir bromuro de hexadimetrina (5 g / ml) a los medios para ayudar a mediar en el proceso de infección. Los títulos virales son ~ 1 x 10 ⁷ TU / ml.
   1. Haga girar las placas de 6 pocillos en una centrifugadora a 200 xg durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la escisión, retire el soporte que contiene el virus y lavar las células una vez con PBS 1x antes de añadir KCSFM.
5. Día 5: infectar el mismo lote de queratinocitos de nuevo como en el paso 2.4.
   NOTA: Seleccionar los queratinocitos utilizando un fármaco si hay un marcador seleccionable en el vector retroviral y expandir para su uso en análisis de aguas abajo o aplicaciones tales como cultivos organotípicos.

3. Configuración de las Culturas de la piel organotípicos

1. Construir elcasete organotípico a partir de materiales comunes que se encuentran en el laboratorio o las cintas puede ser por encargo a través de un taller de fabricación de metal (Figura 2 A - F). Para hacer estos cassettes de una placa de cultivo tisular 3,5 cm, utilizar un cauterio para eliminar un cuadrado de 1,0 cm x 1,0 cm desde el centro de la tapa de una placa de 3,5 cm (Figura 2A-B). Haga esto en condiciones estériles.
   1. Adjuntar clavijas cuadradas a la parte inferior de la casete (tapa de 3,5 cm plato) usando esmalte de uñas transparente (Figura 2C). Permitir 5 min para el esmalte de uñas se seque y voltear la casete de manera que está descansando sobre las clavijas cuadradas (Figura 2D). Coloque el casete en un plato de 6 cm.
      NOTA: Plaza clavijas se pueden comprar en una variedad de tiendas de artesanías.
2. Preparar medio de crecimiento de queratinocitos (KGM) compuesta de 66% de DMEM, 22% F12 de Ham, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 10% de FBS, 2,67 g / ml adenina, 40 ng / ml de hidrocortisona, 10 la toxina del cólera ng / ml, 4,94 mg / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina, 1,36 ng / ml triyodo-L-tironina, 10 ng / ml EGF, y 10 mg / ml de hidrocloruro de ciprofloxacino. Filtra los medios de comunicación a través de un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C hasta su utilización.
3. Tome la dermis de la solución PBS 4x penicilina / estreptomicina + y lavar 2 veces en KGM y luego incubar en KGM a 37 ° C durante dos días antes de su uso.
4. Cortar la dermis utilizando un bisturí para 1,5 cm x 1,5 cm trozos de tamaño y luego se coloca en el cassette organotípico. Coloque la dermis con la parte superior de la dermis hacia arriba. La parte superior de la dermis será el lado que entra en contacto con los queratinocitos (Figura 1B).
5. Coloque la dermis pre-cortadas en el orificio cuadrado de la casete organotípicos con el lado superior de la dermis hacia arriba (Figura 3A).
6. Voltear todo el casete organotípico contiene la dermis sobre el uso de fórceps (Figura 3B). Descongele la solución de la matriz extracelular en el hielo. Use una aguja y una jeringa para extraer 100 l de solución de matriz extracelular por casete. Añadir 5 gotas a la parte inferior de la dermis (lado brillante) y agitar ligeramente para asegurar una distribución uniforme por toda la dermis (Figura 3B).
7. Permitir a 5 min de la solución comercial matriz extracelular para solidificar completamente (Figura 3C). Después de la solidificación, utilizar pinzas para voltear el casete hacia atrás. Añadir 4 ml de KGM al plato 6 cm.
8. Coloque 0,5-1 millones de queratinocitos modificados genéticamente en los cassettes que contienen organotípicos la dermis (Figura 3D).
   1. Trypsinize queratinocitos mediante la colocación de 4 ml de tripsina al 0,05% en placas de 10 cm durante 5 min y se inactiva con 4 ml de medio DMEM completo.
   2. Contar los queratinocitos utilizando un hemocitómetro y luego girar hacia abajo a 200 xg durante 5 min. Resuspender las células 0,5-1.000.000 (dependiendo del número de células disponibles) en 90 μl de KGM y colocar todas las células en la dermis.
      NOTA: Es importante colocar el mismo número de células en la dermis dentro del mismo experimento para garantizar que las diferencias observadas en espesor de la epidermis regenerada no es debido a diferencias en el número de células de partida. Colocación de menos de 0,5 millones de células de la dermis puede conducir a una mala estratificación y diferenciación.
9. Cambie medios KGM en los cultivos organotípicos cada dos días. Tejido Cosecha 1-14 días después de la colocación de los queratinocitos en la dermis. Estratificación completa y la diferenciación de la epidermis por lo general se produce después del día 5.

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Resultados

El primer paso en la generación de la piel humana organotípicos es eliminar la epidermis de la dermis. La incubación de dos semanas de la piel en 37 ° C en 4x pen / strep / PBS debería permitir la separación de la dermis de la epidermis (Figura 1A). Si es difícil separar la epidermis y la dermis luego colocar el tejido a 37 ° C en 4x penicilina / estreptomicina / PBS durante una semana y luego tratar de pelar de nuevo utilizando fórceps.

Una de las claves para la re...

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Discusión

La manipulación genética en la piel humana cultivos organotípicos ofrecen muchas ventajas para estudió comúnmente 2D células cultivadas, así como modelos de ratón. Culturas 2D carecen de las tres interacciones célula-matriz celular y extracelular de las células dimensionales que se encuentran en tejidos y órganos intactos. Estudios recientes también han encontrado enormes diferencias entre las células de cáncer de piel cultivadas en 2D y 3D con las células cultivadas en 3D que muestran mucho más similitu...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human skin	New York Firefighters Skin Bank	http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREP	GIBCO	15140-122
amphotropic phoenix cell lines	ATCC	CRL-3213
FUGENE 6 transfection reagent	Promega	E2691
Keratinocyte Media (KCSFM)	Life Technologies	17005042
DMEM	GIBCO	11995
Ham's F12	Cambrex	12-615F
FBS	GIBCO	10437-028
Adenine	Sigma	A-9795
Cholera Toxin	Sigma	C-8052
Hydrocortisone	Calbiochem	3896
Insulin	Sigma	I-1882
EGF	Invitrogen	13247-051
Transferrin	Sigma	T-0665
Ciprofloxacin Hydrochloride	Serologicals	89-001-1
cautery	Bovie Medical Corporation	AA01
Matrigel	Corning	354234
Keratin 1 antibody	Biolegend	PRB-149P
square pegs	Arts and crafts stores
human neonatal keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
human neonatal keratinocytes	Cell Applications	102K-05n
MSCV retroviral vector	Clontech	634401
LZRS retroviral vector	Addgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vector	Oligoengine	VEC-PRT-0002
hexadimethrine bromide	Sigma	H9268-5G