Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Resumen

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Resumen

Respuesta inmune eficiente depende de la rápida movilización de leucocitos de la sangre al sitio de la infección o lesión. La investigación de la migración de leucocitos in vivo es crucial para entender la base molecular de la migración transendotelial de leucocitos y la interacción con el endotelio vascular. Un enfoque poderoso implica microscopía intravital en ratones transgénicos que expresan las proteínas fluorescentes en las células de interés.

Aquí se presenta un protocolo para los monocitos de imágenes y neutrófilos en el CX ₃ CR1 ^{gfp / peso} iv ratón inyectado con neutrófilos marcado tinte de color naranja con un microscopio confocal invertido. Películas Time-lapse recogidos de 30 minutos a varias horas de imágenes de permitir el análisis del comportamiento de leucocitos en las venas mesentéricas, tanto en condiciones de estado estacionario e inflamatorias. También describe los pasos para inducir localmente inflamación de los vasos de sangre con TLR2 / TLR1 agonista Pam3SK4 y supervisar el subsequent reclutamiento de neutrófilos y monocitos.

La técnica presentada también se puede utilizar para controlar otras poblaciones de leucocitos e investigar moléculas implicadas en el reclutamiento de leucocitos o el tráfico que utilizan otros estímulos o ratones transgénicos.

Introducción

Los neutrófilos y los monocitos son las células del sistema inmune innato que circulan continuamente en la sangre. Tras la lesión o infección, inducen señales inflamatorias diapedesis de leucocitos en los tejidos dañados y infectadas, en el presente documento iniciar una respuesta inmune celular ^{a 1-3.} La rapidez de la movilización de leucocitos determina el resultado positivo de las respuestas inmunes. Estos procesos complejos se basan en moléculas específicas (por ejemplo, selectinas, quimiocinas endotelio unida) presentes en el endotelio inflamado que ayudan para el establecimiento de contactos adhesivas entre leucocitos circulantes y el endotelio ^1-3 .Para obtener ideas sobre las moléculas implicadas en los leucocitos cascada de reclutamiento, es importante para visualizar la cinética de reclutamiento de células y para rastrear el comportamiento de cada célula / población. Un método eficaz consiste en microscopía intravital en ratones transgénicos que expresan las proteínas fluorescentes en las células de interés.

contenido "> Hasta la fecha, varios enfoques mediante microscopía intravital se desarrollaron para la imagen de la vasculatura ^4,5. Por ejemplo, se utilizó la imagen de la dermis del oído vasculatura o venas mesentéricas por microscopía confocal intravital para identificar el comportamiento de patrullaje de Ly6C murino monocitos ^{bajos y} humana CD14 ^{dim monocitos} CD16 + en el lado luminal de los vasos sanguíneos en condiciones de estado estacionario ^6-8. El modelo vasculatura cremáster ratón se utiliza a menudo para monitorear el comportamiento de neutrófilos o monocitos Ly6c inflamatoria ^altos en condiciones inflamatorias o isquémicas en ratones transgénicos. En ese caso, cremáster se estimula a través de la inyección de intraescrotal IL1β, CCL2, TNFß o fMLP. Después de 2-4 horas, tejidos se exteriorizan y se analizaron por microscopía confocal intravital ^9-11 quirúrgicamente.

El siguiente protocolo describe un método para monitorear monocitos y neutrófilos, al mismo tiempo con cualquierde fluorescencia invertida microscopio confocal. Por otra parte, nuestro método detalla cómo reproducir el mismo recipiente antes (condición de estado estable) y después de la inflamación y cómo seguir la cinética de reclutamiento de leucocitos. Para este fin, se utiliza el CX ₃ CR1 ratón ^{gfp / peso,} cuya monocitos expresar eGFP, iv inyectado con una naranja neutrófilos murinos marcados con colorante. El uso de un microscopio confocal invertido, es posible (1) para rastrear y analizar los monocitos ^bajos Ly6c patrullaje bajo condiciones de estado estacionario y (2) para seguir el reclutamiento de monocitos y neutrófilos ambos en el mismo recipiente después de la inflamación local. Aquí creamos las condiciones inflamatorias mediante el agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 ^12. Además, tal formación de imágenes puede ayudar a determinar el papel de las moléculas específicas de interés en las diversas etapas de la cascada de reclutamiento de leucocitos si se realiza en ratones knock-out específicas o en presencia de anticuerpos bloqueantes ^6,9,13.

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Protocolo

NOTA: Los procedimientos en animales se realizaron de acuerdo con el Comité de Ética Institucional de Cuidado de Animales en Ginebra, Suiza y la Oficina Veterinaria Cantonal. Número de Autorización de GE / 63/14.

1. Preparación de una suspensión de células individuales a partir de médula ósea

1. Sacrificio del ratón (8-12 semanas de edad) por dislocación cervical. Esterilizar patas traseras con etanol al 70%. Retire la piel de las patas traseras.
2. Diseccionar fémures y tibias del ratón y eliminar el tejido de las piernas con un bisturí. Enjuague piernas con etanol al 90% y el lugar en una placa de cultivo lleno de PBS.
3. Bajo el capó cultura, pañuelo de papel limpio de fémur y la tibia con un bisturí y se separan en articulación de la rodilla. Cortar los extremos de los huesos.
4. Médula ósea Flush de cada hueso utilizando una aguja 23G y una jeringa de 1 ml llena con medio de preparación (fenol DMEM / F12 sin rojo, 1% de suero de rata), a unos 50 ml tornillo tubo. Interrumpir agregados celulares por delicadeza pases a través de la ne 23Gedle y una jeringa de 1 ml. Traiga volumen total de 25 ml con medio de preparación.
5. Centrífuga 250 xg, 5 min, 4 ° C. Sobrenadante Descartar. Pellet Resuspender en 1 ml de glóbulos rojos tampón de lisis RBLC (8,3 g NH ₄ Cl, 1 g de NaHCO _3, 1 ml de EDTA (100 mM), completa a 1 litro con agua destilada, filtro de 0,22 micras) en unos 15 ml tornillo tubo. Incubar 30 segundos en hielo.
6. Añadir 10 ml de medio de preparación y centrífuga 250 xg, 5 min, 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender en 2 ml de medio de preparación.

2. neutrófilos Enriquecimiento por selección negativa

1. Añadir 150 l de ratón cóctel enriquecimiento de neutrófilos (kit de plataforma de aislamiento de células tales como EasySep). Mezclar e incubar en hielo durante 10 min.
2. Añadir 10 ml de fenol DMEM libre de rojo. Invertir una vez y centrifugar 250 xg, 3 min, 4 ° C.
3. Sobrenadante Descartar. Resuspender pellet en 1,75 ml de medio de preparación en 5 ml de poliestireno ronda tubos de fondo. Añadir 250 l BiotCóctel en Selección. Mezclar e incubar en hielo durante 10 min.
4. Vortex las partículas magnéticas (del kit de plataforma de aislamiento de células) durante 30 segundos para volver a suspender las partículas. Añadir 500 partículas magnéticas mu l a la suspensión celular. Mezclar e incubar en hielo durante 10 min.
5. Coloque el tubo en el imán. Espere 3 min.
6. Invertir el imán a un nuevo 5 ml de poliestireno ronda tubos de fondo para recoger las células no marcadas deseadas. No tome la última gota que cuelga en el tubo. Las células no deseadas se mantendrán en el tubo en el interior del imán. Deseche este tubo en un peligros biológicos.
7. Coloque el nuevo tubo en el imán. Espere 3 min.
8. Invertir el imán a un nuevo tubo de 15 ml de tornillo para recoger las células no marcadas deseadas. No tome la última gota que cuelga en el tubo.
9. Volumen completa a 5 ml con rojo fenol libre de DMEM.

3. El etiquetado de los neutrófilos

1. Añadir 0,5 l de un tinte de color naranja como la célula Rastreador de Orange (concentración de trabajo1 M, CMRA - clorometil-rodol-acetato, madre 10 mM en DMSO). Incubar 2 minutos a 37 ° C.
2. Añadir 2,5 ml de medio de preparación. Centrífuga 250 xg, 5 min, 4 ° C.
3. Sobrenadante Descartar. Resuspender pellet en 1 ml de medio de preparación en un tubo de 1,5 ml.
4. Tomar una alícuota de contar con hematocitómetro.
5. Incubar 5 minutos a 37 ° C. Centrífuga 250 xg, 5 min, 4 ° C.
6. Sobrenadante Descartar. Resuspender pellet en 1 ml de PBS. Centrifugar 250 xg, 5 min, 4 ° C para lavar.
7. Sobrenadante Descartar. Resuspender pellet como 10x10 ⁶ células por 100 l de PBS. Mantenga en hielo hasta que la inyección iv. NOTA: Las células tienen que ser iv inyecta lo más rápidamente posible. 6-12x10 ⁶ neutrófilos / ratón se obtienen por lo general.

4. Preparación del ratón por Microscopia intravital

NOTA:.. Paso 4.1) y 4.2) se debe realizar al comienzo del experimento para evitar tiempo de espera prolongado de los neutrófilos marcados en icmi.

1. Pese la CX ₃ CR1 ratón ^gfp (8-12 semanas de edad).
2. Preparar 800 l de anestésicos ketamina (60 mg / kg, xilazina 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg en PBS).
3. Anestesiar el ratón. Ip inyección con 200 l / 20 g de ratón. Anestesia de control por los pies pellizcos y marcando la frecuencia respiratoria.
4. Inyectar neutrófilos (10x10 ⁶ células en 100 l de PBS) por vía intravenosa utilizando las venas de la cola laterales o del seno retro-orbital, a conveniencia del experimentador.
5. Ponga el ratón en el cojín de calefacción y proteger los ojos con el gel ocular.
6. Un cubreobjetos de vidrio (35 mm de diámetro) se coloca en una placa de cultivo tisular de 10 cm, que tiene un agujero de diámetro 30 mm. Uso de aceite es mantener la placa de cultivo de tejido en contacto con el cubreobjetos.
7. Incisión en la piel del abdomen con unas tijeras para exponer el peritoneo. Incisión en el peritoneo con tijeras para exponer intestino.
8. Añadir 200 l de PBS (pre-calentada a 37 ° C) en el pcavidad eritoneal. Tome el ratón en la mano y ponlo boca abajo, de modo que el intestino se sale de la cavidad peritoneal con una suave presión. Coloque el ratón en la placa de cultivo tisular.
9. Deroll suavemente el intestino con bastoncillos de algodón esterilizado en el cubreobjetos con el fin de exponer los vasos mesentéricos.
10. Cortar pañuelos de papel en bandas y mojar con 37 ° C PBS calentado. Inmovilizar el intestino con las piezas de pañuelos de papel para disminuir los movimientos resultantes de la peristalsis.
11. Coloque la placa de cultivo de tejidos y el ratón dentro de la cámara de termostato 37 ° C en el escenario de la bandeja a medida del microscopio invertido. Introducir una jeringa que contiene anestésicos sc en la pata trasera. NOTA: Además, el ratón puede recibir oxígeno (0,5 L / min) con una máscara.
12. Ratón de control para la anestesia por pellizco del dedo del pie y el control de la frecuencia respiratoria cada 30 min. Si es necesario, proporcionar un impulso de anestésicos (20 l) para mantener adecuadamente la anestesia. NOE: El secado de la vasculatura debe ser evitado. Por lo tanto, su humedad se mantiene mojando regularmente los pañuelos de papel utilizados para inmovilizar el intestino con 37 ° PBS calentado-C.

5. Medición de neutrófilos y monocitos Comportamiento en buques inflamadas in vivo utilizando Microscopia intravital

1. Láseres Set de 488- y 561- en la potencia más baja necesaria para evitar fototoxicidad inducida por láser. En nuestros experimentos, es inferior a 0,5%. La intensidad de las buenas prácticas agrarias en monocitos y tinte de color naranja en los neutrófilos es tan brillante que normalmente 0,3% es suficiente. NOTA: Esto representa una potencia láser de 0,15 a 0,25 mW con nuestro sistema.
2. Adquirir imágenes de 512 x 512 píxeles (es decir, 635 micras) en 2,2 segundos con un agujero de alfiler abierto con el objetivo seco del microscopio invertido 20X. Use un z-profundidad entre 10 y 20 micras, que asegura la señal suficiente con las potencias bajas láser.
   NOTA: Por lo general, realizamos experimentos con un z-profundidad entre 12 y 1656; m. En el caso de cifras presentadas y películas, el Z-profundidad es de 20 micras. Contraste de fase permite la identificación de las paredes endoteliales y las imágenes se realiza en las venas mesentéricas. Dado que las células que patrullan mueven muy lentamente con una velocidad de 5 a 10 micras de / min ^6, la grabación de un campo de interés cada 20 seg es satisfactoria. Con los ajustes descritos, la etapa motorizada permite la grabación de hasta 7 campos de interés al mismo tiempo.
3. Coloca el ratón y los vasos mesentéricos en la cámara de termostato del microscopio se les permite recuperarse de la preparación durante 30 minutos antes de la adquisición de la primera película. Durante este tiempo, elegir varios campos de interés. Centrarse en la superficie luminal del vaso más cercana al objetivo. Si es necesario, se aprovechan de la leve autofluorescencia del endotelio para ajustar el enfoque.
   NOTA: La cirugía durante la preparación del ratón destaca ligeramente el endotelio. En consecuencia, laminados de los neutrófilos y/ o monocitos se pueden observar en la primera después de la preparación del ratón 15 min.
4. Grabar una primera película de 30 minutos bajo condiciones de estado estacionario, una imagen cada 20 segundos.
   NOTA: El software adquiere cada campo de interés en 2,2 segundos y la platina motorizada se mueve automáticamente de un campo a otro. Se remonta a la primera posición dentro de 20 segundos durante los 30 minutos de la película de grabación.
5. Para iniciar la inflamación de los vasos de la sangre, añadir una gota de 20 l de PBS que contenía 100 mg de TLR2 / TLR1 agonista Pam3CSK4 ¹² directamente sobre los vasos fotografiados.
6. Controlar el enfoque para cada campo de interés.
   NOTA: Durante el curso de adquisición, siempre hay pequeños cambios de enfoque en el eje z. A pesar de 10 a 20 micras z la profundidad, esto puede resultar en una disminución de la intensidad de fluorescencia. Por lo tanto, reorientar manualmente cada campo de interés al final de cada película, si es necesario. Grabar películas durante 30 min períodos y hasta 3 horas paraTal después de la iniciación de la inflamación.
7. Al final del experimento, sacrificar ratón anestesiado por dislocación cervical.

6. Generación de archivos de película y Seguimiento de leucocitos

NOTA: El software de adquisición de Nikon genera .nd2 archivos, pero el siguiente procedimiento sería similar con otro software y marcas.

1. Exportar archivos como serie tiff.
2. Ir al software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importe la serie tiff. Cada canal como un archivo diferente.
3. Aplicar un filtro de mediana con un radio de 2,0 píxeles para los canales verde y rojo para reducir el ruido de fondo (Proceso> Filtros> La mediana ...).
4. Convertir archivos en binario (Proceso> Binary> Hacer binario). Habilitar el software para calcular el umbral para cada imagen.
5. Combinar canales en una sola serie de imágenes (Imagen> Color> Combinar Canales ...). Seleccione los monocitos en el gradon canal, los neutrófilos en el canal rojo y la luz transmitida en el canal gris.
6. Convertir imágenes apiladas en colores RGB (Imagen> Color> pila para RGB).
7. Guardar archivo como .avi
8. Los datos se importan y se compilan en el software Imaris (Bitplane). Los movimientos de los monocitos y los neutrófilos son entonces rastreados mediante el Asistente de Seguimiento Spot.

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Resultados

El manuscrito describe un protocolo optimizado para controlar fácilmente el comportamiento de los monocitos y neutrófilos en las venas mesentéricas de ratones anestesiados en tiempo real. El uso de una cámara termostatizada-C 37 ° es obligatoria para mantener la temperatura del ratón y también debido al movimiento dependiente de la temperatura de los leucocitos. Preparación del ratón se muestra en la Figura 1. La Figura 2 muestra toda la zona visto bajo el microscopio. Luz tran...

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Discusión

Las metodologías descritas en este manuscrito proporcionan un enfoque coherente para estudiar de manera eficiente los monocitos y el comportamiento de los neutrófilos en las venas mesentéricas bajo condiciones de estado estacionario e inflamatorias.

El paso crucial de la preparación es la inmovilización del intestino con tejidos contacto con el medio PBS. Si se realiza correctamente, los vasos mesentéricos están muy bien expuestos en el cubreobjetos para la adquisición de imágenes. ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 ml polystyrene round bottom tubes	Beckton Dickinson	352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm	Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm	Nikon
Cell Tracker Orange CMRA Dye	Life Technologies	C34551
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit	Stem Cell Technologies	19762
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
FCS	PAA	A15-042
Immersion Oil Type A	Nikon		any viscous oil
Life Box Temperature Control System	Life Imaging
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
NH4Cl	Sigma Aldrich	A9434
Nikon A1R confocal microscope	Nikon	A1R	inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBS	Life Technologies	D8537
phenol red free DMEM/F12	Life Technologies	21041-025	any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4	Invivogen	tlrl-pms	reconstitute in PBS
Rat serum	Stem Cell Technologies		included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
Tissue culture dish 100	TPP	93100