Imágenes en tiempo real de la Planta Dinámica superficie celular con Variable de ángulo epifluorescencia Microscopía

Resumen

El objetivo de este protocolo es demostrar cómo monitorear la dinámica de proteínas con fluorescencia de etiquetado en las superficies celulares de las plantas con la microscopía de epifluorescencia de ángulo variable, mostrando parpadear puntos de PATROL1 GFP-etiquetados, una proteína tráfico de membrana, en la corteza celular del complejo estomático en Arabidopsis thaliana.

Resumen

A plant’s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed ‘residence time’) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

Introducción

The plant cell surface, including the plasma membrane and its immediately adjacent cytoplasm, is the main region of a plant cell’s perception and integration of biotic and abiotic cues from the extracellular environment. In response to these cues, cell surface components including plasma membrane proteins and the cortical cytoskeleton undergo dynamic changes, on a time scale of seconds to minutes^1-4. Thus, real-time and high-resolution imaging of fluorescent proteins on the cell surface can illuminate a plant’s responses to environmental cues at the molecular level.

Confocal laser scanning microscopy is a powerful tool for determination of fluorescently-tagged protein localization³, however, it is often difficult to monitor the real-time protein dynamics because of its relatively long capturing times. An emerging technique for real-time monitoring of proteins in the plant cell is variable angle epifluorescence microscopy (VAEM), which is an adaptation of equipment usually used for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. In TIRF microscopy, the fluorescence-excitation light source is an evanescent light field that is generated when the entry angle of the laser is shallow enough to totally internally reflect light at the glass–water interface. The penetration depth of the evanescent light field is around 100 nm. TIRF microscopy is an outstanding tool for single molecule imaging, such as the detection of exocytosis in animal cells⁵. However, evanescent light cannot reach plasma membranes or the cortical cytoplasm in plant cells, because they have thick cell walls. Recently, TIRF microscopy equipment has been adapted by plant cell biologists, observing that a laser, if angled slightly more deeply than when being used to induce total internal reflection phenomena, could excite the surface of plant cell samples, resulting in high-quality plant cell imaging^6,7. The excitation illumination depth is varied by adjusting the entry angle of the laser; therefore, this technique is described as VAEM. This optical system is also called variable angle TIRF microscopy (VA-TIRFM) because there is a possibility that total reflection may take place at the cell wall-periplasm interface⁷, however, the term VAEM is used in this article, as per the first report in plants⁶.

The goal of this protocol is to demonstrate practical procedures for using VAEM to visualize fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces. Additionally, an image analysis protocol to quantify the residence time (duration of presence) of molecules is described for VAEM movie analysis. GFP-PATROL1 dot blinking on stomatal complex cells in Arabidopsis thaliana cotyledons is used as an example. PATROL1 was identified by forward genetic approaches as a causal gene of a stomatal response defect mutant in A. thaliana⁸. PATROL1 is a plant homolog of MUNC-13, which is a priming factor in synapse vesicle exocytosis⁸. In response to environmental cues, such as light or humidity, it is thought that PATROL1 reversibly regulates the delivery of a proton pump to plasma membranes in the stomatal complex. Stomatal complexes each comprise a pair of guard cells⁸ and subsidiary cells⁹, and they require a proton pump for stomatal movement. In these cells, GFP-tagged PATROL1 localizes to dot-like structures that remain on the plasma membrane for less than 1 min⁹.

Protocolo

1. Preparación de plántulas

1. Esterilizar las semillas.
   1. Preparar la solución de esterilización mediante la adición de 500 l NaClO (cloro disponible: 5,0%) y 1 l 10% de Triton X-100 a 500 l de agua estéril.
   2. Lugar ca. 10 transgénico A. thaliana semillas que llevan GFP-PATROL1 ⁸ en un tubo de 1,5 ml.
   3. Añadir 1 ml solución de etanol al 70%, y mezclar bien invirtiendo cinco veces. Dejar durante 1 min.
   4. Tenga en cuenta las semillas se hunden hasta el fondo del tubo. En una cabina de flujo laminar limpio, retire suavemente el etanol al 70% utilizando una micropipeta, y añadir 1 ml de solución de esterilización. Mezclar bien por inversión cinco veces y se deja durante 5 min.
   5. Lavar las semillas. Sigue trabajando en condiciones asépticas en un banco limpio, retire con cuidado la solución con una micropipeta, y añadir 1 ml de agua estéril. Repita esto cinco veces. Las semillas esterilizadas se pueden almacenar en agua estéril a 4 ° C durante 2 días.
2. Asi quew las semillas esterilizadas en un gellan 0,5% de goma solidificado media Murashige y Skoog placa de medio (pH 5,8) ^9. Cinta de la tapa sobre la placa usando dos capas de cinta quirúrgica.
3. Incubar la placa en la oscuridad a 4 ° C con una cámara de almacenamiento en frío, O / N.
4. La transferencia de la placa en una cámara de crecimiento fijado en 23,5 ° C, con un ciclo de luz-oscuridad / 12-hr 12 hr utilizando 100 mol m ^{-2 s} -1 luces blancas, y se incuba durante 7 días. Las plántulas con cotiledones de alrededor de 1 mm de largo y luego se pueden cosechar.

2. Sky gota Montaje de Cotiledón Especímenes

NOTA: Un factor importante en la preparación de muestras para la observación VAEM es evitar la inclusión de burbujas de aire entre la muestra y la cubierta de vidrio. Burbujas reducen en gran medida la calidad de imagen de VAEM al causar diferencias en el índice de refracción. Un método simple, lo que hemos llamado "caída del cielo 'de montaje, se puede utilizar para evitar burbujasentre la A. cotiledones thaliana y la cubierta de vidrio. Esto se debe hacer inmediatamente antes de la observación.

1. Coloque 30 l de tampón basal [5 mM 2- (N morfolino) etanosulfónico ácido-Tris (Tris-MES) a pH 6,5, KCl 50 mM, 100 mM CaCl _2] en el centro de un portaobjetos de vidrio (tamaño: 76 × 26 mm, espesor: 1,0 a 1,2 mm).
2. Retirar un cotiledón de una plántula de 7 días de edad, con unas tijeras de disección. Flotador el cotiledón con la cara de observación arriba en la caída de tampón basal (Figura 1, paso 1).
3. Ponga 30 l de tampón basal en el centro de una cubierta de vidrio (tamaño: 18 × 18 mm, espesor: 0,12-0,17 mm) (Figura 1, paso 2). Gire la cubierta de vidrio boca abajo con suavidad. La tensión superficial evitará la caída de tampón de caerse. Sostenga la cubierta de vidrio con pinzas en un borde. Coloque el borde opuesto sobre el portaobjetos de vidrio de modo que la caída de tampón es de aproximadamente por encima del cotiledón.
4. Con el borde de la cubierta de vidrio aún en la diapositiva, y todavía con el borde opuesto con pinzas, ajustar la posición de la caída de amortiguación bajo la cubierta de vidrio para que sea directamente sobre la muestra cotiledones (Figura 1, paso 3). Dejar de lado la cubierta de vidrio. Montar una gota en la muestra resultante en una preparación sin burbujas de aire.
5. Limpie el exceso de buffer usando tejidos sin pelusa. Observar la preparación inmediatamente (ver paso 3).
   NOTA: No hay necesidad de sellar las muestras.

3. VAEM Observación y Movie Adquisición

NOTA: El sistema de microscopio TIRF ⁹ utilizado en el presente estudio se describe como sigue: un microscopio invertido está equipado con una unidad de TIRF y una lente objetivo TIRF con una apertura numérica de 1,49. Para el control informatizado del ángulo de entrada del láser, se utiliza una caja de control. Proteína verde fluorescente (GFP) se excita con un 488 nm láser semiconductor de bombeo óptico, y tque la fluorescencia se detecta a través de un filtro de paso de banda 510 a 550 nm para evitar que la autofluorescencia de los cloroplastos. El valor máximo medido de la potencia de salida de la fibra es 13,0 a 13,5 mW. Para la detección, un electrón multiplicando dispositivo de carga acoplada (EM-CCD) sistema de cabezal de la cámara y una unidad de cambio de magnificación de la cámara de montaje C se utilizan.

1. Calibrar centrar el láser y el enfoque de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Este paso es crucial para las observaciones VAEM precisas. Se recomienda encarecidamente que los controles periódicos de los procedimientos de ajuste de trayectoria láser, apropiado a su microscopio, se llevan a cabo.
   1. Determinar la posición central iluminada con una trayectoria de la luz sin lente objetivo en el techo de la sala de microscopía. Para marcar la posición central, poner un sello de color en el techo (Figura 2, paso 1, 2).
   2. Ilumine el techo con una lente objetivo (Figura 2, paso 3, 4). Mueva el illuminated región a la posición central (Figura 2, paso 5). Enfoque el láser (figura 2, paso 6). Ajustar la posición del láser enfocado hacia el centro (figura 2, paso 7).
2. Establecer un ejemplar en la platina del microscopio y seleccionar celdas de observación utilizando iluminación de campo brillante.
3. Compruebe que la proteína fluorescente se puede observar en las células, y fijó la posición de la z eje x en la superficie celular mediante la iluminación de epifluorescencia (Figura 3A).
4. Realizar observaciones VAEM.
   1. Inclinar el ángulo de entrada del haz de láser gradualmente con la caja del controlador. Al mismo tiempo, controlar la imagen en vivo con cuidado. Inicialmente, la imagen será borrosa (Figura 3B).
   2. A medida que el ángulo aumenta láser, la imagen VAEM será menos borrosa, finalmente producir un imagen clara (Figura 3C y D). En este punto, dejar de Increacantar el ángulo láser. Si se pierde la señal de fluorescencia, disminuya a un ángulo menos profundo.
   3. Ajustar el ángulo de entrada de láser para obtener una mejor imagen. Puesta a punto de la posición del eje x z también puede mejorar la imagen. Si es necesario, ajuste los parámetros ópticos (energía láser, longitud de onda y de conjunto de filtros) y parámetros del sensor de imagen [tamaño de imagen, tiempo de exposición, ganancia, digitalizador y (EM) de ganancia de electrones multiplicando].
      NOTA: En el caso de los equipos microscopio TIRF ha descrito anteriormente, los parámetros representativos son los siguientes. Ampliación de la lente justo en frente de la cámara: 2X; Salida de láser: 1,0 mW; Tamaño de imagen: 512 × 512 píxeles; Tiempo de exposición: 100 ms; Ganancia: 5 ×; Digitalizador: 11 MHz; y EM ganancia: 100.
5. Adquirir una película como una de varias páginas TIFF archivo de imagen utilizando el software microscopio comercial. En este caso, la película es de puntos GFP-etiquetados parpadeantes en la superficie de las células de los estomas.
   NOTA: las condiciones de adquisición de imágenes representativas son como folmínimos. Modo de adquisición: Corriente de RAM; Número de imágenes: 600; y el tamaño de varias páginas TIFF: ~ 302 MB.

4. Análisis quimógrafo para la cuantificación de GFP-etiquetados Dot Residencia Tiempo Usando Fiji Software

1. Instale Fiji ('Fiji es Justo ImageJ') de software ¹⁰ usando las instrucciones de los autores (http://fiji.sc/Fiji).
2. Ejecute Fiji y abra el archivo TIFF de varias páginas adquirida mediante el menú Fiji "Archivo-Abrir".
3. Coloque una línea en el sitio de interés, utilizando la herramienta de menú de la barra de Fiji "Herramienta de selección Línea Recta". Opcionalmente, utilice la "Herramienta de selección de línea segmentada" o "Herramienta de selección Línea a mano alzada". En los resultados presentados aquí, una línea recta de 100 pixeles (correspondientes a 8,0 M) se colocó en una célula subsidiaria (Figura 4A).
4. Hacer una imagen quimógrafo usando el menú de Fiji "Imagen-Pilas-Dynamic Reslice "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (Figura 4B). Opcionalmente, "Flip vertical" y "Girar 90 grados" en una ventana de la casilla de verificación también están disponibles (no se utiliza en los resultados presentados aquí). La x y eje y en la imagen quimógrafo indican la posición de la línea (100 píxeles correspondiente a 8,0 micras) y el tiempo de observación (600 píxeles correspondientes a 60 seg), respectivamente. Si la imagen quimógrafo no es satisfactoria, la posición y el tipo (recta, segmentados y mano alzada) de la línea en la imagen de varias páginas se pueden cambiar. Como los cambios en la formación, la imagen quimógrafo cambia dinámicamente. Guarda una imagen de quimógrafo como un archivo TIFF usando el menú de Fiji "Archivo-Guardar como-Tiff".
5. Mida la longitud de la burbuja en la orientación del eje de tiempo.
   1. Para llevar a cabo la reducción de ruido, aplicar un filtro gaussiano a las imágenes quimógrafo utilizando el menú de Fiji "Process-Filtros-Gaussian Blur". El "Sigma (Radius) "parámetro es sintonizable (1 radio de píxeles se utiliza para los resultados presentados).
   2. Segmento de las regiones de señal de umbral, utilizando el menú de Fiji "Imagen-Adjust-Umbral".
      NOTA: Hay varios algoritmos de umbral para elegir. En los resultados presentados, el algoritmo "Yen" fue elegido (Figura 4C).
   3. Prepárese para medir el tiempo (y) eje x longitud de la burbuja con el menú "Analizar-Set Mediciones". Compruebe el "rectángulo delimitador" en la ventana "Medidas Set". Lo ideal sería que el área de juego debe ser lo más pequeño posible, para excluir el ruido. En este caso, el área mínima se fijó en 50 píxeles. Medir el tiempo (y) eje x longitud de la burbuja con el menú "Analizar-Analizar Partículas". Para obtener los valores de los resultados y demostrar la credibilidad de las regiones de medición, compruebe los "Mostrar resultados" y "Añadir a Gerente </ em> "cajas.
   4. Los valores en la columna "Altura" son el tiempo (y) eje x longitudes para la mancha de medición (Figura 4D). Guarde los valores utilizando el menú de la tabla Resultados "Archivo-Guardar como" y calcular y procesar el conjunto de datos de las duraciones imagen blob utilizando un paquete estadístico y / o software de hoja de cálculo (Figura 4E).

Resultados

En este artículo de vídeo, los protocolos para VAEM observación de GFP-PATROL1 en A. Se proporcionan células complejas thaliana cotiledones estomas. Montaje caída del cielo es un método de preparación simple que puede ayudar a reducir la aparición de burbujas de aire en los preparativos VAEM de A. cotiledones thaliana (Figura 1). Inclinación excesiva del láser de entrada y / o z-posicionamiento de muestras para VAEM proporcionará una imagen clara. Si eso su...

Discusión

En este artículo de vídeo, los protocolos se dan para el seguimiento y la medición del comportamiento dinámico de puntos GFP-PATROL1 en el complejo de los estomas de Arabidopsis thaliana. Como se muestra aquí, la observación VAEM es una poderosa herramienta para imágenes en vivo de las superficies celulares de las plantas. Bajo las condiciones experimentales utilizadas aquí para la supervisión GFP-PATROL1, había muy poco photobleaching fluorescencia en la muestra utilizada para 1 min de captura de ví...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope	Olympus	IX-73
TIRF unit	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF objective lens	Olympus	UAPON 100 × OTIRF	NA = 1.49
Laser angle control box	Chuo Seiki	QT-AK
Optically pumped semiconductor laser	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510–550 nm band-pass filter	Olympus	U-FBNA
EM CCD camera	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-mount camera magnification change unit	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.11.0
TIRF microscopy manual	Olympus	AX7385	Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012)
Immersion oil	Olympus	Immersion Oil Typr-F	ne = 1.518 (23 degrees)