Efficient Expresión células de mamíferos y Single-step La purificación de glicoproteínas extracelular para la cristalización

Resumen

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Resumen

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

Introducción

La comprensión de la estructura de proteínas a nivel atómico es clave para descubrir las bases moleculares de las vías biológicas y enfermedades. Cristalografía de rayos X de proteínas es más utilizado el método / aplicable para la determinación de estructuras macromoleculares. El principal reto de este método es la obtención de cantidades suficientes de correctamente plegada, proteína pura. Esto se convierte en un problema particular cuando se trabaja con proteínas de mamífero secretada, que experimentan modificaciones post-traduccionales específicas.

Las proteínas expresadas en bacterias son la principal fuente de proteínas cristalizadas depositadas en el Protein Data Bank ^1. Sistemas de expresión bacterianos se prefieren en gran parte porque son rápidos, de bajo costo y típicamente producen altos rendimientos de proteína. Sin embargo, los dominios extracelulares de proteínas de mamífero expresadas en bacterias a menudo no están correctamente plegadas, en la que se requieren pasos caso de replegamiento y purificación extensa para obtener homogéneamente foproteína LDED. Además, muchas proteínas de mamíferos requieren glicosilación postraduccional para lograr plegamiento apropiado ^2. Aunque la expresión y la glicosilación en células de levadura o de insectos pueden superar el problema de plegado, modificaciones post-traduccionales, incluyendo glicosilación, difieren significativamente de los de células de mamífero ^3, produciendo proteínas con modificaciones incorrectas o no homogéneos.

Las células de mamíferos expresan toda la maquinaria molecular necesaria para garantizar modificaciones post-traduccionales adecuadas y plegado; sin embargo, estos sistemas de expresión no son típicamente preferidas por la mayoría de los laboratorios, debido a los rendimientos limitados y altos costos de reactivos y consumibles. Polietilenimina (PEI), un reactivo de transfección estándar es relativamente barato, pero impone considerable la citotoxicidad y la baja eficiencia de la transfección, lo que resulta en aumento de los costos en los medios de comunicación celular, el ADN, y el equipo de cultivo. Muchas alternativas a PEI son prohibitivamente caros. Abordamosestos problemas mediante la descripción de una combinación de herramientas mejoradas de cultivo de células y químicamente modificado PEI para el método rápido y relativamente barato para la expresión de proteínas de mamíferos secretadas, seguido de purificación de un solo paso. Este método robusto da rendimientos suficientes para estudios funcionales y bioquímicos ^4, y en algunos casos, da lugar a la proteína susceptible a la cristalización sin purificación adicional.

Este protocolo describe varias técnicas para maximizar la expresión y el rendimiento de las proteínas de mamíferos secretadas en el riñón embrionario humano (HEK) 293F células cultivadas en suspensión. La eficacia de transfección (y costo), la producción y purificación de proteínas están enormemente mejorado siguiendo este protocolo. PEI modificado por la adición de carbamatos a través de una reacción de apertura de anillo de un solo paso (PEI-TMC-25, síntesis y propiedades se describe en detalle en la ref ⁵⁾ mejora en gran medida la eficiencia de transfección, reduce la citotoxicidad de catiónicodisrupción de la membrana y por consiguiente reduce los costes de experimentación. Por otra parte, la viabilidad celular y la expresión de proteínas se mejoran en gran medida con la adición de suplementos de cultivo para el suministro de glucosa y vitaminas. Es importante destacar que para la producción de proteínas glicosiladas, el tratamiento con kifunensine, un inhibidor químico no tóxico de manosidasa I, produce proteínas con definidos, glicanos inmaduras, que pueden ser eliminados por el EndoHf endoglicosidasa para producir proteínas con un solo N-acetilglucosamina en lugar de un álbum de glicanos ⁶ N-ligado. Finalmente, la secreción de proteínas en un, medio químicamente definido libre de suero permite la purificación rápida y fácil para estudios estructurales y bioquímicos. Níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) de purificación de resina Single-step elimina la mayoría de las especies contaminantes en el sobrenadante y, en algunos casos, puede producir la proteína de pureza suficiente para la cristalización.

Protocolo

1. Producción de cantidades de miligramos de ADN de plásmido para la transfección transitoria a gran escala

1. Clonar la proteína de interés en un vector de expresión mamífero número elevado de copias usando la clonación sitio de restricción, u otra técnica apropiada.
   1. Para obtener resultados óptimos, utilice pHLsec ⁷ vector, que tiene incorporado un C-terminal 6His-tag, una fuerte secuencia Kozak promotor y una señal de secreción optimizado.
2. Transformar el plásmido en las células competentes.
   1. Añadir 20 l de células competentes de E. coli en 1 g de ADN plásmido y se incuba en hielo durante 30 min.
   2. Células choque térmico a 42 ° C durante 35 seg, y luego incubar en hielo durante 2 min.
   3. Añadir 300 l de medio de crecimiento microbiano (SOC) y se incuba a 37 ° C durante 45 minutos, agitando a 220 rpm.
   4. Células de la placa en la placa de agar con la selección de antibiótico apropiado.
      1. Utilice 100 mg / ml de carbenicilina si el plásmido se encuentra en el vector pHLsec.
3. Colonias Cultura en 250 ml de caldo Luria (LB) los medios suplementados con 100 g / ml a los antibióticos (carbenicilina) O / N a 37 ° C, agitando a 220 rpm.
4. Purificar el ADN de cultivo utilizando el kit de alta velocidad plásmido Maxi según el protocolo del fabricante.
   1. Eluir el ADN en tampón EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5), en lugar de tampón TE.
   2. Alícuota del plásmido purificado en cantidad necesaria para la transfección y se almacena a -20 ° C.

2. A gran escala cultura y transfección transitoria de células 293F

1. Suplemento medios 1 L 293F con 10 ml de glutamina y 5 ml Pen / Strep (tanto 100x). Almacenar a 4 ° C. 5 ml Pen / Strep es una resistencia suficiente en condiciones libres de suero y la concentración del antibiótico reducido mejora la viabilidad de las células durante la transfección, lo que mejora los rendimientos de proteína.
2. Cultura células 293F en 300 ml de medio en 1 L de policarbonato desconcertados matraces Erlenmeyer con tapón de ventilacións a 37 ° C con 8% de CO _2, mientras se agitaba en una incubadora de cultivo de tejidos estándar.
3. Diluir las células a 5 x 10 ⁵ / ml de densidad un día antes de la transfección.
4. En el día de la transfección, el medio de cultivo mediante la adición de suplemento de volumen de 10% de 2% w / v Cell Boost en medios 293F.
   1. Medir la concentración de glucosa utilizando un monitor de glucosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante y suplementos uso cuando sea necesario para lograr una concentración de glucosa de 500 mg / dL.
5. Añadir kifunensine (/ ml de concentración final 1 g) en este paso para controlar la glicosilación de proteínas.
6. Calcular el volumen de ADN plásmido requerido para 1 g por 1 x 10 ⁶ células. En condiciones estériles, diluir ADN en medio libre de suero 5 ml.
7. Calcular el volumen de reactivo de transfección requeridos para el plásmido 1 g por 2 l de reactivo de transfección. En condiciones estériles, diluir reactivo de transfección (PEI-TMC-25) en medio libre de suero de 5 ml.
8. Añadirreactivo de transfección de ADN en solución en incrementos de 1 ml, mezclando suavemente. Incubar durante 30 min a TA para los complejos de ADN-reactivo para formar. A continuación, añadir la solución sobre las células de una manera gota a gota.
9. Permitir que las células transfectadas para expresar la proteína de 72 a 96 h. Suplemento con ~ 10% del alza del volumen celular Medios diarias, o si es necesario para mantener la glucosa en la lectura de 400 a 600 mg / dl.

3. Purificación

1. Decantar la cultura en un matraz de centrífuga, centrifugar durante 20 min a 1.300 xg para sedimentar las células y luego recoger el sobrenadante. Si es necesario, girar un segundo tiempo y / o utilizar filtro de 0,22 micras para aclarar sobrenadante.
2. Añadir tampón de unión 10% volumen 10x Ni-NTA (M NaCl 1,5, 0,5 MK ₂ HPO _4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazol).
3. Preparar una columna de gravedad mediante la adición de 2 ml de Ni-NTA suspensión en una columna y equilibrar con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de unión 1X. Si es posible, hacer todos los pasos de columna en una habitación de 4 ° C. Alternatively, proteína de frialdad y todos los tampones en hielo antes de la etapa de columna y mantener proteínas y recogida de flujo continuo en el hielo.
   Nota: Ni-NTA suspensión es la resina de 50% en volumen y capacidad de unión declarado de la fabricación es 50 mg / ml. Perlas de Ni-NTA pueden ser re-cargadas para múltiples usos
4. El flujo del sobrenadante sobre la resina y recoger flujo a través. Repita este paso.
5. Lavar con 10 CV de tampón de lavado (NaCl 300 mM, 50 mM de K ₂ HPO _4, 20 mM imidazol pH 8).
6. Eluir la proteína en 5 CV de tampón de elución (NaCl 300 mM, 50 mM K ₂ HPO _4, 250 mM de imidazol pH 8).
7. Si se requiere desglicosilación:
   1. Para un volumen final de 0,5 ml, eluido concentrado a 0,43 ml usando un concentrador de centrifugación. Si se forman precipitados, sedimentar los residuos por centrifugación a 16.000 xg y 4 ° C.
   2. Añadir 50 l de 500 mM Na-citrato de pH 5,5.
   3. Añadir 20 l de EndoHf (1 x 10 ⁶ U / ml). Incubar a temperatura ambiente durante 2 hr.
      Noe: La enzima funciona de manera óptima a 37 ° C, lo que puede causar que la proteína concentrada a agregarse. Extender la incubación RT, si desglicosilación, evaluada por SDS-PAGE o inmunotransferencia, es incompleta. La enzima no tiene actividad a 4 ° C.
   4. Para eliminar EndoHf: Wash amilosa Resina 3x en tampón fosfato salino (PBS) o tampón de almacenamiento final. Incubar proteína con resina durante 1 hora a 4 ° C. Girar 5 min a 1000 xg para sedimentar los granos y recoger el sobrenadante.
   5. Concentrado de proteína usando el filtro molecular apropiado centrifugación corte de peso y intercambio de tampón en tampón de almacenamiento (NaCl 150 mM y HEPES 20 mM pH 7,5).

Resultados

Aquí sigue los resultados de este sistema de expresión se aplica a un dominio de inmunoglobulina secretada 13 kDa (Ig) de la proteína de activación de receptor humano expresado en las células mieloides (2 hTREM2, residuos 19-132). TREM2 es una proteína transmembrana de tipo I que contiene un único dominio de Ig extracelular que tiene dos enlaces disulfuro y dos sitios de glicosilación unidos a N. A diferencia de muchas otras proteínas de dominio Ig ^8, TREM2 no era susceptible de replegado de cuerpos ...

Discusión

Células HEK 293F ofrecen la producción de robusta de las proteínas que requieren modificaciones posteriores a la traducción. Este sistema permite la expresión rápida y escalable de las proteínas plegadas de forma nativa que contienen disulfuros, glicosilación, fosforilación y que de otra manera estaría ausente el uso de herramientas de expresión más rutinarias. Además, este sistema puede ser utilizado para la expresión y purificación de varios complejos de proteínas simplemente mediante la co-transfecci?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture Flasks	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Use in place of Glutamine
Hype 5 transfection reagent	Oz Biosciences	HY01500
293fectin transfection reagent	Life Technologies	12347019
PEI transfection reagent	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Amylose Resin	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Cell Culture Supplement
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Glucose Monitoring System
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Free Medium for DNA transfection
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Competent Cells	Sigma-Aldrich	G2919