Preparación fácil del ensamblado autónomos Internamente Lípidos Las partículas estabilizadas por nanotubos de carbono

Resumen

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

Resumen

Se presenta un método fácil para preparar partículas lipídicas nanoestructurados estabilizados por nanotubos de carbono (CNT). De una sola pared (prístina) y de paredes múltiples (funcionalizados) CNTs se utilizan como estabilizadores para producir emulsiones (O / W) de tipo Pickering aceite-en-agua. Los lípidos a saber, Dimodan U y fitantriol se utilizan como emulsionantes, que en el exceso de agua se autoensamblan en la fase Pn3m cúbica bicontinua. Esta fase altamente viscoso se fragmenta en partículas más pequeñas utilizando una sonda de ultrasonidos en presencia de estabilizadores de agentes tensioactivos convencionales o nanotubos de carbono como se hizo aquí. Inicialmente, los nanotubos de carbono (forma de polvo) se dispersan en agua seguido de nuevo de ultrasonidos con el lípido fundido para formar la emulsión final. Durante este proceso los NTC quedan recubiertas con moléculas de lípidos, que a su vez se presume para rodear las gotitas de lípidos para formar una emulsión de partículas que es estable durante meses. El tamaño medio de las partículas lipídicas estabilizadas nanoestructurados-CNT está en el submicrónico range, lo que se compara bien con las partículas estabilizadas usando agentes tensioactivos convencionales. Pequeño datos de ángulo de dispersión de rayos X confirma la retención de la fase cúbica Pn3m original en las dispersiones de lípidos estabilizadas-CNT en comparación con la fase lipídica pura (estado a granel). desplazamiento al azul y el descenso de las intensidades en G característica y bandas de CNTs observados en la espectroscopia Raman G 'caracterizar la interacción entre la superficie y de lípidos moléculas CNT. Estos resultados sugieren que las interacciones entre los nanotubos de carbono y los lípidos son responsables de su estabilización mutua en soluciones acuosas. Como las concentraciones de nanotubos de carbono empleados para la estabilización son muy bajos y las moléculas de lípidos son capaces de funcionalizar los NTC, se espera que la toxicidad de los CNT a ser insignificante, mientras que su biocompatibilidad es mucho mayor. Por lo tanto el presente enfoque encuentra un gran potencial en diversas aplicaciones biomédicas, por ejemplo, para el desarrollo de sistemas de nanotransportador híbridos para la entrega de multiple moléculas funcionales como en la terapia de combinación o politerapia.

Introducción

Durante las últimas décadas, la nanotecnología se ha convertido en una herramienta poderosa en especial en el campo de desarrollo preclínico de medicamentos para combatir enfermedades como el cáncer notorios ^1. En este contexto, las estructuras a nanoescala con un tamaño de <1000 nm son ampliamente explorada como vehículo de administración de diversas biomoléculas activas tales como fármacos, proteínas, ácidos nucleicos, genes y agentes de diagnóstico por imagen ^1-4. Estas biomoléculas se encapsulan ya sea dentro de las nanopartículas o conjugarse en la superficie de las nanopartículas y se liberan en el sitio de acción de los factores desencadenantes tales como el pH o la temperatura ^5,6. Aunque es extremadamente pequeño en tamaño, la gran superficie de estas nanopartículas resulta ser muy ventajoso para la administración dirigida de biomoléculas activas. El control sobre el tamaño de partícula y la biocompatibilidad es de suma importancia con el fin de optimizar la eficacia terapéutica y por lo tanto, la aplicabilidad de las nanopartículas ^7,8.Los lípidos ^9-13, polímeros, metales ^{14,15 16,17 18,19} y nanotubos de carbono se han empleado comúnmente como nanoportadores para diversas aplicaciones biomédicas y farmacéuticas.

Por otra parte, las aplicaciones nanotransportador basados ​​en nanoestructuras autoensambladas lípidos tienen una gran importancia en muchas otras disciplinas, incluyendo las industrias de cosméticos y alimentos ^20,21. Por ejemplo, se utilizan en la cristalización de proteínas ^22, la separación de biomoléculas ^23, como estabilizadores de alimentos, por ejemplo, en los postres ^24, y en la entrega de moléculas activas, tales como nutrientes, sabores y perfumes ^25-31. Nanoestructuras de lípidos autoensambladas no sólo tienen la capacidad de liberar moléculas bioactivas de una manera controlada y selectiva ^32-38 sino que también son capaces de proteger las moléculas funcionales de química y enzimática degradación ^39,40. Aunque bicapa planar fluido es el más commen nanoestructura formada por moléculas de lípidos anfifílicos en presencia de agua, otras estructuras tales como hexagonal y cúbica también se observan comúnmente ^20,41,42. El tipo de nanoestructura formada depende de la estructura de la forma molecular de los lípidos ', la composición de lípidos en agua, así como de las condiciones físico-químicas empleadas tales como la temperatura y la presión ^43. La aplicabilidad de nanoestructuras de lípidos no planas especialmente la de las fases cúbicas, está restringido debido a su alta viscosidad y la consistencia de dominio no homogénea. Estos problemas se superan mediante la dispersión de las nanoestructuras de lípidos en gran cantidad de agua para formar emulsiones que contienen micrómetro o partículas lipídicas de tamaño submicrónico de aceite-en-agua (O / W). De esta manera, un producto adecuado de baja viscosidad se puede preparar al tiempo que conserva la estructura auto-ensamblado de lípidos original dentro las partículas dispersas. La formación de estas partículas internamente autoensambladas (abreviado como ISAsomes ⁴⁴ Por ejemplo, cubosomas de fases cúbicas y hexosomes de fases hexagonales) requiere habitualmente una combinación de un paso de entrada de alta energía y la adición de estabilizadores tales como tensioactivos o polímeros. La investigación reciente en esta dirección demuestra la aplicación de diversas partículas sólidas ^45, incluyendo nanopartículas de sílice ^46, arcilla ^47-49 y nanotubos de carbono ⁵⁰ para la estabilización de emulsiones anteriormente mencionadas, adecuadamente denominado como Pickering ⁵¹ o emulsiones de Pickering ^Ramsden-52.

En los últimos años, el carbono nanoestructuras tales como nanotubos de carbono de pared simple (SWCNTs) con base, los nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNTs) y fullerenos han recibido una gran atención como nuevos biomateriales ^53,54. Las principales preocupaciones son su toxicidad ^{55-58, 59} insolubilidad en agua y por lo tanto su biocompatibilidad ^56. Una forma eficaz de hacer frente a estos problemas es la función de la superficielización utilizando moléculas no tóxicos y biocompatibles tales como lípidos. En presencia de agua, lípidos interactúan con CNTs de una manera que la superficie hidrofóbica de los CNT está protegido de medio acuoso polar mientras que los grupos de cabeza hidrófilos lípidos ayudar a su solubilidad o dispersión en agua ^60,61. Los lípidos son componentes integrales de orgánulos celulares, así como algunos materiales alimenticios, por lo tanto su decoración idealmente debería disminuir la toxicidad in vivo de los CNT. Aplicaciones biomédicas basadas independientemente en CNT ^18,19 y nanoestructuras lipídicas ^9-13 están en fase de desarrollo muy amplia, pero las aplicaciones que combinan las propiedades de los dos no están todavía bien explorado.

En este trabajo, empleamos dos tipos diferentes de lípidos y tres tipos de nanotubos de carbono de los cuales SWCNTs se presentan en forma prístina mientras que MWCNTs están funcionalizados con hidroxilo y grupos carboxílicos. Hemos utilizado concentraciones muy bajas de los CNT para preparar las dispersiones cuyosestabilidad depende de varios factores, por ejemplo, el tipo de lípido, el tipo de CNT, relación de lípido a CNT utilizado, así como de los parámetros de sonicación empleadas como la energía y la duración. Este protocolo de vídeo ofrece detalles técnicos de un método de estabilización de nanopartículas lipídicas cinéticamente utilizando diversos CNT-estabilizadores.

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Protocolo

Precaución: los nanotubos de carbono utilizados en este trabajo se presentan en forma de nanopartículas que puede tener riesgos adicionales en comparación con sus homólogos a granel. La inhalación de grafito, tanto naturales como sintéticos, puede causar neumoconiosis ⁶² similar a la neumoconiosis de los mineros del carbón. Por otra parte, ha habido preocupaciones relacionadas con la toxicidad de nanoestructuras de carbono basadas y algunos de los estudios anteriores sugieren toxicidad aguda y crónica asociada con la inhalación de CNTs ^63-68. Por lo tanto, evitar la inhalación del polvo fino CNT y manejarlo con mucho cuidado. Si es inhalado, trasladar al aire libre. Si la respiración es difícil, usar oxígeno puro en vez y buscar la consulta médica. Las formulaciones de solución / dispersión de los nanotubos de carbono son bastante seguro de manejar.

Precaución: Los lípidos y tensioactivos usados ​​en este estudio son materiales de calidad alimentaria y por lo tanto no peligrosos en general, pero son irritantes para los ojos y la piel, y también altamente inflamable. Por lo tanto, por favor utilice todas las prácticas de seguridad adecuadas, tales como el uso de la lineacontroles gineering (campana de humos) y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados) durante la manipulación o preparación de muestras de nanopartículas. En caso de contacto con la piel o los ojos, enjuagar inmediatamente la piel o los ojos con abundante agua durante al menos 15 minutos. Consultar a un médico si es necesario.

1. Preparación de lípidos Fases granel / agua

Precaución: Almacenar los lípidos en el refrigerador a 4 ° C. lípidos puros de grado no se deben almacenar en el congelador (-20 ° C). Alícuota en pequeños frascos de vidrio para evitar la contaminación de toda la población y la comodidad de manejo. Otros productos químicos, incluyendo los CNT y tensioactivos se pueden almacenar a temperatura ambiente, pero mantenerlos alejados de la luz solar directa.

1. Mantener los lípidos, es decir, Dimodan U (DU) y fitantriol (PT) a TA durante 15 a 20 min antes de abrir la botella / tapa vial con el fin de evitar la condensación de humedad.
   (Nota: el uranio empobrecido es un glicérido destilado que comprende 96% de monoglicéridos y laresto son diglicéridos y ácidos grasos libres. Dos componentes principales de monoglicéridos en DU son linoleato (62%) y oleato (25%). De ahí que la parte hidrofóbica de DU contiene principalmente cadenas C18 (91%), la composición exacta de los cuales es de la siguiente manera; C18: 2 (61,9%), C18: 1 (24,9%), y C18: 0 (4,2%), donde C18 de cadena indica 18C y el número después de colon indica el número de enlaces C = C. PT es una mezcla de isómeros ópticos 3,7,11,15-tetrametil-1,2,3-hexadecanotriol. No contiene un grupo funcional éster, pero se compone de cola phytanyl altamente ramificado con un grupo de cabeza tri-hidroxi. Ambos DU y PT formar fases cúbicas en presencia de exceso de agua, que es también el caso de los núcleos de las partículas lipídicas estabilizadas ^{13, 45).}
2. Fundir los lípidos poniendo los viales en un baño de agua caliente o un agua vaso que contiene mantenido por encima de 60 ° C (calentar agitador magnético: 230 V, 50 Hz, 630 W o similar para ser utilizado para calentar el agua en un vaso de precipitados).
3. Alternativamente viales de calor utilizando calentadores del bloque. No caliente el lípido que contiene los viales directamente en el plato caliente con el fin de evitar el gradiente de temperatura y la posterior descomposición de los lípidos.
4. Pesar 500 mg de lípido fundido, en tubo de microcentrífuga previamente pesado (con tapón de resorte cónico, 1,5 ml), usando una pipeta Pasteur de vidrio con un bulbo de látex.
5. Añadir 500 ml de agua ultrapura (agua resistividad = 18,2 mO · cm) al tubo de microcentrífuga anteriormente.
6. Mezclar los componentes de forma manual durante 15 minutos usando una espátula pequeña (a la medida). Hacer una espátula tales aplanando la punta de una aguja de jeringa (0,9 mm x 40 mm de longitud de la cánula) utilizando una pinza.
7. Centrifugar la mezcla de lípidos / agua durante 10 min a una velocidad de 2.000 x g. Una vez más la mezcla se agita manualmente durante 10 minutos, a continuación se equilibre durante 24 hr. Antes de la caracterización de las muestras, se revuelve durante 5 minutos y luego dejarlos a temperatura ambiente.
8. Para asegurar la formación de una fase de equilibrio de lípidos a lo largo de todo el tubo, realizar cerca de 10 ciclos de congelación-descongelación y inte rmittently llevar a cabo una etapa de centrifugación como se define anteriormente. Tanto la forma altamente viscosos fases lipídicas mayor de uranio empobrecido y PT por lo que es difícil de manejar manualmente (Figura 1).
   Nota: El protocolo anterior (sección 1) sólo es necesaria, si a uno le gustaría comparar el comportamiento nanoestructural (celosía tipo y las dimensiones del auto-ensamblaje) de partículas dispersas en la fase lipídica a granel y / o utilizarlo como un control para confirmar la retención de nanoestructura originales.

Figura 1. Preparación de la emulsión O / W de partículas con consistencia fluida de la fase lipídica altamente viscoso con el ingreso de energía alta (ultrasonidos) y el uso de diferentes CNT-estabilizadores, a saber SWCNT, MWCNT-OH, MWCNT-COOH (figura reproducido de la referencia [50] con el permiso de la Royal Society of Chemistry)._upload / 53489 / 53489fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparación de tensioactivo estabilizado de lípidos partículas

1. Preparar un 0,2% (w / w) tensioactivo (Pluronic F127) en agua.
   1. Disolver 200 mg de agente tensioactivo (polvo blanco esponjoso) en 100 ml de agua ultrapura por agitación durante 20 a 30 min (en una placa magnética usando una barra de agitador magnético). F127 Pluronic es un tensioactivo no iónico y se utiliza comúnmente como estabilizador de la emulsión. Es un copolímero de tribloques de PEO ₉₉ -ppo ₆₇ PEO _99, y por lo tanto lleva mucho tiempo para disolverse en agua.
2. Añadir 500 mg de DU fundido o PT (usando una pipeta Pasteur de vidrio) a un vial de vidrio (de centelleo de sosa-cal equipado con papel de tapa urea alineado, 20 ml).
3. Añadir 9,5 g de la solución F127 0,2%.
4. En la máquina de ultrasonidos de sonda, sujete firmemente el vial de la retorta se destacan la mandíbula (Réplica Montaje Stands conde pie, abrazadera, base, barra, caucho 3 de la mandíbula y nuez), de modo que pueda resistir las vibraciones generadas por sonicación.
5. Insertar la sonda de aleación de titanio sólido (13 mm de diámetro x 139 mm de longitud) unido a la célula Sonicator. Ajustar la altura y la posición del vial para asegurar que sus lados y el fondo no están en contacto con la sonda. A distancia de 0,5 cm entre la punta de la sonda y la parte inferior del vial de vidrio da buenos resultados.
6. Sonicar la mezcla durante 10 min en un modo pulsado con pulso 1 sec mediada por tiempo de retardo de 1 seg a 35% (del máximo) de potencia. El vial se calienta debido al calor generado durante la sonicación. Por lo tanto, deje que se enfríe a temperatura ambiente antes de tomarlo de la abrazadera.
7. Almacenar la dispersión lechosa formada a temperatura ambiente durante al menos 24 horas, antes de su uso posterior. Esto es para asegurar su estabilidad frente a la separación de fases.
   Nota: Antes y después de usar la sonda, limpiarla con acetona, se seca con una toalla de papel, y luego enjuagarlo con agua ultrapura unad secar una vez más.

3. Preparación de dispersiones de CNT en Pure Water

1. En dos vasos de precipitados separados, pesar en 4 mg en polvo MWCNT-OH y MWCNT-COOH, ambos de los cuales son de color negro.
2. Añadir 500 ml de agua ultrapura a cada vaso de precipitados. El uso de una sonda de ultrasonidos sonicar las mezclas de 2 min en un modo de pulso continuo a 40% (del máximo) de potencia. La concentración resultante de la dispersión MWCNT es de 8 mg / ml (solución madre).
3. Diluir la solución madre MWCNT con cantidades apropiadas de agua ultrapura para alcanzar 6,25, 5, 4, 2 g / dispersiones MWCNT ml.
4. Sonicar estas dispersiones como se ha descrito antes (véase 3.2).
5. Del mismo modo, dispersar a 3 mg de SWCNT en polvo (también de color negro) en 500 ml de agua ultrapura para hacer una dispersión de 6 mg / ml SWCNT (solución madre).
6. Diluir la solución SWCNT de valores y sonicar como se describe anteriormente (véase 3.2) para obtener 0,5, 0,4, 0,3125, 0,2 mg / ml dispe SWCNTrsions.
   Nota: Todas las dispersiones son transparentes durante aproximadamente 30 minutos, después de lo cual los nanotubos de carbono comienzan a asentarse en el fondo.

4. Preparación de estabilizado-CNT nanoestructurados Lipid partículas (Figura 1)

1. Pesar en 500 mg del DU fundido en un vial de vidrio.
2. Añadir 9,5 ml de la / ml dispersión SWCNT 6 g al vial.
3. Sonicar la mezcla de CNT-DU utilizando los mismos parámetros tal como se utiliza para la fabricación de dispersiones CNT puros (ver 3.2). Después de enfriar a RT, las partículas lipídicas estabilizadas-CNT con nanoestructura internamente auto-ensamblado conservado estarán listos.
4. De una manera similar, preparar las partículas lipídicas usando las dispersiones SWCNT 0,4 g / ml y 0,2 g / ml.
5. Siga los protocolos de 4.1 a 4.4 para que las partículas de lípidos utilizando MWCNT-OH y MWCNT-COOH pero utilizando diferentes concentraciones, a saber, 8, 4 y 2 mg / ml de CNT.
6. Del mismo modo, preparar tres dispersiones CNT-PT diferentes utilizando 4 mg / ml MWCNT-OH y MWCNT-COOH, Así como 0,4 g / ml SWCNT. Tenga en cuenta que las dispersiones CNT-PT requieren menos energía (35% del máximo), pero más tiempo (15 min) en un modo de impulso continuo. Enfriar las dispersiones a temperatura ambiente y dejarlos durante 24 horas antes de que los caracteriza.
   Nota: Los parámetros de sonicación pueden ser diferentes para diferentes lípidos (como por DU y PT aquí) y para diferentes composiciones; que necesitan ser optimizados para lograr dispersiones bien estabilizada.

5. Control de la estabilidad de las dispersiones estabilizadas de lípidos-CNT

1. Vigilar la estabilidad de las dispersiones mediante la observación visual: comprobar si se desestabilizan las dispersiones o si las protuberancias se han formado en las dispersiones.
2. Tomar fotos (con cámara digital) a intervalos regulares. Por ejemplo, tomar fotografías de dispersiones de todos los días en la primera semana, a continuación, cada dos días durante una semana seguida de una vez a la semana durante las próximas dos semanas, y finalmente una vez al mes según el requisito.

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Resultados

Los siguientes resultados representan a) la estabilidad de las dispersiones, b) la distribución de tamaños de partículas lipídicas, c) el tipo de auto-ensamblaje y d) Las pruebas para el revestimiento de lípidos de la CNT. La estabilidad de las dispersiones (Figura 2) se controló utilizando una cámara de 5 MP con enfoque automático y flash LED.

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Discusión

La estabilización de las partículas lipídicas
Tres CNTs diferentes se utilizan para estabilizar las dispersiones de lípidos; dos de los cuales son de múltiples paredes y funcionalizado usando -OH y grupos -COOH, y uno es único con funcionalidad no amurallado y (virgen). La CNT variar en tamaño como sigue (diámetro x longitud): MWCNT-COOH: 9,5 nm x 1,5 m; MWCNT-OH: 8-15 nm x 50 micras; SWCNT: 1-2 nm x 1-3 micras. Los nanotubos de carbono en polvo se dispersaron en agua por la sonda ultra-s...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimodan U	Danisco	15312	Store at 4 °C. Non-hazardous. Irritant to eyes and skin.
Phytantriol (> 95%, GC)	TCI Europe N.V.	P1674	Store at 4 °C. Non-hazardous. Irritant to eyes and skin.
Single walled Carbon Nanotubes (90%)	Nanostructured & Amorphous Materials, Inc.	1246YJS	Store at room temperature. Away from direct light. Irritating to eyes, skin and respiratory system.
Multi-walled carboxylic acid functionalized Carbon Nanotubes (> 80% Caron basis, > 8% carboxylic acid functionalized)	Sigma-Aldrich Co. LLC	755125	Store at room temperature. Away from direct light. Causes serious eye irritation. May cause respiratory irritation.
Graphitized Multi-walled hydroxy functionalized Carbon Nanotubes (99.9%)	Nanostructured & Amorphous Materials, Inc. (NanoAmor)	1224YJF	Store at room temperature. Away from direct light. Irritating to eyes, skin and respiratory system.
Pluronic F127	Sigma-Aldrich Co. LLC	P2443	BioReagent, suitable for cell culture. Not a hazardous substance or mixture. Store at room temperature.
Acetone (99.5%)	Fisher Scientific	10134100	Highly flammable liquid. Causes serious eye irritation. May cause drowsiness or dizziness.
Jars with loose, enfolding lids (375 ml)	VWR International Ltd	216-3308
Beaker, 1,000 ml	Fisher Scientific	12942161	heavy duty, low form, with spout and graduations
Pasteur glass pipette (150 mm length) with latex bulb	Fisher Scientific	10006021
Microcentrifuge tube conical snap cap 1.5 ml	Fisher Scientific	11558232
Spatula	Fisher Scientific	11352204
Heating magnetic stirrer	Fisher Scientific	11715704
Magnetic stirrer bars (cylindrical, opaque PTFE, 30 mm x 7 mm (l x diameter))	Fisher Scientific	10011792
Needle (0.9 mm x 40 mm cannula length)	Terumo UK Ltd	MN-2038MQ
Retort Stand Set - With stand, clamp, base, rod, rubber 3 jaw and bosshead	Camlab Ltd, UK	1177157
Millipore water equipment	Barnstead Nanopure, Thermoscientific, USA
Progen Genfuge 24D Digital Microcentrifuge	Progen Scientific	C-2400
Probe ultra-sonicator, with 13 mm	SONICS, Vibracell,  USA
5 MP camera with auto-focus and LED flash	Samsung Galaxy Fame Mobile camera
Raman Spectrometer	Horiba Jobin-Yvon LabRAM HR800 spectrometer
Mastersizer 3000	Malvern Instruments Ltd, Malvern, United Kingdom
Small angle X-ray scattering (SAXS)	SAXSpace camera (Anton Paar, Graz, Austria), X-ray generating equipment (ISO-DEBYEFLEX3003, GE Inspection Technologies GmbH), closed water circuit (Chilly 35, HYFRA, Germany).