Cuantificación de Cerebral Vascular Arquitectura utilizando microscopía de dos fotones en un modelo de ratón de la neuroinflamación inducida por el VIH

Resumen

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Resumen

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

Introducción

Virus de Inmunodeficiencia Humana 1 (VIH-1) invade el cerebro durante la fase aguda de infección por el virus, e infecta productivamente ambos microglia y macrófagos residentes del cerebro, lo que conduce a su activación - y la liberación de ambos mediadores inflamatorios derivados del huésped y soluble VIH-1 virotoxins tales como Tat y gp120 (revisado en ^1,2). Como consecuencia, un estado neuroinflamatoria crónica se establece en el SNC, que se cree que contribuyen a la patogénesis del VIH-1 Trastornos neurocognitivos asociados (mano) ^3-5.

La sobreexpresión crónica del VIH-1 Tat o interleucina (IL) -17A dentro del SNC de ratones se ha demostrado que resulta en microvascular rarefacción ^6,7. Esto plantea la posibilidad de que la neuroinflamación crónica puede contribuir a la patogénesis de la mano a través de efectos sobre la vasculatura cerebral. Con el fin de examinar más a fondo esta cuestión, hemos desarrollado métodos para cuantificar estruc vasculares cerebralesturas.

Este documento describe un método para cuantificar el número de nodos capilares, segmentos capilares, significa la longitud del segmento, la longitud total del segmento, diámetro medio capilar, y volumen total capilar utilizando imágenes in vivo de las redes capilares a través de una ventana cortical cráneo delgado (modificado a partir descrito previamente protocolos) ^8,9, así como ex vivo de imágenes de secciones de cerebro, usando microscopía de dos fotones. Este enfoque combinado proporciona una cuantificación global de los parámetros vasculares cerebrales, ya que la fina calavera ventana cortical in vivo permite la preservación del medio ambiente cerebral, mientras que ex vivo de imágenes de las redes capilares en rodajas de cerebro permite la reconstrucción de completo, en tres dimensiones redes capilares - que luego puede cuantificarse utilizando software disponible comercialmente.

Protocolo

La Universidad de la Universidad de Rochester Comité de Recursos Animal aprobó todos los procedimientos realizados en este trabajo.

Preparación 1. Pre-quirúrgica (y ratones)

1. Prepare el área quirúrgica con todo el equipo necesario. Esterilizar todos los instrumentos utilizados durante el procedimiento de antemano el uso de 70% de etanol. Opcionalmente, utilice un esterilizador de vidrio perla o autoclave para esterilizar las herramientas.
2. Coloque el ratón en una cámara de inducción isoflurano conectado a un vaporizador de isoflurano. Establecer niveles de isoflurano a 4% a una velocidad de 1 L / min.
   Nota: para los experimentos aquí, ratones con doxiciclina (DOX) inducible transgén VIH-1 Tat impulsado por la proteína glial fibrilar específico de astrocitos (GFAP) promotor (VIH Tat-ratones Tg) ¹⁰ se utilizaron para examinar el efecto del VIH -1 neuroinflamación en la estructura vascular cerebral inducida, como se describió previamente ^7,10.
3. Inclinar suavemente la cámara de inducción para observar el ratón y# 39; s reflejo de enderezamiento. Una vez que el reflejo de enderezamiento se ha suprimido, establecer el nivel de isoflurano al 2% y redirigir el flujo de aire de la cámara de inducción al cono de la nariz en el banco quirúrgica.
4. Mueve rápidamente el ratón desde la cámara de inducción al agua infundida almohadilla térmica. Continúe aplicando isoflurano (1,5-2%) a través del cono de la nariz. Ajuste la anestesia según la tolerancia individual del ratón evaluado a través de la frecuencia respiratoria (RR) de supervisión.
   Nota: La depresión de RR puede perturbar los parámetros de gas fisiológicos que alteran el flujo sanguíneo cerebral y la evaluación diámetro del vaso. Intente mantener RR entre 55-65 respiraciones por minuto. La frecuencia cardíaca (HR) también se puede utilizar evaluar profundidad de la anestesia; mantener HR entre 300-450 latidos por minuto para evitar cambios fisiológicos a diámetro del vaso. Típicamente, la anestesia será adecuada entre 1.5-2.0% de isoflurano a 1 L / min para un ratón dado.
5. Realice una pizca dedo para comprobar aún más la profundidad de la anestesia. Si el ratón no responde, commEnce los procedimientos quirúrgicos.

2. Preparación de la ventana craneal Thin-cráneo

1. Aplicar gel de lágrimas artificiales a los ojos del ratón. Eliminar completamente el cabello desde el cuero cabelludo del ratón usando tijeras o una máquina de afeitar eléctrica.
2. Esterilizar el cuero cabelludo mediante la aplicación de solución de povidona yodada; dejar secar. Luego, con un microscopio óptico, quite la piel del cuero cabelludo del ratón, exponiendo completamente los huesos parietales, los huesos frontales caudales, y marcado bregma.
3. Aplicar una pequeña cantidad de una solución de cloruro férrico al 10% en el cráneo con el fin de secar las membranas para una fácil extracción. Retire las membranas secas con el # 5/45 fórceps raspando suavemente el cráneo.
4. Aplique una capa fina de pegamento alrededor de la ventana placa cabecera. Presione suavemente la placa cabecera contra el cráneo del ratón, manteniendo el área de interés en el centro de la ventana. Aplicar una gota de cemento dental a la placa cabecera para polimerizar el pegamento.
5. Aplique una capa finade pegamento a lo largo del borde de la ventana placa cabecera para crear un depósito en el que para mantener la solución salina. Una vez que el pegamento se haya secado, atornillar la placa superior en el arnés placa cabecera ratón.
   Nota: el arnés placa cabecera del ratón utilizado en este procedimiento es una estructura con una base de metal y dos columnas metálicas. En cada columna hay un resorte y una tuerca de mariposa. La placa superior se coloca en la parte superior de la primavera, y la tuerca de mariposa se aprieta hasta que la cabeza esté nivelado y no se mueve.
6. Retire cualquier pegamento de la ventana de placa cabezal con una broca unido a un taladro MicroTorque fijado en 6.000 rpm. Deje de cada 10 a 15 segundos para evitar el sobrecalentamiento del cráneo del ratón que puede resultar en daños estructurales en los vasos.
   1. Usando una broca nueva, colocar el taladro de 1,5 mm MicroTorque lateralmente desde la línea media (un tercio del diámetro de la ventana placa cabecera). Comience a enrarecer el cráneo alrededor de esta ubicación a 4.000 rpm. Mueva el taladro suavemente a través del cráneo sin presión a la baja directa.
   2. Dril Ceseling cada 10 a 15 segundos para evitar el sobrecalentamiento del cráneo del ratón. Durante este tiempo, retirar el polvo acumulado cráneo usando un bote de aire comprimido.
   3. Use gotas de solución salina RT enfriar cráneo durante 5-10 seg. Retire con cuidado todo el líquido con un paño suave para continuar adelgazamiento cráneo.
7. Para el adelgazamiento final del cráneo, colocar un pequeño volumen de solución salina en el depósito de placa superior y ligeramente barrer un microcuchilla dental sobre el área de interés hasta los vasos pequeños son claramente visibles.

3. vigilancia de parámetros fisiológicos

1. Una vez que el cráneo está completamente adelgazado, separar el ratón del soporte y colóquelo en la espalda. Cinta suavemente ambas patas traseras para exponer claramente los muslos mediales.
2. Quite el pelo sobre ambos muslos mediales con unas tijeras o una máquina de afeitar eléctrica. Desinfectar la zona quirúrgica cubriendo los muslos con povidona yodada.
3. Pellizcar la piel en el muslo medial justo encima de la vena femoraly la arteria utilizando el # 5 fórceps. Tire suavemente la piel hacia arriba y usar las tijeras para cortar y quitar la piel.
   Nota: el muslo izquierdo está reservada en caso de complicaciones quirúrgicas (anomalías vasculares, los vasos rotos).
4. Aplicar aproximadamente 3-5 gotas de 0,9% de solución salina al sitio quirúrgico. Esto permite una mayor ampliación de los vasos, así como mantener el sitio hidratada y prevenir el secado de los vasos. Separar la vena femoral de la arteria por rodeos disección en el paquete neurovascular femoral utilizando dos # 5/45 fórceps.
5. Coloque dos, 3 piezas cm de sutura quirúrgica por debajo de la arteria femoral aproximadamente 1 cm de distancia. Gire la sutura hacia la derecha superior para crear un torniquete vascular que le ayudará a prevenir la pérdida excesiva de sangre durante el cateterismo.
6. Hacer una pequeña incisión en la arteria femoral con las tijeras de primavera. Colocar el catéter en la arteria a través de la incisión y avance hasta que el catéter es de forma segura dentro de la arteria.
7. desenroscar la sutura superior (torniquete) para evaluar si hay fugas y la colocación del catéter adecuado. Asegurar el catéter en la arteria femoral mediante la vinculación de dos nudos alrededor del catéter dentro del vaso utilizando las suturas.
8. Inyectar 10 l de heparina (100 UI / ml) a través del catéter para evitar la coagulación de la sangre. A continuación, cierre quirúrgicamente el muslo derecho cosiendo la piel junto con una sutura de 4-0 en un patrón interrumpido simple.
9. Inyectar 50 l de uretano (1,2 mg / g) por vía intraperitoneal en el cuadrante inferior derecho. Cinco minutos más tarde repetir con otra inyección de 50 l para el cuadrante inferior izquierdo para un total de 100 l de uretano intraperitoneal. Poco a poco reducir los niveles de isoflurano a aproximadamente 0,25%, mientras que concomitantemente volver a controlar el ratón por la profundidad de la anestesia.
   Nota: Mantenga la aguja superficial dentro de la cavidad peritoneal a lo largo de la pared abdominal posterior de modo que no perforar el intestino. Esto se puede lograr por pellizcar la mu recto abdominalscles lejos de las vísceras y luego inyectar.
10. El uso de un tubo capilar, recoger una muestra de 40 l de sangre arterial del catéter. Una el catéter hasta el transductor de presión sanguínea equipado con una llave de paso de cuatro vías lleno de solución salina y la jeringa llena de heparina.
11. Tape el transductor de presión de sangre al aparato quirúrgico para evitar la eliminación no intencionada la del catéter. Comience el monitoreo de la presión arterial media.
12. Inserte el tubo capilar de la sangre llena en un puerto de entrada analizador de gases en sangre. Una vez que toda la sangre se ha extraído, retire el tubo capilar desde el puerto de entrada. Las juntas ₂ y CO ₂ niveles de gases en sangre van a aparecer en un papel impreso desde el analizador de gases en sangre.

4. La inyección del colorante fluorescente

1. Pellizcar la piel en el muslo medial izquierda utilizando el # 5 pinzas. Tire suavemente la piel hacia arriba y usar las tijeras para cortar y quitar la piel. Preparar dextrano roja colorante rodamina emisor conjugado(70 kDa) (10 mg / kg disueltos en solución salina).
2. Localizar la femoral vein.Using una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G adjunto, dibujar una solución previamente preparada de un colorante fluorescente apropiado para formación de imágenes a la línea de 130 l de la jeringa. Eliminar todas las burbujas de aire dibujando el tinte completamente en la jeringa y agitando firmemente la pared de la jeringa.
   1. Doble el 30 G aguja en un ángulo de aproximadamente 30 grados presionándolo contra una superficie dura lado bisel hacia arriba. Llene la aguja con el tinte y deseche cualquier exceso de líquido, dejando una muestra de 100 l.
3. Se inyecta la muestra de 100 l de tinte lentamente en la vena femoral. Después de retirar la aguja, aplique firme, suave presión en el lugar de la inyección para detener cualquier sangrado. Permitir que el colorante circule durante 5 min.
   Nota: como alternativa, la vena femoral derecha se puede utilizar en lugar de la inyección tinte fluorescente para evitar una mayor pérdida de sangre a través de la creación de otro sitio quirúrgico. Además, si elanimales está sangrando sin control desde el sitio quirúrgico, esto puede ser una indicación de que el exceso de heparina fue dado a enjuagar el catéter. Si no hay coagulación dentro de 10-15 min y el ratón sigue sangrando, considere reiniciar el experimento con un nuevo ratón.
4. Cierre el muslo izquierdo cosiendo la piel junto con una sutura de 4-0, y luego la vuelta con cuidado el ratón sobre su estómago, y lo coloca en el arnés placa cabecera ratón.

5. En Vivo De dos fotones de imágenes

1. Mueva el aparato quirúrgico para el microscopio de dos fotones, asegurándose de mantener los niveles de anestesia continuas. Colocar una pequeña cantidad de 0,9% de solución salina en el depósito de placa cabecera y bajar el objetivo de microscopio de manera que entra en contacto con la solución salina. Localice el área de interés con el objetivo de campo claro de visión
2. Ajuste el láser de excitación de dos fotones a una longitud de onda apropiada para el colorante fluorescente. Comience la imagen de dos fotones usando el 25x objetivo.
   Tenga en cuenta que en estos experimentos se utilizó un dextrano conjugado con un emisor de tinte rojo rodamina que estaba emocionado a una longitud de onda de 780 nm. A 607/36 de paso de banda filtro de emisión para detectar la fluorescencia a partir del colorante, y un filtro de emisión de paso de banda 480/20 se utilizó para detectar la autofluorescencia arterial
3. Busque un capilar cama en la pantalla de la vista, y ampliar esta área se utiliza el zoom 2. Adquirir imágenes ópticas de los capilares utilizando el software de imagen de dos fotones.
4. Después de las imágenes es completa, sacrifica el ratón por dislocación cervical seguido por decapitación.

6. Ex Vivo en dos fotones de imágenes

1. Usando las tijeras finas extra, hacer una incisión en el cuero cabelludo de los huesos interparietales a los huesos frontales del ratón. Fije la piel a los lados del cráneo con el dedo índice y el pulgar.
2. Coloque las tijeras finas adicionales debajo del hueso interparietal medial y cortar el cráneo a lo largo de la sutura sagital. Deje de cortar el cráneo de aproximadamente 3 mm después de marcar el bregma.
   Nota: Aplicar presión al alza al cortar el cráneo para evitar cortar el cerebro.
3. Usando los fórceps # 5, separar el cráneo desde el cerebro y cuidadosamente eliminar cualquier meninges desde la superficie del cerebro. Meninges restantes pueden lacerar accidentalmente el cerebro; extrema se debe tener cuidado para evitar esto. Deslice suavemente los # 5 fórceps debajo del cerebro avanzando lentamente hacia adelante hasta que el cerebro está libre de cráneo.
   Nota: presión hacia abajo que se debe utilizar con el fin de evitar perforar el cerebro.
4. Coloque el cerebro en una herramienta de cerebro de seccionamiento específico para ratones. Lavar el cerebro mediante la aplicación de gotas de líquido cefalorraquídeo artificial sobre el cerebro.
5. Eliminar una sección coronal 2 mm de cerebro de bregma 0 a bregma -2. Coloque la sección coronal en un portaobjetos de vidrio cóncava que contiene líquido cefalorraquídeo artificial con el bregma 0 (la mayoría parte craneal de la sección) mirando hacia arriba. Cubrir suavemente el sl cerebrohielo con una hoja de cubierta de vidrio.
   Nota: Evite presionar el vidrio una vez colocado en la sección del cerebro, ya que puede deformar la arquitectura vascular.
6. Transferir la diapositiva a la platina del microscopio y colocar una pequeña cantidad de solución salina 0,9% en la hoja de la cubierta. Bajar el objetivo de microscopio hasta que entra en contacto con la solución salina. Busque la línea media del cerebro utilizando el objetivo de campo claro.
7. Comience la imagen de dos fotones y localice la línea media de nuevo utilizando el objetivo 25x. Lograr esto mediante la búsqueda de la fisura longitudinal en la superficie cortical de la sección coronal. Coloque el borde derecho de la pantalla de imágenes en la línea media y mover la pantalla del visor sobre lateralmente de tres fotogramas completos (aproximadamente 1,5 mm de la línea media).
   Tenga en cuenta que en estos experimentos, los parámetros de imagen eran idénticas a las mencionadas en la nota en el paso 5.2.
8. Busque la profundidad a la que los capilares son apenas visibles en la pantalla de vista. Baje el plano de enfoque un adicional de 20m para determinar la parte superior de la z-pila.
9. Ajuste el espesor imagen para 1 micras. Baje la pantalla de vista de 100 micras y ajustar la potencia del láser a lo largo de tal manera que menos del 1% de los píxeles son sobresaturado.
   Nota: las imágenes z-stack se compilan a partir de una serie de 100 500x500x1 consecutivo imágenes micras. Cuanto mayor sea el z-stack más precisos serán los cálculos de procesamiento posterior será. En general, intentar cobrar un z-pila de 100 micras o más grandes.
10. Pulse el icono XY Repita seguido por el icono XY adyacente. Una vez que el z-pila está completa, pulse el icono de la Serie Hecho y guarde el archivo.

7. Tratamiento de datos

1. Abra una imagen capilar en vivo en el software ImageJ. Establezca manualmente el píxel de relación a distancia basada en los valores obtenidos a partir del software de dos fotones.
   1. Seleccione la recta * * icono en el menú de herramientas. Dibuja una línea que se extiende desde una pared capilar a la opositio de la pared capilar, y registrar la longitud proporcionada por ImageJ.
      Tenga en cuenta que puede ser necesario para hacer un zoom en la imagen con el fin de visualizar claramente los bordes de las paredes de los capilares.
   2. Repita el paso 7.1.1 en diferentes lugares a lo largo del capilar, así como para múltiples capilares en la imagen.
2. Abra el archivo z-stack en el software de análisis como Amira. Seleccione el icono de Filamento Editor de la barra de herramientas de sub-aplicación
   1. Ajuste el espesor espectador a aproximadamente 20. Mover al espectador a la parte superior o inferior de la z-stack.
   2. Seleccione el icono de rastreo y mueva el cursor sobre la imagen cargada. Coloque los nodos en los capilares en los lugares descritos en la Figura 2C; segmentos aparecerán automáticamente entre nodos adyacentes. Seguir la pista a lo largo de la totalidad de los capilares z-pila.
      Nota: será necesario colocar nodos en entre los puntos finales y los puntos de ramificación con el fin de rastrear los capilares thrOughout el z-stack.
   3. Para eliminar estos nodos, haga clic en el icono Intermedio Quitar.
      Nota: Esto puede crear segmentos de bucle erróneas que se deben quitar manualmente seleccionando el bucle usando el icono Seleccionar único y, a continuación, seleccionar el icono Eliminar Seleccionados. Si bucles siguen apareciendo en la misma zona durante el rastreo, es probable que los nodos se colocaron en diferentes capilares.
   4. Una vez que el trazado se completa, seleccione el icono Gráfico información para abrir una hoja de cálculo que contiene los parámetros vasculares extraídos automáticamente. El número de nodos y segmentos están disponibles en la pantalla de vista principal.

Resultados

La ventana cortical-cráneo delgada permite imágenes in vivo de dos fotones de capilares corticales (Figura 1). Un área adecuada para imagen muestra numerosos capilares, distintas (Figura 1A). En el mismo campo de visión, no hay ninguna pared celular arterial autofluorescencia, y pueden existir otras señales fluorescentes, tales como fluorescencia inducida por colágeno, segunda generación de armónicos ¹¹ (Figura

Discusión

El método aquí descrito se puede aplicar para analizar estructuras microvasculares del cerebro en una amplia gama de modelos experimentales / ajustes. Para el éxito de este método, tres pasos críticos deben ser dominadas. En primer lugar, la ventana-cráneo delgada no debe dañar el cráneo o el cerebro subyacente. Es fácil de perforar el cráneo durante el adelgazamiento, o causar inducida por calor de fuga vascular. Esto puede interferir con la imagen como el colorante fluorescente se escapará en el plano de en...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica Microscope	Leica Inc.	MZ8
High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner	180
Heating Pad	Stryker	TP3E
T/PUMP	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer	Datex Ohmeda	447
Artificial Tear Gel	Butler AHS	7312
Povidone-Iodine solution	Aplicare	52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Ferric Chloride Solution	Ricca Chemical Company	3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel	Henkel	45404
Dental Cement	Stoelting	51459
Microtoruqe II Handpiece Kit	Pearson Dental	R14-0002
005 Burr for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05
Norland Blade (Dental Microblade)	Salvin Dental	6900
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Group 2B Carcinogen
Braided Suture	Ethicon	735G
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Arterial Catheter	SAI Infusion Technologies	MAC-01	The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.
Blood Pressure Moniter	World Precision Intruments	SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable	World Precision Intruments	BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer	Siemens	248
40 μl Capillary Tube	VWR	15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)	Invitrogen	D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Spectra-Physics
ImageJ Software	National Institutes of Health (NIH)		Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software	Visage Imaging