El uso de un de varios compartimentos dinámico sola enzima fantasma de Estudios de hiperpolarizados Agentes de Resonancia Magnética

Resumen

A multi-compartment dynamic phantom is used to simulate some biology of interest for metabolic studies using hyperpolarized magnet resonance agents.

Resumen

Imaging de sustratos hiperpolarizados por resonancia magnética muestra una gran promesa clínica para la evaluación de los procesos bioquímicos críticos en tiempo real. Debido a las limitaciones fundamentales impuestas por el estado hiperpolarizado, se utilizan comúnmente las técnicas de imagen y de reconstrucción exóticos. Se necesita con urgencia un sistema práctico para la caracterización de los métodos de imagen, multiespectrales dinámicas. Dicho sistema deberá referirse de forma reproducible la dinámica químicos correspondientes de los tejidos normales y patológicos. El sustrato más ampliamente utilizado hasta la fecha se hiperpolarizado [1- ¹³ C] piruvato para la evaluación del metabolismo del cáncer. Se describe un sistema de espectro a base de enzimas que media la conversión de piruvato a lactato. La reacción se inicia por la inyección del agente hiperpolarizado en múltiples cámaras dentro del fantasma, cada uno de los cuales contiene concentraciones de los reactivos que controlan la velocidad de reacción que varían. Múltiples compartimentos son necesarios para asegurar que imasecuencias ging fielmente capturar la heterogeneidad espacial y metabólica de los tejidos. Este sistema ayudará al desarrollo y la validación de estrategias avanzadas de imagen, proporcionando dinámica química que no están disponibles a partir de fantasmas convencionales, así como el control y la reproducibilidad de que no es posible en vivo.

Introducción

El impacto clínico de la resonancia magnética hiperpolarizado (IRM) de ¹³ compuestos marcados-C es críticamente dependiente de su capacidad para medir las tasas de conversión química a través del tiempo real de la espectroscopia de resonancia magnética y espectroscopia de imagen ^1-5. Durante el desarrollo de la secuencia y de verificación, la conversión dinámica química se consigue generalmente a través de in vivo o en modelos in vitro ^{de 6-9} que ofrecen un control limitado y reproducibilidad. Para la prueba robusta y garantía de calidad, se prefiere un sistema más controlado que preserva la conversión química endémica de esta medición. Describimos un método para lograr esta conversión de manera reproducible usando un fantasma dinámica sola enzima.

La mayoría de los estudios con ¹³ agentes ^de C hiperpolarizados se centran en la obtención de imágenes sustratos hiperpolarizados en un entorno biológico de funcionar. Esta es la opción obvia si el objetivo es el estudio biológicoAl procesa o determinar el potencial de impacto en la atención clínica. Sin embargo, si se desea caracterización de algún sistema de medición o de datos algoritmo de procesamiento, los modelos biológicos tienen numerosos inconvenientes tales como la variabilidad espacial y temporal inherente ^10. Sin embargo, fantasmas estáticos convencionales carecen de la conversión química que impulsa el interés clínico primario en MRI de sustratos hiperpolarizados, y no se pueden utilizar para caracterizar la detección de tipos de conversión o de otros parámetros dinámicos ^11. El uso de un sistema enzimático único que podemos proporcionar conversión química controlable y reproducible, lo que permite un examen riguroso de las estrategias de formación de imágenes dinámicas.

Este sistema está dirigido a los investigadores que están desarrollando estrategias de imagen para sustratos hiperpolarizados y desean para caracterizar el rendimiento de comparación con enfoques alternativos. Si las mediciones estáticas son el punto final deseado y estática ¹³ metabolito C-labled fantasmas will suficiente ^11. En el otro extremo, si caracterización biológica más compleja es crítica para el método (entrega, la densidad celular, etc.), entonces se necesitan modelos biológicos reales ^12-14. Este sistema es ideal para la evaluación de estrategias de imagen que tienen como objetivo proporcionar una medida cuantitativa de las tasas de conversión química aparentes.

Protocolo

NOTA: (Phantom Diseño) Dos cámaras de 3 ml fueron mecanizadas de Ultem y equipados con tubo de PEEK (1,5875 mm de diámetro exterior y 0,762 mm de diámetro) para inyección y escape. Las cámaras se colocan en un tubo de centrífuga de 50 ml llena de agua (Figura 1). Para evitar vacíos de señal creados por las burbujas, las cámaras y las líneas fueron precargada con agua desionizada _(dH2O).

1. Preparación de la solución

1. Preparar la solución tampón 1 L (81,3 mM Tris pH 7,6, NaCl 203,3 mM). Pesar 11,38 g de cristales de Trizma preestablecidos pH 7,6 y 11,88 g de NaCl y se disuelven en 1 l de _dH2O
2. Preparar la solución de 50 mM de NADH. Pesar 17,8 mg de la sal de dipotasio β-nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), reducida y disolver en 280 l de la solución tampón que se preparó en el paso uno.
3. Preparar 250 solución U / ml de enzima. Pesar 78,75 unidades de actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) y disolver en 315 l de tampón de sTEP uno.
4. Preparar la mezcla de ácido pirúvico. Pesar 21,4 mg Ox063 radical tritilo y se disuelven en 1,26 g (~ 1 ml) [1- ¹³ C] de ácido pirúvico.
5. Preparar medios de disolución (40 mM Tris pH 7,6, NaOH 40 mM, EDTA 0,27 mM y NaCl 50 mM). Pesar 5,96 g de Trizma cristales preestablecidos pH 7,6, 1,6 g de NaOH, 0,1 g de ácido etilendiaminotetraacético deshidratado sal disódica (EDTA) y 2,9 g de NaCl y se disuelven en 1 L de dH ₂ O.
6. Preparar 1:10 solución gadoteridol (50 mM). Mezclar 1 l de gadoteridol en 9 l de _dH2O Preparación de 8 M ^[13 C] urea. Pesar 1,465 5 ^[13C] urea y se disuelven en 3 ml _{de dH2O}

2. Preparación de piruvato hiperpolarizado

1. En una copa de muestra para un sistema dinámico Nuclear de polarización (DNP), pipeta 0,3 l de la solución gadoteridol y 13 mg (~ 10 l) de la solución de ácido pirúvico.
2. Brevemente agitar esta mezcla en el vaso de muestra con la punta de la pipeta.
3. Insertar la muestra en el sistema de DNP.
   1. Asegúrese de que la puerta para el sistema de DNP está cerrada. Comience el proceso de inserción de muestra haciendo clic en el botón de muestra de inserción en la consola del sistema DNP. En el asistente muestra selecta muestra normal y pulse siguiente.
   2. Mantener la copa de muestra vertical, coloque suavemente la varilla de inserción sobre la parte superior de la copa de muestra. Cuando se le solicite, abra el sistema DNP e insertar la copa en el inserto de temperatura variable (IVT), utilizando la varilla de inserción.
   3. Tire del émbolo en el extremo de la varilla de inserción de la muestra para liberar la muestra en el índice de temperatura variable. Retire la varilla de inserción de muestra del sistema y haga clic en el siguiente botón de la consola del sistema DNP.
4. Iniciar la polarización.
   1. Haga clic en el botón de inicio de polarización en la consola del sistema DNP. En el RINMR tipo de software .HYPERSENSENMR para poner en marcha un software de control de polarización. Establecer la acumulación de configuración a 1 y pulse Enter. A continuación, haga clic en construcción sólida up.
   2. Establecer la ubicación y el nombre del archivo de salvar. Seleccione el perfil para el 13-C en la pestaña desplegable en la consola del sistema DNP abajo y haga clic en siguiente. Marque la casilla para degustar durante la preparación, establecer el tiempo de la muestra a 300 segundos y haga clic en Finalizar.
5. Medir 3,85 g (~ 4 ml) de los medios de disolución ya sea por volumen con una jeringa de 5 ml o en peso utilizando una escala.

3. Preparación de la enzima Phantom

1. Llenar un tubo de microcentrífuga con ~ 3 ml de solución de urea ^[13C] y lo coloca en el tubo de centrífuga de 50 ml. Llenar el tubo de centrífuga de 50 ml con _dH2O
2. Pre-llenar las dos cámaras de la enzima y las líneas con dH ₂ O mediante la inyección de ~ 3 ml dH ₂ O en las líneas de inyección del fantasma, teniendo cuidado de eliminar cualquier burbuja de formados.
3. Coloque el fantasma en el centro del imán con fácil acceso a las líneas de inyección. Asegúrese de que hay algún recipiente para recoger el líquido que va a ventilar en t que la línea de escape.
4. Preparar la mezcla de enzimas de alta actividad (mM NADH 17.14, 44.57 U / ml LDH). Mezclar 240 l solución de NADH, solución de LDH 125 ly 335 l de tampón y mantenerse en una jeringa de 3 ml que se puede conectar a la línea de inyección.
   NOTA: una vez en combinación con los 500 l de piruvato 40 mM del sistema de DNP, el volumen fantasma final será de 1,2 ml con concentraciones de piruvato 16,7 mM, NADH 10, y 26 U / L LDH en una solución tris tamponada con pH ~ 7.5.
5. Preparar la mezcla de enzimas baja actividad (17,14 mM NADH 26.79 U / ml LDH) Mezclar 240 l solución de NADH, solución de LDH 75 ly 385 l de tampón y guardar en un separada jeringa de 3 ml que se puede conectar a la línea de inyección.
   NOTA: una vez en combinación con los 500 l de piruvato 40 mM del sistema DNP el volumen fantasma final será de 1,2 ml con concentraciones de piruvato mM 16,7 mM, NADH 10, y 15.625 U / L LDH en una solución tris tamponada con pH ~ 7,5 .

jove_title "> 4. Ejecutar cualquier Garantía de Calidad (QA) y escaneos de posicionamiento

1. posicionamiento inicial.
   1. Cargar una nueva búsqueda de posicionamiento flash en modo de operación ^[1H] modo de volumen TX / RX. Cambiar creados dimensiones a 2: Herramienta de control Espectrómetro -> Editar GS -> Configuración - Dimensiones> 2. Pulse SGP sobre el control del espectrómetro y mover fantasma hasta centrada en el imán. Presione STOP y luego pulse GOP sobre el control del espectrómetro.
2. Scan piloto.
   1. Cargar una nueva búsqueda de posicionamiento TriPiolt en el modo de operación ^[1H] modo de volumen TX / RX. Posición de la rebanada: Scan Control -> División Herramientas-> mover las rebanadas (mantenga M pulsación de la tecla y arrastre; Seleccionar sector para moverse con el deslizador paquete rebanada).
   2. Bobina bamboleo ^1H: Herramienta Espectrómetro de control -> Acq -> bamboleo. Tune y el partido ¹ bobina H detrás del imán y pulse STOP. Mientras mantiene la tecla de mayúsculas pulse el semáforo de la ventana de control de análisis.

5. Configuración radial eco planar de exploración de imágenes espectrales

1. Cargar una imagen espectroscópica ecoplanares nueva radial (radEPSI) escanear en modo de funcionamiento ^[13C] modo de volumen TX / RX. Posición de la rebanada: Herramienta de la rebanada en el control de exploración y mover las rebanadas (M sostienen clic y arrastre clave; Seleccionar sector para moverse con el deslizador paquete rebanada).
2. Wobble ¹³ C bobina haciendo clic en la herramienta de control Espectrómetro -> Acq -> bamboleo. Ajuste la ganancia del receptor a 1.000-2.000 en el espectrómetro.
3. Realizar la comprobación final del sistema. Dependiendo de la secuencia, observar la señal de carbono 13 de la cámara de urea en un protocolo de explorador.
   NOTA: Esto asegura que el sistema está configurado correctamente antes de comenzar el proceso de disolución irreversible.

6. Ejecutar Disolución

1. Cuando el piruvato ha alcanzado> 90% de polarización (~ 1 h), las soluciones y fantasma están listos, y la exploración está configurado haga clic en el botón de ejecución de disolución en el sy DNPtallo consola.
2. Cuando se le solicite mover el palo de la disolución en su posición de trabajo e inyectar medios de disolución. Cierre el sistema DNP y haga clic en el botón terminada en la consola del sistema DNP. Mueva palo de la disolución de nuevo a su posición de reposo cuando se le pida a continuación, haga clic en Finalizar.
3. Cuando el sistema DNP ofrece la piruvato hiperpolarizado (~ 2 minutos después de comenzar la calefacción) retirar 500 l de la solución de piruvato en cada una de las jeringas de soluciones de alta y baja concentración de la enzima. Lentamente (~ 10 seg) inyectar cada jeringa en una línea de inyección.
   NOTA: El análisis podría haberse iniciado antes de la inyección o en cualquier momento hasta 3 min después de la inyección en función del protocolo de análisis utilizado.

Procesamiento 7. Imagen

NOTA: Este fantasma fue diseñado para su uso con muchas estrategias de imagen. Véase la Figura 2, como un ejemplo de cómo las imágenes rad-EPSI se procesaron utilizando Matlab.

1. Cargar los datos en bruto a partir del archivo FID. reshape los datos para que coincida con el número de proyecciones, dio lectura a los puntos, ecos y dar cuenta de los datos almacenados como pares reales e imaginarios. Separar los puntos de eco pares e impares.
2. Transformada de Fourier, ya sea los ecos pares o impares a lo largo de las dimensiones de eco. identificar visualmente las bandas de frecuencias para piruvato y lactato. Por simplicidad se utilizó el valor absoluto del espectro.
3. Separar cada banda metabolito y la transformada de Fourier largo de la dirección de codificación de frecuencia para producir sinogrammes aislados para cada metabolito. radón transformada inversa de los sinogrammes separadas para producir una imagen de cualquiera de lactato o piruvato.

Resultados

imágenes 2D rebanada selectivos fueron adquiridos utilizando una secuencia de instantáneas radEPSI. imágenes de metabolitos fueron reconstruidas usando retroproyección filtrada. Las imágenes de metabolitos estaban bien alineados con las imágenes de protones, como se ve en la Figura 2. En esta señal de lactato hiperpolarizado sistema sólo puede ser generado a partir de la conversión enzimática de piruvato hiperpolarizado. En la Figura 4, la cám...

Discusión

formación de imágenes en tiempo real de los metabolitos hiperpolarizados tiene muchos desafíos únicos para el diseño de secuencias, validación y control de calidad. La capacidad para resolver la heterogeneidad espacio-temporal y espectral ofrece un potencial clínico sustancial, pero se opone a control de calidad y validación de métodos asociados con la RM convencional. las secuencias de imágenes complejas o algoritmos de reconstrucción pueden tener dependencias sutiles que las hacen difíciles de caracterizar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioSpect 7T	Bruker	BioSpec 70/30 USR	7 Tesla Pre-Clinical MRI Scanner
HyperSense	Oxford Instruments	Hypersense DNP Polarizer	Dynamic Nuclear Polarizer for MRI agents
1-13C-Pyrvic Acid	Sigma Aldrich	677175	Carbon 13 labled neat pyruvic acid
Trityl Radical	GE Healthcare	OX063	Free radical used in Dynamic Nuclear Polarization
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Ethylenediaminetetraacetic acid
LDH	Worthingthon	LS002755	Lactate Dehydrogenase from rabbit muscle
NADH	Sigma Aldrich	N4505	β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced dipotassium salt
Trizma	Sigma Aldrich	T7943	Trizma Pre-set crystals
NaCl	Sigma Aldrich	S7653