Usando Tomoauto: Un protocolo para la de alto rendimiento automatizado tomografía crioelectrónica

Resumen

Se presenta un protocolo sobre cómo utilizar la crio-tomografía electrónica de alto rendimiento para determinar alta resolución en las estructuras in situ de máquinas moleculares. El protocolo permite que grandes cantidades de datos a procesar, evita los cuellos de botella comunes y reduce el tiempo de inactividad de los recursos, lo que permite al usuario centrarse en cuestiones biológicas importantes.

Resumen

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

Introducción

Tipo III sistemas de secreción (T3SS) son determinantes de virulencia esenciales para muchos patógenos Gram-negativas. El injectisome, también conocido como el complejo de la aguja, es la máquina T3SS centro requerida para la translocación directa de proteínas efectoras de la bacteria en las células huésped eucariotas ^{1, 2.} El injectisome comprende una aguja extracelular, un cuerpo basal, y un complejo citoplásmico también conocida como el complejo de clasificación ^3. Estudios previos han dilucidado estructuras 3-D de injectisomes purificados de Salmonella y Shigella, junto con las estructuras atómicas de las principales proteínas del cuerpo basal ^{de 4, 5.} Recientes en las estructuras in situ de injectisomes de Salmonella, Shigella y Yersinia fueron revelados por crio-ET ^{6 , 7.} Sin embargo, el complejo citoplasmático, esencial para la selección efector y conjunto de la aguja, no se ha visualizado en esas estructuras.

Cryo-ET es los mesest técnica adecuada para obtener imágenes de la maquinaria molecular a una resolución de nanómetros dentro de su contexto celular nativo (in situ). Sin embargo, la resolución alcanzable por crio-ET está limitada por espesor de la probeta. Para superar el inconveniente, hemos fotografiado injectisomes intactas en una cepa de Shigella flexneri virulenta que fue modificada genéticamente para producir minicélulas lo suficientemente delgadas para crio-ET. Otra limitación de la crio-ET es la sensibilidad de la muestra a la radiación inducida por el haz de electrones, que destruye muy rápidamente la información de alta resolución en la muestra. Como resultado, las dosis extremadamente bajas se utilizan para Tilt-imágenes individuales de manera que una dosis adecuada puede ser distribuido entre la inclinación de la serie completa. Esto reduce en gran medida la relación señal-ruido (SNR) en la reconstrucción final, lo que hace difícil diferenciar las características estructurales de la materia a partir de la gran cantidad de ruido en la tomografía y limita la resolución que se puede lograr por crio ET. Conventional de procesamiento de imágenes tales como Fourier y los filtros del espacio real así como hacia abajo de muestreo se puede utilizar para aumentar el contraste, pero a expensas de filtrar gran parte de la información de alta resolución. Recientemente, sub-tomografía promedio ha permitido aumentar enormemente la SNR y, posteriormente, la resolución final en algunos casos a niveles sub-nanómetros ^{8, 9.} Un análisis más detallado de los complejos es posible gracias computacionalmente extraer miles de sub-tomografías contienen las áreas de interés de las tomografías originales y luego alinear y promedio de las sub-tomografías para determinar en estructuras complejas situ con mayor SNR y mayor resolución. Estos métodos se pueden integrar con enfoques genéticos para ofrecer aún mayores conocimientos sobre las asambleas macromoleculares y sus conformaciones dinámicas en el contexto celular nativo.

En general, decenas o incluso cientos de miles de sub-tomografías deben ser promediados para determinar altaestructuras -Resolución in situ. La adquisición de un número suficiente de inclinación de la serie necesaria para producir este gran número de sub-tomografías rápidamente se convierte en un cuello de botella. La inclinación de la serie resultantes son a menudo afectada por el cambio inducido por haz de, etapa reacción, así como la ampliación, la rotación y defectos de inclinación, que debe resolverse para que la inclinación de la serie en alineación antes de la reconstrucción. La serie de inclinación está normalmente alineado por el seguimiento de marcadores de referencia de oro, que son seleccionados tradicionalmente manualmente a través de la inspección de la serie de inclinación, causando otro cuello de botella. Muchos paquetes de software se han desarrollado para la adquisición de la inclinación de la serie automatizada a través de microscopios electrónicos controlados por el ordenador ^{10, 11, 12,} la alineación de inclinación de la serie y la reconstrucción ^{de 13, 14 y} sub-tomografía promedio de ^{15 a 18.} Como estos paquetes manejan operaciones discretas en el flujo de trabajo de la crio-ET, se hace deseable construir un mayor nivel de abstracción en el proceso para systematicamente agilizar todo el esquema en una sola tubería. Por lo tanto, hemos desarrollado una biblioteca envoltorio software "tomoauto" diseñado para organizar una serie de estos paquetes en una sola unidad semi-automatizado, permitiendo una operación de usuario simple, mientras que el mantenimiento de la configuración completa de cada componente de forma centralizada. La biblioteca es de código abierto, bien documentado, desarrollado continuamente y libremente disponibles para su uso, desarrollo a medida o una mayor integración por medio de un código fuente remota repositorio en línea (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).

Este crio-ET tubería de alto rendimiento se ha utilizado para visualizar injectisomes intactos en S. minicélulas flexneri. Un total de 1.917 tomografías fueron generados usando este método, revelando una alta resolución en la estructura in situ de la máquina intacta incluyendo la plataforma de clasificación citoplasmática determinado por sub-tomografía promediando ^19. Junto con el modelado molecular de tipo salvaje y mmáquinas utant, nuestra línea de alto rendimiento proporciona una nueva vía para entender la estructura y la función del injectisome intacto en el contexto celular nativo.

Protocolo

1. Preparación Minicell

1. Para hacer S. minicélulas flexneri, transforman 1 l de plásmido pBS58, que expresa constitutivamente genes de división celular de Escherichia coli ftsQ, FtsA y FtsZ desde un mínimo de copias espectinomicina resistentes plásmido en 5 l electrocompetente estreptomicina resistentes serotipo 5 bis (M90T-Sm) células por electroporación a 2,5 kV durante 5 ms en 1 cubetas mm.
2. Almacene las muestras minicélula a -80 ° C en glicerol al 15% en un 1,5 ml microtubo criogénico. Cuando esté listo para su uso, raspar aproximadamente 5 l de células de la microtubo unthawed utilizando una punta de pipeta y suspender las células en 4 ml de caldo de soja tríptico con espectinomicina añadió a 100 g / ml de concentración. Crecer O / N a 37 ° C.
3. Pipetear 2 ml del cultivo de caldo de soja 1,2 en 200 ml tríptico con espectinomicina nuevo añadido a concentraciones de 100 mg / ml. Crece a 37 ° C a la fase logarítmica tardía.
4. Para enriquecer minicélulas, centrífuga200 ml del cultivo a partir de 1,3 a 1.000 xg durante 5 min. Vierta cuidadosamente la fracción sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga y centrifugar a 20.000 xg durante 10 min. Vierta cuidadosamente y deseche la fracción sobrenadante, y mezclar suavemente el pellet con el líquido restante con una punta de pipeta y transferir aproximadamente 100 l de la mezcla de pellets a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.

2. EM preparación de la cuadrícula

1. Coloque un lado de la película de carbono de malla 200 de carbono rejilla de cobre R2 / 2 holey sobre un portaobjetos de vidrio.
   NOTA: A / 2 rejilla de malla 200 R2 se selecciona para maximizar el número de inclinación de la serie que se puede configurar para adquirir en una sola cuadrícula mientras que todavía el apoyo a la muestra y colocando el borde de la película de carbono en el campo de la cámara en la ampliación deseada. Rejillas de malla más fino y películas más pequeñas holey de carbono tales como R1.2 / 1.3 400 de malla se puede utilizar para muestras fotografiadas a mayor aumento; películas más grandes holey carbono, tales como R3.5 / 1 200 de malla puede ser usod para las muestras proyectado en aumento menor o si la micrografía no debe contener el borde carbono y películas de carbono holey con un espaciado más grande tal como R1 / 4 de malla 200 puede ser utilizado para ayudar con la alineación de la etapa a la zona de interés y la protección de áreas de sobreexposición en el enfoque y el seguimiento de rutinas.
2. Colocar el portaobjetos en la plataforma en un dispositivo de descarga luminiscente.
   NOTA: Utilizamos un dispositivo de la casa en la que un ánodo y la plataforma se ha mecanizado en un desecador de vacío y es alimentado por un generador de alta frecuencia. Después de crear un vacío, conecte la sonda generador de alta frecuencia para el ánodo y el poder en la sonda durante 1 min a brillar descargue la red. El tiempo necesario para brillar descarga la red puede variar desde unos pocos segundos a un minuto. Variando el tiempo de descarga luminiscente se puede utilizar para diagnosticar problemas de concentración de muestras y las redes que aparecen en seco sin hielo vítreo.
3. Retire la rejilla con un juego de pinzas, y bloquear las pinzas cerradas con un b elásticay.
4. Añadir 100 l de 10 solución de oro coloidal nm al tubo de microcentrífuga con las minicélulas preparados en 1.4 y mezclar agitando suavemente el tubo con un dedo. Con un nuevo lugar pipeta de 4 l de la mezcla en la parrilla preparado en 2.2.
   NOTA: El oro coloidal está disponible en una variedad de tamaños y se debe tener cuidado de que el tamaño del oro es mayor que 5 píxeles dado el tamaño de píxel de las micrografías de ser procesados ​​en la ampliación adquirida, si bien no es demasiado grande para las características oscuros de interés.
5. Preparar el aparato de inmersión congelación; llenar el recipiente de congelación exterior con nitrógeno líquido y luego rellenar la cámara interior con etano líquido. Una los fórceps con la rejilla a la varilla de émbolo y bloquear el vástago del émbolo en la posición elevada.
   NOTA: Ver Iancu et al ²⁰ para un protocolo que describe el uso de un aparato de inmersión congelación comercial..
6. Seque la red tocando cuidadosamente un trozo de papel de filtro en tque caiga de la muestra hasta que el menisco entre las separa de la red y de papel de filtro y la mecha en el papel de filtro se detiene, luego suelte inmediatamente el émbolo, la congelación de la cuadrícula. Retire con cuidado las pinzas de la varilla del émbolo y coloque la rejilla en un soporte de rejilla.
7. Prepare la estación de transferencia de la crio-ME llenando el contenedor de la bomba zona de carga y la absorción de nitrógeno líquido. Una vez que el área de carga está en lugar temperatura del nitrógeno líquido el soporte de rejilla y un cartucho de muestra de microscopio en la zona de carga.
8. Retire con cuidado el anillo de bloqueo, que es ya sea un pequeño anillo de bloqueo roscado en microscopios Polara anteriores o un anillo de clip-estilo C en modelos posteriores; colocar la rejilla de EM en el cartucho con unas pinzas y luego vuelva a colocar suavemente el anillo de seguridad de nuevo en el cartucho de asegurar la red.
9. Retire el soporte de la muestra múltiple del microscopio y adjuntarlo a la estación de transferencia. Coloque el cartucho de muestra en el soporte utilizando pinzas de cartucho und retraer el soporte de la zona de carga y transferir el portamuestras múltiple de vuelta al microscopio.
   NOTA: Ver Chen et al ²¹ para un protocolo que detalla 02.01 a 02.09..

3. Alto rendimiento de inclinación de la serie automatizada Colección

1. Colección de baja magnificación Mapas
   1. Abra una nueva ventana del navegador, haga clic en "Abrir" en el menú 'Navigator' de SerialEM ¹⁰ (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
   2. Encuentra cuadrículas que contienen las condiciones de imagen aceptables (es decir, el hielo fino, sin contaminación, tema de interés) mediante la pantalla fluorescente a bajo aumento (~ 2,300X para la muestra de minicélulas).
      NOTA: [Opcional:. Este paso puede automatizarse con SerialEM montaging por toda la red, sin embargo, puede ser más rápido que sólo tiene que seleccionar unas pocas áreas manualmente]
   3. Ajuste el escenario a la altura eucéntrica por la inclinación del portamuestras de 50 ° y luego ajustarel z-altura hasta la traducción xy de la etapa es mínima entre los puntos de vista inclinados y no inclinada.
   4. Mover al centro de la plaza de la red y haga clic en el botón 'Añadir Etapa Pos' en la ventana del navegador para guardar la posición actual etapa.
   5. Continúe con los pasos 3.1.1-4 anterior hasta que se han guardado todas las posiciones cuadrículas etapa aceptables.
   6. Abra un nuevo archivo MRC montaje haciendo clic en "Nuevo montaje" en el menú "Archivo". En el programa de instalación Montaje de diálogo que se abre, seleccione un número de piezas en X e Y que adquirirán toda la cuadrícula (por ejemplo, 10 x 10 para una rejilla de malla 200 estándar). Use un binning alta como 8 y seleccione la opción 'Mover Etapa En lugar de desplazamiento de la imagen "y" Saltar correlaciones utilizadas para alinear piezas' botones de radio.
   7. En la ventana del navegador, haga clic en la primera posición de la etapa y la puso a adquirir marcando la casilla 'Acquire'. Repita este procedimiento para cada posición de la etapa en la ventana del navegador.
   8. Abra el navegador Adquirir diálogo haciendo clic en "Adquirir en los puntos 'en el menú' Navigator '. Compruebe el 'mapa de imagen Acquire "y casilla' eucentricity Rough 'y asegúrese de que todas las demás casillas de verificación están desactivadas. Haga clic en 'Continuar' para recoger un montaje en cada posición de la etapa.
2. Adquisición de inclinación de la serie
   1. En la ventana del navegador, seleccione uno de los mapas adquiridos y haga clic en el botón "Cargar mapa '.
   2. En la ventana del navegador, haga clic en "Añadir Puntos 'botón y seleccionar puntos en el mapa en el que adquirir una serie de inclinación. Luego haga clic en el 'dejar de añadir puntos' botón. Repita el procedimiento para cada mapa recogido.
   3. En el menú de la cámara seleccione 'Parámetros' y definir los parámetros para los modos de enfoque, el juicio, y Record. [Opcional:. Dosis fracciona-datos se pueden especificar en los parámetros para el modo de grabación]
   4. Seleccione un punto en la ventana del navegador y comprobar la 'Serie de inclinación9; casilla de verificación. En la ventana de diálogo Configuración de inclinación de la serie que se abre, seleccione los parámetros que desee para la recogida de la inclinación de la serie. Repita el procedimiento para el resto de los puntos seleccionados en la ventana del navegador, pero no seleccione los mapas.
   5. En el menú del navegador de nuevo seleccionar el 'Adquirir en los puntos'. En el Navigator Adquirir diálogo elija 'Vuelva a alinear con el tema', enfoque automático 'y' eucentricity Rough 'como tareas preliminares, y seleccione "Adquirir serie de inclinación' como la tarea primaria, y seleccione" Cerrar las válvulas de columna en el extremo 'para cerrar la columna cuando todo de los puntos se han recogido. Al proceder de una serie de inclinación serán recogidos en cada punto en cada mapa.

4. Alto rendimiento de procesamiento de la inclinación de la serie automatizada y Reconstrucción Usando Tomoauto

1. Corrección de movimiento inducido por la viga en los datos de dosis fraccionadas [opcional]
   NOTA: Tomoauto utiliza MOTIONCORR ²² (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) para eliminar el movimiento inducido por haz de a partir de micrografías de dosis fraccionada. NOTIONCORR ¹⁶ debe estar instalado en el sistema.
   1. Con la serie de inclinación original, el registro de salida de SerialEM ¹⁰ y las imágenes fraccionada en dosis individuales de todo en el directorio de trabajo actual, en un terminal ejecutar el comando:
      dose_fractioned_to_stack
      es el nombre de la serie de inclinación para procesar.
2. Alineación y Reconstrucción de la inclinación de la serie
   NOTA: Tomoauto por defecto usa IMOD ¹³ (http://bio3d.colorado.edu/imod/) para manejar la inclinación de la serie automatizado generación de modelos fiducial, la alineación, la determinación de la función de transferencia de contraste (CTF), CTF-corrección de ^23, y reconstrucción. Alternativamente los usuarios tienen la opción de tomoauto utilizar RAPTOR ²⁴ (incluido en IMOD) para la generación automatizada modelo fiducial, CTFFIND4 ²⁵ (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) para determinar la CTF, y tomo3d ²⁶ (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) para la reconstrucción o en cualquier combinación de paquetes de software por configuración. Esta configuración, así como los parámetros disponibles en cada paquete está a cargo de un archivo de configuración global que se puede editar para adaptarse a los valores más utilizados en un laboratorio mientras que los archivos de configuración local también se pueden crear a los parámetros de detalles utilizados para una muestra específica, colección establecer o inclinación de la serie individual. Todos los paquetes que deseen utilizar debe estar instalado en el sistema.
   1. Con la inclinación de la serie en el directorio de trabajo actual, en un terminal ejecutar el comando
      tomoauto --CTF --mode = align
      es la serie de inclinación para ser procesado y es el Diameter de los marcadores de referencia en nanómetros. Este comando alinear y estimar el CTF de la serie de inclinación automáticamente. Es posible omitir el procesamiento de CTF mediante la eliminación de la opción --CTF desde el comando.
   2. Inspeccione el tilt-series alineadas visualmente de los errores evidentes en el procesamiento de la alineación e inspeccionar el FTL estimado mediante la ejecución de los comandos:
      3dmod .ali
      submfg _ctfplotter.com
      respectivamente, donde es el nombre de la inclinación de la serie sin sufijo. También comprobar la salida del comando tomoauto para ver el error residual media generada por la alineación, que es una estadística cuantitativa de la calidad de alineación.
   3. Dada una alineación aceptable proceder procesamiento ejecutando el comando:
      tomoaua --CTF --mode = reconstruir
      con las mismas sustituciones de usuario como en 4.2.1. Este comando corregirá el CTF, borrar los marcadores de referencia de la serie de inclinación y calcular la reconstrucción. De nuevo procesamiento CTF se puede omitir como en 4.2.1.
   4. [opcional] Para saltar el paso de la inspección visual y automatizar completamente el procesamiento y la reconstrucción ejecutar el comando
      tomoauto --CTF
   5. [opcional] Para utilizar una configuración local específica, consulte la documentación tomoauto sobre cómo generar un archivo de configuración local y, a continuación, ejecutar el comando
      tomoauto [opciones] -L
      donde es el nombre de la conf localesarchivo iguration.

Averaging 5. Sub-tomografía

NOTA: Utilizamos el paquete i3 ¹⁵ (http://www.electrontomography.org/) para procesar los experimentos de promedio sub-tomograma, sin embargo, el protocolo descrito se aplica en general a la mayoría de los disponibles sub-tomograma experimentos proceso packages16to software promedio sub-tomografía de promedio, sin embargo, el protocolo descrito se aplica en general a la mayoría de los disponibles sub-tomograma paquetes de software de promedio ^16-18.

1. Con la tomografía reconstruida en el directorio de trabajo actual abrir la tomografía de recolección de partículas mediante la ejecución del comando:
   tomopick .rec
   donde es como en 4.2.2. En la ventana que se abre utilizar el botón izquierdo del ratón para hacer clic en el primero el cuerpo basal y luego la punta de la aguja para seleccionar una injectisome y utilizar las teclas de flecha arriba y abajo para riff a través de las rebanadas de la tomogrametro. Seleccionar todos injectisomes visibles en esta manera. Esto almacena las coordenadas en un archivo de texto que definen el eje largo de la estructura, así como la estimación de dos de los tres ángulos de Euler que describe la orientación de la estructura.
2. Extracto Computacionalmente 400 ³ cubos voxel de la tomografía con centro en el punto medio del eje longitudinal definido por la ejecución del comando:
   recortar redimensionamiento -CX -cy -CZ -ix 400 -iy 400 -iz 400
   .rec _001.mrc
   donde , , son las coordenadas del punto medio de la estructura y es como en 4.2.2. El tamaño del cubo extraída debe variar por la estructura y la ampliación usado, y debe ser lo suficientemente grande para encerrar adecuadamente la estructura de interés, que para esta muestra es de 400 ³ voxels.
3. Abajo-muestra (bin) la sub-tomografía por un factor de cuatro a reducir el tiempo de cálculo para la alineación inicial ejecutando el comando:
   binvol -b 4 _001.mrc _001.bin4.mrc
   donde es como en 5.2.
4. Aplicar el determinado ángulos de Euler para sub-tomografías y calcular el promedio global para producir la plantilla inicial mediante la ejecución del comando.
   I3totsum.sh
5. Alinear y clasificar sub-tomografías abajo muestra que utilizan una máscara de clasificación binaria de la zona citoplasmática. Realizar sub-tomografía promediado en el espacio de Fourier para minimizar los artefactos de cuña que faltan característicos de la tomografía. Para binning 4 de datos, por favor, utilice SAMPFACT = "4 4 4".
   i3mramsacls.sh
6. Repita el paso 5.5 utilizando sub-tomografías abajo-muestreados por un factor de dos (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") y una vez más con los datos originales (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
   i3mramsacls.sh

Resultados

Las muestras de minicélulas S. flexneri fueron recogidos y tratados como se muestra en la figura esquemática 1 utilizando tomoauto siguiendo la tubería se detalla en la figura 2. Inclinación de la serie se recogieron usando SerialEM ^10, que permite la adquisición de inclinación de la serie de alto rendimiento en los puntos designados por el usuario en los mapas de montaje de b...

Discusión

El alto rendimiento método descrito aquí nos permitió procesar 1,917 crio tilt-serie y producir más de 4.500 sub-tomografías del S. intacta flexneri injectisome ^19. Los datos obtenidos llevaron a la caracterización detallada de en injectisome situ, incluyendo el citoplasmática de clasificación compleja. El método también se utilizó para visualizar varias células mutantes con deleción específica de los componentes de proteína putativa, que ayudó a di...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Electroporation Apparatus	Bio-rad	165-2100
1 mm Cuvette	BTX	45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube	Thermoscientific	5000-1020
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device	In-House		Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016	Used in In-House Glow Discharge Device
High-Frequency Generator	Electro-Technic Products	BD-10A	Used in In-House Glow Discharge Device.  CAUTION: This device generates high voltages.
Centrifuge
Forceps	Dumont (Electron Microscopy Sciences)	72705-D	Style 5 Anti-magnetic
Colliodal Gold	Aurion		BSA 10nm
Filter Paper	Whatman		#2
Ethane	Matheson Tri-Gas	UN1035
Nitrogen	Matheson Tri-Gas	UN1977
Plunger Device	In-House		Commercial Alternative Available
Cryogenic Grid Storage Box	Electron Microscopy Sciences	71166-30
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Direct Detection Device Camera	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software	IMOD		Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto)
CTF Determination Software	IMOD		Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto)
Tilt-Series Reconstruction Software	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software	i3		http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD
Subvolume Averaging Software	i3		Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org