La completa y actualizada "rotífero policultivo Método" para la educación de primer pez cebra Alimentación

Resumen

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Resumen

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Introducción

El pez cebra (Danio rerio) es un animal de laboratorio por excelencia utilizado en un número cada vez mayor de las disciplinas científicas, incluyendo pero no limitado a la genética del desarrollo, la toxicología, la conducta, la acuicultura, biología regenerativa, y el modelado de muchos trastornos ^humanos 1 ^{- 5.} Aunque la especie es relativamente fácil de mantener en el laboratorio, hay una serie de retos de gestión asociados con su cultura ^6. El más destacado de ellos es la cría de larvas, particularmente cuando primero los peces comienzan a alimentarse con posterioridad a la inflación de la vejiga de gas ^7. En condiciones normales, controlados, este evento evolutivo ocurre en ~ 5 días después de la fertilización (dpf), con los siguientes 3 ​​- 5 días de crecimiento es particularmente crítica ^7. La dificultad técnica central durante esta etapa es satisfacer adecuadamente las demandas nutricionales de las primeras larvas de alimentación - artículos de alimentación deben ser de tamaño adecuado, Digestible, atractivo, y está disponible de forma casi continua, sin crear residuos excesivos en los tanques de cultivo. Históricamente esto se ha logrado típicamente mediante la entrega de numerosas pequeñas cantidades de alimento a los peces en los tanques, junto con la rutina de cambio de agua de ^8,9. Si bien estos métodos son en cierto grado de éxito, son ineficientes, requieren insumos de trabajo elevadas, y vuelven única variable y tarifas limitadas de crecimiento y supervivencia ^10.

En la naturaleza, las larvas de pez cebra, presumiblemente, se alimentan de abundantes pequeño zooplancton presente en la columna de agua ^11. Por esta razón, los protocolos de larvicultura que incorporan transmisiones en vivo tales como Paramecium, rotíferos, Artemia y son típicamente más eficiente ^7. En 2010, Best y co-autores demostraron que era posible cultivar larvas de pez cebra en agua salobre estática junto con rotíferos de agua salada para los primeros 5 días de alimentación exógena ^12. Este enfoque, que aprovechares la alta productividad natural de los cultivos de rotíferos para proporcionar amplia, presa de alto valor nutritivo sin contaminar el agua, produce altas tasas de crecimiento de las larvas y la supervivencia con la entrada de baja laboral ^12,13. En los últimos años, un número creciente de laboratorios de todo el mundo han adoptado variaciones de este protocolo, y muchos ahora están cultivando rotíferos de forma continua para apoyar los sistemas de vivero ^14.

En los últimos años, los métodos para ambos rotíferos / policultivo pez cebra y la producción de rotíferos se han refinado y mejorado para ser más estandarizada y fácilmente escalable. Este artículo ofrece paso a paso las instrucciones para 1) la producción de rotíferos continuo y robusto y 2) el establecimiento del sistema de policultivo de rotíferos / pez cebra utilizado para apoyar un crecimiento robusto de los peces durante los primeros 5 días de alimentación exógena.

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Protocolo

1. rotífero Cultura

1. Componentes básicos de un sistema de cultivo utilizando un recipiente de 100 L de Cultura
   1. Reúna todos los componentes para la configuración de cultivo de rotíferos. La configuración de cultivo de rotíferos consiste en un recipiente de cultivo (CV) para crecer los rotíferos; un recipiente similar a mantener rotíferos feedout (recipiente de cultivo feedout, FCV); un frasco de fondo redondo de eclosión (RSS Embalse, FR) para el almacenamiento de la mezcla de alimentación algas (AFM); un suministro de aire (AS) para airear el CV, FCV y el FR; una bomba peristáltica con un temporizador de medición (PMT) para controlar el suministro de alimento de algas en el CV y ​​FCV; y un filtro de partículas hilo (FPF) que se encuentra dentro de la CV.
      NOTA: Una lista completa de suministros y componentes se proporciona en la Lista de materiales.
2. Configuración
   1. Eleve la CV y ​​FCV en un soporte o mesa para que las culturas pueden ser fácilmente recolectados a través de un accesorio de drenaje en un cont colecciónAiner (Figura 1). Use tubería de suministro de aire flexible para conectar los AS a una longitud de tubería rígida en cada recipiente de cultivo. Asegúrese de que el tubo es lo suficientemente largo para suministrar aire a la parte inferior de la CV o FCV.
   2. Utilice una línea de aire de pequeña capacidad para conectar los AS a una longitud de tubo rígido que se extiende a la parte inferior de la FR que contiene el AFM. Instale una válvula en cada línea de aire para regular el flujo de aire. Conectar el FR a la PMT con un tubo de entrega de alimentación, y ejecutar el tubo de la PMT en un agujero perforado en el lado de la CV / FCV, cerca de la parte superior. Figura 1.
3. Puesta en marcha
   1. Llenar el recipiente de cultivo a 90% del volumen disponible con agua de ósmosis inversa (RO). Si RO no está disponible, utilice agua limpia, sin cloro municipal; Sin embargo, una evaluación de riesgos de bioseguridad se debe realizar para asegurar que no hay organismos potencialmente patógenos presentes en el agua de la fuente. NOTA: Este tipo de análisis se puede realizarpor cualquier laboratorio de análisis de agua calificado.
   2. Dosificar el agua recipiente de cultivo con sal de acuario para alcanzar una salinidad de 15 g / L. Ajuste el flujo de aire en el recipiente de modo que mantiene un "punto de ebullición" y, a continuación añadir lentamente la cantidad medida de sal al recipiente de cultivo hasta que esté completamente disuelta por la aireación. Continuar airear el agua durante> 1 hora para asegurarse de que está totalmente oxigenada.
   3. Hacer la mezcla de alimentación algas. Para 3 L de limpio, sin cloro (0 ppm) de agua dulce 100 g de _NaHCO3 y 100 g de neutralizador de amoniaco (hydroxymethylsulfonate de sodio). Este último reactivo ofrece el beneficio adicional de neutralizar el cloro residual a partir de residuos de agua del grifo o de blanqueo de desinfección de los equipos de la cultura. Es fundamental asegurarse de que estos compuestos se disuelven completamente. A continuación, añadir 1 litro de concentrado de algas (biomasa en peso seco ~ 15%). Añadir la mezcla de alimentación a la FR y almacenar a 4 ° C.
   4. Añadir un cultivo iniciador de 5 a 10.000.000 rotíferos Brachionus plicatilis al CV que contienen el aireado 15 g / L de agua de salinidad. Si los rotíferos se han enfriado durante el envío o almacenamiento, deben ser gradualmente (durante 30 min o más) aclimatado a la temperatura del agua en el recipiente de cultivo (25 - 27 ° C).
   5. Encienda el PMT y comenzar a bombear el alimento de algas en el recipiente de cultivo de rotíferos. Mediante la función de temporizador de la PMT, ajuste la velocidad de suministro de mezcla de alimentación algas para que ~ 1,6 ml de mezcla de alimentación algas se entrega por millón de rotíferos en la cultura, por día. Distribuir las comidas en porciones pequeñas a intervalos regulares en el transcurso de un período de 24 h; las más frecuentes las comidas, mejor.
   6. Calibre el caudal de la bomba girando manualmente en el PMT durante un período determinado (por ejemplo, 1 min) y recoger las algas que bombea durante este intervalo en un cilindro o vaso graduado. Por ejemplo, si las dosis PMT 5 ml de algas en 1 min, a continuación, la tasa de dosis sería5 ml algas / min.
   7. Calcular la tasa de alimentación diaria requerida de multiplicar el número de rotíferos presentes, en millones, en 1,6 ml. Por ejemplo, un cultivo de rotíferos con un tamaño de la población de 100 millones de rotíferos requeriría ~ 160 ml de alimento por día (100 x 1,6 ml).
   8. Establezca la PMT para dosificar el requisito de alimentación total diaria a intervalos regulares durante un período de 24 horas. Por ejemplo, la entrega de una cantidad de alimentación total diaria de 160 ml se podría entregar en porciones una vez cada 3 horas durante un período de 24 horas utilizando un conjunto PMT con una tasa de bomba de dosificación de 5 ml / min durante 4 min, 8 veces al día (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 comidas = 160 ml).
   9. Deje que la cultura crezca hasta que se genera la población requerida, por lo general de 48 a 72 horas, antes de la cosecha. A las 24 h después de la puesta en marcha, agregue los filtros de partículas de seda en el recipiente de la cultura y comenzar el mantenimiento normal.
4. Mantenimiento
   NOTA: La cultura opera sobre una base continua y requiere routinmantenimiento e que, idealmente, debe realizarse al mismo tiempo cada día, en la siguiente secuencia.
   1. Llenar el FCV a 90% del volumen disponible con limpio, sin cloro agua dulce, dosificado con 10 g sales de acuario / L. Asegúrese de que el agua se mezcla bien, y que toda la sal se haya disuelto completamente. Ajuste el flujo de aire en el recipiente de modo que mantiene un "punto de ebullición". Mida la salinidad con un refractómetro y asegúrese de que la salinidad es de 10 g / L. Es fundamental para cumplir con este objetivo y que no exceda de la misma.
   2. Muestra los rotíferos en la CV: Asegúrese de que la cultura es bien mezclada, entonces recoger 3 muestras de un 2-3 ml cada uno usando una pipeta de transferencia o autopipettor, de diferentes partes de la cultura. Combinar estas muestras en un tubo o vial de tamaño conveniente (por ejemplo, 10 ml).
   3. Transferencia de 1 - 2 ml de la muestra combinada en una placa de Petri de modo que pueda ser visualizado bajo un microscopio de disección. Compruebe la calidad de la cultura (natación comportamiento delrotíferos, la presencia de huevos separados, protozoos contaminante).
   4. Inmovilizar el rotíferos en la muestra restante combinado mediante la adición de 100 l de solución de yodo Lugols 50% a la muestra. En cuestión de segundos después de la adición de los Lugols, observar los rotíferos para detener la natación. Ahora, contar fácilmente los rotíferos.
      NOTA: Etanol, lejía diluida, o vinagre se pueden utilizar en lugar de Lugols. Vinagre (2 gotas / 10 ml) tiene la ventaja de ser no peligrosos, no perder fuerza en el almacenamiento como soluciones de cloro y yodo puede y no hacer el contrato de rotíferos, por lo que la corona de cilios y el "pie" siendo ampliado y la animales parezcan más naturales.
   5. Asegúrese de que la muestra esté bien mezclada (rotíferos inmovilizados se asentarán rápidamente), a continuación, tomar rápidamente un ml submuestra ~ 2 en una pipeta de plástico y prescindir de 1 ml en una diapositiva de contar Sedgewick-Rafter (20 x 50 cuadrados de 1 mm) (Figura 2 ). Usando una disección o compuesto microscopio, contar los rotíferos intactas y la total número de huevos unidos a estos rotíferos (Figura 2). Cuentan tanto de la zona de deslizamiento según sea necesario para contar ~ 100 rotíferos. Calcular el número de rotíferos por ml, y registrar esto en una hoja de cálculo o libro de registro.
   6. Cosecha ~ 30% del volumen de los rotíferos en la CV: Retire el suministro de aire y el filtro de hilo, abra lentamente la válvula en la parte inferior de su CV y ​​permitir que el agua fluya en un colector de plancton con una pantalla de malla de 53 micras. Recoger el agua que fluye fuera de la parte inferior del colector después de la filtración en un cubo o desagüe. Use un suave para flujo moderado para evitar daños en los rotíferos. No permita que los rotíferos se sequen en la pantalla.
   7. Por razones de coherencia, es aconsejable establecer el FCV con un número estándar de rotíferos cada día. Por lo tanto, el volumen basa en la densidad de rotíferos CV y la cosecha conocida, ajustar el volumen total FCV para alcanzar una densidad final coherente (por ejemplo., 1.500 rotíferos / ml). Agregue el roti cosechadofers al FCV: transferir suavemente los rotíferos de la pantalla de la colección utilizando una botella de lavado llena con agua salada limpia (10-15 g / L). Invertir la pantalla sobre la FCV y lavar los rotíferos en el FCV con un chorro suave de agua salada. Inicie el PMT para entregar alimentación (~ 1,57 ml por millón de rotíferos por día) a la FCV.
   8. Frote todo el interior de su CV con un cepillo de nylon suave y limpio o estropajo.
   9. Hacer una nueva mezcla de 15 g de agua / L por adición de la cantidad apropiada de sal a una cantidad medida de agua RO limpia en un cubo de 5 galones para reemplazar el volumen de agua perdido de la cosecha. Agregue la sal al agua en el cubo y agitar vigorosamente hasta que se disuelva por completo, y luego añadir a la CV.
   10. El uso de un aerosol de alta presión en un fregadero, enjuague el filtro de hilo hasta que esté libre de escombros, y luego devolverlo a la CV.
   11. Ajuste velocidades de alimentación de algas entregado a la CV cambiando la duración de cada evento de dosificación, de acuerdo con el recuento diario de rotíferos / ml.Utilice los cálculos previstos en el paso 1.3.8, anteriormente para determinar la cantidad apropiada de alimentación que se entregarán.
   12. Aproximadamente 24 horas después, repetir el proceso. Comience por la cosecha de los rotíferos que quedan en la FCV (que no se necesita para el día anterior) de la misma manera como se describió anteriormente (pasos 1.4.2 - 1.4.10). Concéntrese en 2 litros de agua sin cloro fresca y limpia (5 g de sal / L). Estos pueden ser almacenados a 4 ° C como una alimentación de reserva, o se utiliza para alimentar a etapas posteriores de peces, más allá de lo que se describe en este protocolo.
       NOTA: Este protocolo permite hasta 2 - 3 días de mantenimiento de cultivo reducida (con alimentación automática normal), debido a que los rotíferos en la CV pueden tolerar omisión de cosechas sin consecuencias graves.

2. El policultivo

1. Preparar
   1. Recoger embriones de pez cebra de un evento de desove mediante el vertido de embriones generados a través de un colador de té y luego enjuagar suavemente con fis estérilesh de agua (o cualquier otra fuente no contaminada de la solución apropiadamente acondicionado; por ejemplo, medio de embrión, E3, etc.) a partir de una botella de lavado en placas de Petri.
   2. Incubar los embriones a 25 - 28 ° C en placas de Petri a una densidad de 40 - 50 embriones por placa durante 5 días.
   3. Comienza la fase de policultivo en el día 5 después de la fertilización, o cuando más del 90% de las larvas eclosionadas están nadando activamente en la columna de agua.
2. Inoculación
   1. Añadir 500 ml de cultivo de rotíferos directamente desde el FCV a un tanque de vivero 3,5 L; inclusión del agua de cultivo de rotíferos proporciona alimento de algas que mantiene el contenido nutricional de los rotíferos durante policultivo.
   2. Vierta suavemente las larvas de una placa de Petri en el tanque de vivero. Asegúrese de que no larvas permanecen en el plato.
   3. Añadir 500 ml de agua peces acondicionado limpia de un sistema de recirculación o fuente de agua dedicado al tanque para llegar a un volumen final de 1 L y una s final dealinity de 5 g / L.
      NOTA: Esta salinidad es crítico porque el pez cebra supervivencia larvas se verá afectada negativamente si la salinidad es> 7 g / L y la supervivencia de rotíferos se verán afectados negativamente si la salinidad <2 g / l.
3. Fase de policultivo
   NOTA: La fase de policultivo debe durar hasta 4 días después de la inoculación (un total de 5 días, que corresponde al día 5-9 después de la fertilización).
   1. Observe el depósito de policultivo al menos una vez por día durante este período para garantizar que los rotíferos y los peces están presentes y en crecimiento. Asegúrese de que los rotíferos son visibles a lo largo de la columna de agua. Asegúrese de que los los Fishs también son visibles dentro de la columna de agua, nadando entre los rotíferos.
   2. Iniciar el flujo de agua normal a través del tanque. Coloque una pantalla o deflector sobre el puerto de drenaje para garantizar que las larvas no son expulsadas del tanque.
      NOTA: Al final de esta fase, los peces serán lo suficientemente grande como para consumir presas más grandes como Artemiaartículos de un feed nauplios o procesados ​​en el rango de tamaño de 75 a 125 micras.
      NOTA: La dinámica de población de rotíferos dentro de un tanque de policultivo representante se midieron mediante muestreo / rotíferos contando desde el tanque de la misma manera como se describe en los pasos 1.4.2 - 1.4.5. Esto se hizo una vez por día desde el comienzo de la fase de policultivo hasta que se completó.

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Resultados

El sistema de cultivo de rotíferos continuo descrito aquí es dinámica, y es normal que los números de rotíferos que fluctúan en una pequeña parte con el tiempo si hay variaciones en las tasas de alimentación y cosecha diarias. La población de los rotíferos en uno de los cultivos activos en las instalaciones de acuicultura en el Hospital de Niños de Boston, mantiene en la forma descrita anteriormente, fue monitoreado por 30 días (Figura 3). La densidad de cult...

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Discusión

La implementación exitosa del método de policultivo de rotíferos para la alimentación temprana larvas de pez cebra requiere protocolos efectivos para dos tareas: la creación y mantenimiento de un sistema de cultivo de rotíferos continua para alimentar a los peces y el cultivo de primera alimentación de larvas de pez cebra junto con rotíferos en el mismo tanque.

La configuración de un sistema de producción de rotíferos agua salada continua para los laboratorios de pez cebra primero...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotifer Culture Infrastructure
100 L Culture Vessel	Aquaneering	Custom	Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve
5 Gallon Culture Bucket Kit	Reed Mariculture	CCS Starter Kit	Small volume culture vessel for small facilities
Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery
Mesh tube	Pentair Aquatic Ecosystems	RT444X	Mesh tube support for floss filter
Rotifer Floss	Reed Mariculture	Rotifer floss 12” x 42”	Particulate waste trap
Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD	Grainger	38M003	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture)	Coral Vue	SKU: IC-LQD-DSR	Metering pump with timer for dosing feed to rotifers
Silicone Tubing	Cole Parmer		Tubing for algae delivery to rotifer vessel
Rigid Clear Tubing " O.D.,36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for air delivery to algae paste
Rigid Clear Tubing O.D., 36”	Pentair Aquatic Ecosystems	16025	Rigid clear tubing for algae delivery
Rotifers
Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L	Reed Mariculture	Type L 5 million	Rotifer stock culture for system startup
Rotifer Feed
Sodium hydroxymethylsulfonate	Reed Mariculture	ClorAm-X® 1lb tub	Ammonia reducer for algae feed mix
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S25533B	pH buffer for algae feed mix
Microalgae concentrate	Reed Mariculture	Rotigrow Plus® 1 liter bag	Nutritionally optimized rotifer feed
RG Complete	Reed Mariculture	RG Complete 6 oz bottle	All in one microalgae based feed for small scale cultures
Water Preparation
Reef Crystals Reef Salt	That Fish Place	198210	Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).
Refractometer	Pentair Aquatic Ecosystems	SR6	measuring salinity
Rotifer Culture Equipment
Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns	Pentair Aquatic Ecosystems	BBPC20	Mesh screen for collecting rotifers
Scrub Pads	Pentair Aquatic Ecosystems	SCR-58	Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels
Scrub Brush
Bucket	Grainger Supply	43Y530	Graduated bucket for mixing culture water
Hatching Jar	Pentair Aquatic Ecosystems	J30	Storage of algae feed mix
Lugol’s Solution, Dilute	Fisher Scientific	S99481	Agent used to immobilize live rotifers for counting
Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid	Pentair Aquatic Eco-Systems	M415	Counting rotifers
Miscelleneous
Tea Strainer	Kitchenworks	971972	Used for collecting zebrafish embryos after spawning