Ex vivo de imágenes en vivo de metástasis pulmonar y su microambiente

Resumen

Se describe un método relativamente simple para ex vivo de imágenes en vivo de las interacciones célula-estroma tumoral dentro de la metástasis de pulmón, utilizando reporteros fluorescentes en ratones. Uso de hilado de disco microscopía confocal, esta técnica permite la visualización de células vivas durante al menos 4 horas y podría adaptarse para estudiar otras condiciones inflamatorias pulmonares.

Resumen

La metástasis es una causa importante de morbilidad y mortalidad relacionada con el cáncer. La metástasis es un proceso de múltiples etapas y debido a su complejidad, los procesos celulares y moleculares exactos que gobiernan la diseminación metastásica y el crecimiento siguen siendo difícil de alcanzar. Imágenes en vivo permite la visualización de las interacciones dinámicas y espaciales de las células y su microambiente. Los tumores sólidos metástasis comúnmente a los pulmones. Sin embargo, la localización anatómica de los pulmones plantea un reto a intravital de imágenes. Este protocolo proporciona un método relativamente sencillo y rápido para la ex vivo de imágenes en vivo de las interacciones dinámicas entre las células tumorales y su estroma circundante dentro de la metástasis pulmonar. Usando este método, la motilidad de las células cancerosas, así como las interacciones entre las células cancerosas y las células del estroma en su microambiente pueden ser visualizados en tiempo real durante varias horas. Mediante el uso de ratones transgénicos fluorescentes reportero, una línea de células fluorescentes, inyectable marcado con fluorescenciamoléculas y / o anticuerpos, múltiples componentes de la microambiente de pulmón pueden ser visualizados, tal como los vasos sanguíneos y las células inmunes. Para la imagen de los diferentes tipos de células, se ha utilizado un disco giratorio microscopio confocal que permite formación de imágenes continuo a largo plazo con la adquisición rápida de imágenes, de cuatro colores. películas a intervalos compilados a partir de imágenes recogidas a través de múltiples posiciones y planos focales muestran las interacciones entre metastásico en vivo y células inmunes durante al menos 4 horas. Esta técnica se puede utilizar además para probar la quimioterapia o la terapia dirigida. Además, este método podría ser adaptado para el estudio de otras patologías relacionadas con los pulmones que pueden afectar el microambiente de pulmón.

Introducción

The deadliest aspect of cancer is metastasis, which accounts for more than 90% of cancer-related morbidity and mortality¹. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular mechanisms that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. To metastasize, tumor cells in the primary tumor must detach from their neighboring cells and basement membrane, cross through the extracellular matrix, intravasate, travel via blood or lymphatic vessels, extravasate at the secondary site, and finally, survive and establish secondary tumors. In addition to the properties of the tumor cells, the contribution from the microenvironment, which includes the adjacent stroma along with the normal counterparts of the cancer cells, is crucial for the seeding and establishment of metastatic lesions².

Traditional methods to study metastatic seeding and growth examine static states, as tissues are excised and sectioned for histology. These data only generate a snapshot of this highly dynamic process. Although some useful information can be gained from these studies, the complicated process by which tumor and stromal cells interact during metastatic formation cannot be adequately assessed by these methods. Furthermore, it is not possible to gain insights into tumor or stromal cell migration patterns, which are important in establishing a colony at the distant site. In order to effectively study the metastatic process, it is essential to visualize various interactions between cancer cells and their microenvironment in a continuous manner and at real time.

The lung is a common site for metastases from solid tumors as breast, colorectal, pancreatic cancer, melanoma and sarcoma³. Intravital imaging was previously used to study cell-cell interaction in various primary tumor and metastatic models^4,5. Methods of lung imaging in mice, including intravital imaging, lung section imaging, and an ex vivo pulmonary metastasis assay have been published^6–9. Intravital imaging of mouse lungs utilizes a thoracic suction window to stabilize the lungs⁶. This method is used for time-lapse imaging of the lung microcirculation and alveolar spaces. The anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. In order to access the lungs, the chest cavity must be opened which leads to loss of negative pressure and collapsed lungs. This method only allows the visualization of a small part of the lungs and is technically demanding; an unnecessary complication in studies that examine processes that are independent of blood flow. Moreover, this method also requires gating out movement caused by breathing. This is done either by collecting images between breaths or during post image acquisition analyses¹⁰. The alternative ex vivo lung section imaging provides stability and depth, and also prepares lung parenchyma for immunostaining⁷. However, the lengthy sectioning process leads to an extensive delay between the time of animal sacrifice and the start of the imaging session. Moreover, the process of sectioning a mouse lung causes considerable amount of cell death⁸, thus interfering with the quality and quantity of imaging samples and perhaps needlessly altering tumor-stroma interactions. In order to technically bridge between the methods of intravital imaging and lung section imaging, while exploiting the advantages of the two techniques, a relatively fast and easy method for ex vivo lung imaging was developed. This method was achieved by imaging of non-sectioned whole lung lobes. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos deben realizarse de conformidad con las directrices y regulaciones para el uso de animales vertebrados, incluyendo la aprobación previa de la Atención Institucional local de Animales y el empleo (IACUC).

1. Generación de metástasis pulmonar ex vivo para imágenes en vivo (transgénica o vena de la cola de inyección)

NOTA: Las metástasis pulmonares se pueden generar mediante la utilización de modelos de ratones genéticamente modificados o (iv) la inyección intravenosa de las células cancerosas.

1. Generar metástasis pulmonares para formación de imágenes mediante el cruce de un modelo de ratón del tumor mediante ingeniería genética en un ratón transgénicos reportero, por ejemplo, cruzar el cáncer de mama modelo de ratón, virus del tumor mamario terminal larga del antígeno media de repetición-polioma T de ratón (MMTV-PYMT) ¹¹ en ACTB-ECFP modelo de ratón ^12.
   NOTA: El modelo ACTB-ECFP expresa mayor proteína fluorescente cian (ECFP) bajo la β-acten el promotor de tal manera que todas las células emiten fluorescencia en el canal azul de la PPC. Sin embargo, las células cancerosas son, con mucho, el más destacado y aparecen como una masa de células ECFP-positivo bajo el microscopio. El modelo de ratón MMTV-PYMT desarrolla una enfermedad progresiva, en el que el crecimiento de tumor de mama está asociada con la difusión de las células cancerosas a la periferia, sobre todo a los pulmones. En los ratones MMTV-PYMT en la FVB / n de fondo, las micrometástasis se pueden observar alrededor de 10-11 semanas de edad. En general, estos avances a macrometástasis en alrededor de 14 semanas de ^{edad de 13 años.}
   O
2. Generar metástasis experimentales utilizando células primarias o líneas celulares singénicas. El uso en células tumorales primarias in vitro manipulado o líneas celulares (por ejemplo., La transducción), seguido de la inyección iv ^14.
   1. En resumen, en este protocolo, inyectar una proteína verde fluorescente (GFP) expresando (+) línea celular MMTV-PYMT en ratones fluorescentes reportero (ACTB-ECFP) o ratones de tipo salvaje. Entonces,visualizar estas células conocidas como células ^VO-15 utilizando el PYMT, canal verde GFP.
      NOTA: La línea celular original VO-PYMT se derivó en el Vanderbilt Ortopedia en Nashville, TN. VO significa Vanderbilt Ortopedia.
   2. Después de la inyección de 10 ⁶ células (en 200 l), observe la extravasación de células de cáncer de inmediato y hasta unas pocas horas después de la inyección; observar las micrometástasis entre 1-3 semanas después de la inyección y detectar macrometástasis 3 semanas después de la inyección ^{de 15.}
      NOTA: menos células se pueden inyectar para prolongar el tiempo de inyección para el crecimiento metastásico.

2. El etiquetado de los componentes de interés en el microambiente metastásico (transgénico y / o inyectables)

NOTA: El etiquetado se puede lograr por los ratones transgénicos y / o por varios inyectables. Asegúrese de utilizar diferentes colores fluorescentes para el etiquetado de los diversos tipos de células.

1. Los componentes Label del microambiente metastásico utilizando ratones transgénicos. Cruzar el modelo de tumor de ratón se ha mencionado anteriormente (por ejemplo., MMTV-PYMT x ACTB-ECFP) en un modelo de ratón transgénico en el que las células del estroma de interés son etiquetados por una proteína fluorescente que no es ECFP, por ejemplo., C-fms-EGFP ^4,16.
   NOTA: Además de la visualización de las células cancerosas en el canal de CFP, esto permite la visualización de las células mieloides en el canal de GFP ^4.
   Y / O
2. Etiqueta de diversos componentes del microambiente metastásico usando los inyectables en ratones reportero fluorescente transgénicos o (no fluorescentes) ratones de tipo salvaje.
   NOTA: Varios compuestos se puede inyectar para etiquetar diversos componentes del microambiente metastásico, por ejemplo, un anticuerpo Gr-1 AF647 conjugado se utiliza aquí para etiquetar los neutrófilos y se utilizan algunos monocitos ^{13 y} diferentes dextranos de peso molecularpara etiquetar los capilares pulmonares. Para la preparación de estos inyectables ver paso 4.

3. Preparación de Materiales antes de la disección

1. 2% de agarosa
   1. Pesar 0,2 g de agarosa y añadir a 10 ml 1 x PBS. Calentar la solución para disolver la agarosa. Agarosa se solidifica a temperatura ambiente, por lo que mantener en un baño de agua a 37 ° hasta su utilización para la inflación.
2. CO _{2 y} controlador de temperatura
   1. Compruebe _ddH2O en la cámara de humidificación. Vuelva a llenar cuando sea necesario. Introduzca la placa de configuración en la temperatura soporte de la placa etapa (cámara climática). Encienda el controlador _de CO2 y fijar CO ₂ al 5%. Asegúrese de que el caudal de aire se fija en 0,4 Nl / min.
   2. Abra el aire y CO _{2 válvulas.} Encienda el controlador de temperatura. Asegúrese de que la temperatura de la cámara climática y la tapa se fijan a 37 ° C.
   3. Liberar la presión del aire sobre el CO _{de 2 metros.} Verificar CO ₂ creciente, equilibration puede tardar hasta 30 minutos.
3. disco giratorio microscopio confocal
   NOTA: Los detalles de la configuración de microscopio se han descrito previamente ^4,17.
   1. Encienda el láser (láser de argón durante excitación de 488 nm y el de estado sólido de 405 nm, 561 nm y 640 nm láseres). Encienda el microscopio, la cámara, la unidad de control de disco giratorio, el AOTF, la unidad de control de láser y el controlador de la cámara.
   2. Abrir el obturador microscopio, encienda el equipo que ejecuta el microscopio y abrir el software.
4. Preparación de las herramientas y la plataforma de la disección.
   1. A su vez en el esterilizador de cuentas en caliente y se deja llegar a 250 ° C. Limpias 2 pares de tijeras quirúrgicas y pinzas con agua y jabón. Esterilizar las herramientas durante al menos 30 segundos. Deje que las herramientas se enfrían. Use una tapa de poliestireno como plataforma de disección. Se cubre con un trozo de remojo laboratorio.

4. Preparación de inyecciones

NOTA: Dependiendo de la vida media y la respuesta preferida, inyecte la etiqueta fluorescente anticuerpos y / o moléculas fluorescentes ya sea inmediatamente antes de su sacrificio de un animal o de un par de horas a días antes.

1. Para neutrófilos imagen Gr1-positivos y monocitos, preparar una jeringa con 7 l de anticuerpo de la Gr-1 AF647 conjugado (1 mg / ml) en 100 l de PBS estéril bajo el capó. Colocar una aguja 27 G ½ en la jeringa.
2. Para capilares pulmonares imagen, preparar una segunda y tercera jeringa con 100 l de o bien 70 kD rodamina conjugado con dextrano (4 mg / ml) o dextrano 10 kD AF647-conjugado (4 mg / ml). Coloque una aguja de 27 G ½ de las jeringas.
3. Inyectar el AF647-conjugado anticuerpo solución iv 5 horas antes de la escisión pulmones.
4. Inyectar una o ambas soluciones de dextrano iv inmediatamente anteriores a la escisión pulmones.

5. Preparación de los pulmones ex vivo para imágenes en vivo

NOTA: Trate de trabajar como estéril y cuidado posible para evitar problemas innecesarios de las células inmunes dentro de los pulmones.

1. Inyectar la intraperitoneal ratón (ip) con una sobredosis letal de anestésico permitido por el protocolo de los animales aprobado por el IACUC, por ejemplo., 1 ml de 2,5% Avertin. Espere a que el ratón para detener la respiración y ser completamente no responden a estímulos nocivos (trasera pizca de la pata).
   NOTA: La dislocación cervical y la eutanasia de dióxido de carbono deben evitarse ya que puede afectar negativamente a la viabilidad celular de pulmón.
2. Inmovilizar el ratón sobre una tabla de disección y esterilizar el ratón con etanol al 70%.
3. Con unas tijeras quirúrgicas para hacer primero una incisión epigástrico transversal a través de la piel, seguido de una incisión similar a través del peritoneo. Mantenga la placa de disección en posición vertical y cortar la aorta descendente, de modo que la sangre se acumula en el abdomen y no en la cavidad torácica.
4. Scortar una pequeña abertura en el diafragma para liberar el vacío. Corte a lo largo de la costilla 10 y 12 para cortar el diafragma y obtener acceso visual a los pulmones.
5. Use las tijeras quirúrgicas para cortar la piel hasta la tráquea a través de la caja torácica pero deja intacta la caja torácica. Se separa la piel de la caja torácica. Exponer la tráquea mediante la eliminación del tejido conectivo circundante, teniendo cuidado de no dañar la tráquea en sí (Figura 1A).
6. Cortar una pequeña abertura de aproximadamente 1 mm de diámetro en la tráquea expuesta paralelo a los anillos cartilaginosos, tan cerca de la laringe como sea posible (Figura 1B). Tenga cuidado de no cortar completamente a través de la tráquea.
7. Tome una aguja 20 G e inserte suavemente la aguja 4-5 mm en la tráquea sin ninguna fuerza contraria (Figura 1D). El extremo de la aguja debe ser visible a través de la tráquea (Figura 1C). El uso de fórceps para estabilizar la aguja en la tráquea. Como alternativa, una sutura puede ser atado aroUnd la tráquea para mantener la aguja en su lugar.
   NOTA: Mediante la inserción demasiado profunda, la carina puede ser traumatizada o sólo un lado de los pulmones puede ser inflado.
8. Llene una jeringa con 400 l de 37 ° C 2% de agarosa de baja temperatura de fusión (tomada directamente de un baño de temperatura constante). Asegúrese de que la tabla de disección está de pie y lentamente inculcar la agarosa caliente a través de la aguja en los pulmones, usar ~ 400 l para inflar los pulmones.
   NOTA: Vea los pulmones se inflan dentro de la caja torácica. No sobre-inflar el pulmón, ya que se rompa.
9. Una vez que los pulmones se inflan, llenando ~ ⅔ de la caja torácica, separar la jeringa y mantener la aguja en el interior de la tráquea para evitar cualquier agarosa de fugas.
10. Verter aproximadamente 50 ml de 20 ° C PBS más de los pulmones inflados para permitir que la agarosa en el interior de los pulmones para establecer y solidificar. extraer la aguja lentamente y cerrar la tráquea con una pinza para evitar cualquier no solidificado de agarosa se escape.
11. Exponer a los pulmones mediante la realización de una esternotomía y posteriormente extirpar los pulmones. Para la escisión de los pulmones, se aferran a la tráquea durante el corte a través de la tráquea por completo. Tire suavemente de la tráquea hacia arriba, cortar el tejido conectivo y el esófago mientras tira de los pulmones fuera de la cavidad del pecho hasta que los pulmones se separa del ratón (Figura 1E).
12. Sumergir los pulmones en caliente RPMI-1640 para lavar el exceso de sangre y separar suavemente los lóbulos mediante el uso de tijeras y pinzas para cortar bronquio principal los lóbulos 'en el hilio (Figura 1F).
13. Coloque los lóbulos, con la superficie plana hacia abajo para maximizar la superficie de formación de imágenes, en un pocillo de una placa de imagen de 24 pocillos (Figura 1G). Añadir 100 l de 37 ° C RPMI-1640 en la parte superior de los lóbulos. Coloque varias cubierta se desliza microscopio circular 15 mm en la parte superior de los lóbulos para evitar que se flotante.
14. Verter PBS caliente en los pozos de los alrededores para evitar que los medios de comunicación RPMI-1640 de EVAPperorando. Insertar la placa de 24 pocillos en la cámara climática equilibrada y mantener los lóbulos pulmonares a 37 ° C con aire y 5% de CO _2. Inserte la cámara climática en la platina del microscopio confocal.
    NOTA: Otras mezclas de gas (por ejemplo, _5% de O2, _5% de CO2 en _N2 para examinar el comportamiento de células en condiciones de hipoxia / oxígeno inferior) también podría ser considerado.

Figura 1. Protocolo para la preparación de los pulmones para imágenes en directo. (A) La exposición de la tráquea después de la preparación del ratón. (B) Pequeño recorte realizado en la tráquea expuesta paralelo a los anillos cartilaginosos. (C) 20 G aguja insertada 4-5 mm en la tráquea. (D) La instilación de 400 l 2% de baja temperatura de fusión de agarosa en los pulmones. (E) Inflpulmones ATED separados del ratón. (F) Los lóbulos separados después de la inflación. (G) lóbulos colocado en un pocillo de una placa de imagen de 24 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Adquisición y Análisis de Imágenes

NOTA: Las imágenes pueden ser adquiridas con una variedad de hilado disco microscopio confocal con el apoyo de varios programas de software. En este protocolo, ya sea μManager con un disco giratorio microscopio confocal por encargo o Zen con un microscopio confocal de girar el disco disponible en el mercado se utiliza para la adquisición de la imagen, mientras que Imaris se utiliza para la edición y el análisis de la película.

1. Adquirir imágenes con μManager. Un detallado paso a paso el protocolo para la adquisición de imágenes utilizando el software μManager se ha descrito previamente ^18.
   O
2. adquirir imágenesutilizando software de análisis de imágenes como Zen (ver Figura S1).
   1. Haga clic en la pestaña 'Localiza', y selecciona objetivo (10x o 20x) en la herramienta 'Light Path' (Figura S1 A, cuadro rojo). Posteriormente, haga clic en 'Ojos - DAPI' para mirar el canal de PPC a través del ocular (Figura S1 A, caja azul). Localizar la muestra manualmente con el microscopio. Haga clic en 'Todo Off'after el tejido es el centro del campo de visión.
   2. Haga clic en la pestaña 'Adquisición' para ajustar todos los parámetros de adquisición de imágenes.
   3. En la herramienta de "canales", haga clic en el botón '+' (Figura S1 B, cuadro rojo). Un menú emergente aparece y buscar el colorante (s) presente en la muestra en el "tinte de base de datos '(Figura S1B). Seleccione el tinte y haga clic en "Añadir".
      NOTA: El programa seleccionará todos los filtros sean optimizados. Un colorante puede ser eliminadoseleccionándolo siguió haciendo clic en el botón de la papelera (Figura S1B, caja amarilla).
   4. En el menú 'Modo de adquisición', set 'Binning' de 5x5. Haga doble clic en ECFP en el menú de canales para seleccionarlo. Bajar la potencia del láser y el 20% por lo que la muestra no se blanquea al configurar los parámetros de adquisición de imágenes.
   5. Marque la casilla 'Azulejos' en la sección 'Experimento Administrador' y la herramienta azulejos aparece en el 'Multidimensional Adquisición' grupo de herramientas (Figura S1C). Haga clic en el botón "Configuración avanzada" para ver la imagen en directo de la cámara. Haga clic en el botón "Añadir" en la sección "Posiciones" para añadir 4 a 6 posiciones para el experimento. Para eliminar una posición, seleccione esa posición y haga clic en el botón de la papelera.
   6. En el grupo de herramientas 'Adquisición de parámetros', abra la herramienta 'estrategia de enfoque' y seleccione 'Absolute fijo Z-position 'de la lista desplegable.
   7. Marque la casilla Z-Stack en la sección "Experimento Administrador 'y la herramienta Z-pila aparece en el grupo de la herramienta' Multidimensional Adquisición '(Figura S1D). Haga doble clic en una de las posiciones en la sección "posiciones" y pulse "en directo". establecer manualmente primero y establecer última posición del campo de la imagen. Ajuste el intervalo en 4 micras.
      NOTA: El programa determinará el número de cortes para la gama elegida y el intervalo. Idealmente, 5-7 rebanadas son convenientes para permitir suficiente la visualización y la rápida adquisición de imágenes.
   8. Marque la casilla 'Time Series' en la sección 'Experimento Administrador'. De ajuste deseado "duración" y los tiempos de "intervalo" en la herramienta 'Time Series' que apareció en el 'Multidimensional Adquisición' grupo de herramientas (Figura S1E).
   9. En el 'AcquisiModo de la 'menú, establece' Binning 'de 2x2. Haga doble clic en un fluoróforo en el menú de canales para seleccionarlo y aumentar la potencia del láser a 100%. Pulse 'Live' y ajustar el "tiempo de exposición". Repita este procedimiento para cada fluoróforo.
   10. Marque la casilla "Activar Auto Guardar '. Seleccione una carpeta y escriba el nombre del archivo. Todas las imágenes obtenidas se guardarán automáticamente en esta carpeta.
   11. Haga clic en "Start Experimento 'en la sección' Experimento Administrador 'para iniciar la adquisición de imágenes.
3. Después de la adquisición de imágenes, compilar los datos en bruto en el software Imaris. Convertir imágenes para .ims archivos y se pueden hacer ajustes. Un detallado paso a paso el protocolo para la conversión de archivos, haciendo ajustes y Almacenamiento de películas utilizando Imaris se ha descrito previamente ^18.
4. Al guardar la película, establecer el "Frame Rate" 5 fotogramas por segundo (fps).

Resultados

Usando el hilado disco microscopía confocal, diversos sistemas modelo del ratón y los inyectables, el microambiente metastásico puede ser visualizado y seguimiento en el tiempo. El uso de un MMTV-PYMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP triple modelo de ratón transgénico, diferentes componentes celulares están marcadas fluorescentemente (Figura 2A, Película 1). La estructura típica del parénquima pulmonar puede ser visualizado en el canal de CFP ya que todas las c?...

Discusión

Este manuscrito describe un método detallado para la ex vivo de imágenes en vivo de metástasis de pulmón en modelos de ratón de la metástasis. Este protocolo de formación de imágenes proporciona una visualización directa de las interacciones célula-tumor del estroma dinámicas y espaciales dentro del microambiente de pulmón. Es un método relativamente fácil y rápido que permite obtener imágenes fiables de metástasis de pulmón durante al menos 4 horas. Películas adquiridos a partir de estos exp...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MMTV-PyMT/FVB mice	Jackson Laboratory	2374	Female mice
ACTB-ECFP/FVB mice	UCSF Werb lab		Female mice
c-fms-EGFP/FVB mice	UCSF Werb lab		Female mice
FVB mice	Jackson Laboratory	1800	Female mice
GFP+ VO-PyMT cells	UCSF Werb lab
70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated	Invitrogen	D1818	Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal.
10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated	Invitrogen	D22914	Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal.
Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647	UCSF Monoclonal antibody core		Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal.
Anesthetic			Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia
1X PBS	UCSF cell culture facility
PBS, USP sterile	Amresco INC	K813-500ML	Ultra pure grade for i.v. injection
Styrofoam platform			Will be used as dissection board
Fine scissors sharp	Fine Science Tools	14060-11
Forceps	Roboz Surgical Store	RS-5135
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn ON 30min before use
Air	UCSF
Oxygen	UCSF
Carbon dioxide	UCSF
1 mL syringe without needle	BD	309659
27 G x 1/2 needle	BD	305109	for i.v. injection
20 G x 1 needle, short bevel	BD	305178
Low-melting-temperature agarose	Lonza	50111	To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation.
RPMI-1640 medium without phenol red	Life Technologies	11835-030
24 well Imaging plate	E&K scientific	EK-42892
Glass cover slides, 15 mm	Fisher Scientific	22-031-144
Digital CO2 and temperature controller	Okolab	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
Climate chamber	Okolab		http://www.oko-lab.com
Cell Observer spinning disk confocal microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Inverted microscope	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
ICCD camera	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal scan-head	Yokogawa Corporation	CSU-10b
Imaris	Bitplane
mManager	Vale lab, UCSF		Open-source software